Nghiên cứu sàng lọc vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose và đối kháng một số bệnh hại cây trồng

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp cho phép tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập Viện Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt năm học tập trƣờng Với vốn kiến thức đƣợc tiếp thu q trình học khơng tảng cho trình nghiên cứu đề tài tốt nghiệp mà hành trang quý báu để em bƣớc vào đời cách vững tự tin Em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Thị Thu Hằng – giảng viên Viện CNSH Lâm nghiệp tận tình định hƣớng hƣớng dẫn em suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, em xin kính chúc thầy, giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trƣờng Đại học Lâm nghiệp dồi sức khỏe, đạt đƣợc nhiều thành công sống nhƣ nghiệp nghiên cứu giảng dạy Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Lê Thị Phƣợng i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC CÁC BẢNG vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan cellulose vi sinh vật phân giải cellulose 1.1.1 Giới thiệu cellulose 1.1.2 Vi sinh vật phân giải cellulose 1.1.3 Quá trình phân giải cellulose hệ enzyme thủy phân cellulose vi sinh vật 1.1.4 Ứng dụng vi sinh vật thủy phân cellulose 1.2 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật phân giải cellulose 1.2.1 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 1.2.2 Tình hình nghiên cứu giới 11 1.3 Cơ chế tác động đến vi sinh vật gây bệnh vi sinh vật có khả đối kháng 11 1.4 Ý nghĩa việc sử dụng vi sinh vật có khả đối kháng phịng trừ nấm bệnh hại trồng 12 1.5 Giới thiệu nấm Fusarium 13 CHƢƠNG 2.MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Vật liệu nghiên cứu 15 2.4 Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật 17 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.5.1 Phân lập vi sinh vật có khả phân giải cellulose 18 ii 2.5.2 Phƣơng pháp quan sát hình dạng tế bào vi sinh vật 19 2.5.3 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính cellulase mạnh 20 2.5.4.Xác định hoạt tính amylase 27 2.5.5 Xác định khả đối kháng nấm Fusarium oxysporum chủng vi sinh vật tuyển chọn 28 2.5.6.Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê 29 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết phân lập chủng vi sinh vật có khả phân giải cellulose 30 3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính cellulase 35 3.2.1 Xác định hoạt tính cellulase ngoại bào phƣơng pháp đo đƣờng kính vịng phân giải 35 3.2.2 Xác định khả phân giải cellulose phƣơng pháp đo nồng độ đƣờng khử với thuốc thử DNS 37 3.2.3 Xác định hoạt tính amylase ngoại bào chủng vi khuẩn tuyển chọn 38 3.3 Xác định hình dạng tế bào chủng có hoạt tính cellulose mạnh đƣợc tuyển chọn 39 3.4 Xác định khả đối kháng nấm Fusarium oxysporum chủng vi khuẩn tuyển chọn 40 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 4.1 Kết luận 42 4.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BG -glucanase CMC Carboxyl methylcellulose DNS Acid dinitro-salicylic ĐC Đối chứng OD Optical density- mật độ quang µl microlit g/l Gram/lit µm Micromet p.ứ Phản ứng Vsv Vi sinh vật g Gam iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh chiều hợp chất cao phân tử cellulose Hình1.2 Các mắt xích D-glucose phân tử cellulose Hình 1.3 Chuỗi phản ứng phân giải cellulose thành glucose thực hệ enzyme cellulase Hình 2.1 Hình ảnh khuẩn lạc bào tử nấm Fusarium oxysporum 15 Hình 2.2 Sự tƣơng quan nồng độ glucose giá trị 23 Hình 3.1 Hoạt tính phân giải CMC số chủng vi sinh vật 36 Hình 3.2 Phản ứng xác định lƣợng đƣờng khử phƣơng pháp DNS 38 Hình 3.3 Khả sinh tổng hợp amylase chủng tuyển chọn 39 Hình 3.4 Hình dạng tế bào chủng vi khuẩn đƣợc chọn 40 Hình 3.5 Hoạt tính đối kháng nấm Fusarium oxysporum chủng vi khuẩn 41 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Danh sách môi trƣờng sử dụng thành phần 17 Bảng 2.2 Kết đo nm tƣơng ứng với nồng độ đƣờng glucose khác 22 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn đƣợc phân lập 31 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng nấm đƣợc phân lập 34 Bảng 3.3 Hoạt tính cellulase ngoại bào chủng vi sinh vật 35 Bảng 3.4 Xác định hoạt tính cellulase chủng vi sinh vật thuốc thử DNS 37 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Trong sản xuất nông nghiệp nay, việc lạm dụng loại phân bón thuốc trừ sâu hoá học bảo vệ thực vật nhằm tăng sản lƣợng nông nghiệp từ lâu phổ biến Việt Nam với chủng loại thuốc bảo vệ thực vật đa dạng, bên cạnh việc luân canh trồng đƣợc trọng diện tích đất nơng nghiệp hạn hẹp Đó ngun nhân dẫn đến đất canh tác bị bạc màu nhanh chóng, nhiều nguồn bệnh hại tồn lâu dài đất khó phịng trừ Trong việc sử dụng biện pháp hóa học phòng trừ bệnh hại hiệu thƣờng thấp, giá thành đắt, ảnh hƣởng không nhỏ đến môi trƣờng sinh thái, đến hệ vi sinh vật đối kháng côn trùng có ích Để khắc phục bệnh ngồi sử dụng giống có khả kháng bệnh kết hợp với thuốc bảo vệ thực vật chế phẩm phân bón vi sinh chứa nhóm vi sinh vật hữu ích đƣợc khuyến khích sử dụng Phân bón vi sinh sản phẩm chứa vi sinh vật sống đƣợc tuyển chọn với mật độ phù hợp, có khả chuyển hóa chất dinh dƣỡng khó tan thành dạng hòa tan (phân giải cellulose) đất để trồng sử dụng hay sinh số chất ức chế vi sinh vật gây bệnh đất, nâng cao phát triển suất chất lƣợng sản phẩm Ngồi q trình tăng cƣờng sử dụng thuốc hóa học tạo chủng vi sinh vật kháng thuốc Mặt khác có nhiều tác nhân gây bệnh làm giảm khả chống chịu bệnh giống trồng Do đó, việc thƣờng xuyên phân lập chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng mạnh cần thiết, chủng đối tƣợng cho việc phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật vừa có khả đối kháng cao với chúng vừa cạnh tranh tốt với vi sinh vật gây bệnh trồng để sản xuất chế phẩm vi sinh, góp phần nâng cao suất, chất lƣợng nơng sản, giảm thiệt hại kinh tế cho ngƣời nông dân xã hội việc làm có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài “Nghiên cứu sàng lọc vi sinh vật có khả phân giải cellulose đối kháng với nấm bệnh hại trồng” CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan cellulose vi sinh vật phân giải cellulose 1.1.1 Giới thiệu cellulose Cellulose thành phần chủ yếu màng tế bào thực vật Cellulose có chứa nhiều sợi (95%), sợi lanh (71%), sợi đay (71%) Ngồi ra, cịn có gỗ, thực vật dƣới nƣớc (tảo, rong…), sản phẩm sơ cấp trình quang hợp thực vật nguồn nguyên liệu tái tạo lớn trái đất Hình 1.1 Hình ảnh chiều hợp chất cao phân tử cellulose (Màu nâu -carbon, màu đỏ - oxy, màu trắng - hidro) Cellulose hợp chất cao phân tử, đƣợc cấu tạo từ liên kết, mắt xích β-D-glucoside, có cơng thức cấu tạo (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n, n (độ trùng hợp) nằm khoảng 5000-14000 Cellulose thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với thành phần khác nhƣ hemi-cellulose, pectin lignin tạo thành phức hợp bền vững Tính chất hóa học cellulose Cellulose cấu tạo dạng sợi song song, có cấu trúc phân tử polymer mạch thẳng, đơn vị disaccharide gọi cellobiose Cellobiose có cấu trúc từ phân tử D–glucose Cấu trúc bậc bậc cellulose phức tạp, tạo thành cấu trúc dạng lớp gắn với lực liên kết hydro trùng hợp nhiều lần nên bền vững, ngồi cịn có lực Van der Waals tạo mạng lƣới gồm sợi song song đan chéo có độ bền cao Trong tự nhiên, nhƣ khơng có tác động phân hủy enzym sợi cellulose bền (cellulose tự nhiên bị thuỷ phân hoàn toàn cho sản phẩm cuối D-glucose) Hình1.2 Các mắt xích D-glucose phân tử cellulose 1.1.2 Vi sinh vật phân giải cellulose Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có hoạt tính cellulase nên có khả phân giải cellulose vô phong phú bao gồm chủ yếu vi sinh vật thuộc nhóm nấm vi khuẩn Nấm sợi Trong nhiều loại vi sinh vật có khả tổng hợp cellulase nấm sợi thuộc nhóm có khả tổng hợp cellulase mạnh Chúng vi sinh vật thuộc nhóm hạ đẳng, khơng có diệp lục, chúng chủ yếu sống hoại sinh đất tiết môi trƣờng lƣợng lớn enzyme chuyển hoá tàn dƣ 3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính cellulase 3.2.1 Xác định hoạt tính cellulase ngoại bào phương pháp đo đường kính vịng phân giải Tiến hành nuôi cấy chủng vi sinh vật thử hoạt tính mơi trƣờng CMC 1%, sử dụng thuốc thử conggo red 1% Bảng 3.3 Hoạt tính cellulase ngoại bào chủng vi sinh vật Đƣờng kính STT Kí hiệu vòng phân giải chủng CMC 1% VSV D–d Đƣờng kính vịng STT Kí hiệu phân giải CMC chủng 1% VSV D-d (mm) (mm) K1 14 B5 24 K2 12 15 B6 15 K3 22 16 B7 14 K4 27 17 B8 K5 13 18 B9 14 K6 19 B10 16 K7 11 20 N1 18 K8 15 21 N2 13 K9 11 22 N3 17 10 B1 25 23 N4 14 11 B2 26 24 N5 18 12 B3 15 25 N6 20 13 B4 14 26 N7 19 Ghi chú: D : đƣờng kính vịng phân giải, d = 8mm: đƣờng kính lỗ thạch 35 Hình 3.1 Hoạt tính phân giải CMC số chủng vi sinh vật Kết Bảng 3.3 Hình 3.1 cho thấy số 26 chủng VSV (19 chủng vi khuẩn,7 chủng nấm) có khả sinh trƣởng phát triển môi trƣờng chứa nguồn cacbon CMC 1%, có chủng có hoạt tính cellulase mạnh, với đƣờng kính vịng phân giải chất CMC 1% lần lƣợt 27 mm (K4), 26 mm (B2) 25 mm (B1), 24 mm (B5) So sánh với nghiên cứu khác nƣớc nhƣ Lê Thị Hồng Nga (2005) [9], Trịnh Đình Khá (2007) [29] Nguyễn Lê Anh Đào (2013) [20] chủng mà chúng tơi thu đƣợc có hoạt tính cellulase cao Do chúng tơi chọn chủng để phục vụ cho nghiên cứu 36 3.2.2 Xác định khả phân giải cellulose phương pháp đo nồng độ đường khử với thuốc thử DNS Sau xác định đƣợc đƣờng kính vịng phân giải chọn chủng có khả phân giải mạnh nhất, tiến hành xác định hoạt tính DNS, kết đƣợc trình bày bảng 3.4 hình 3.2 Bảng 3.4 Xác định hoạt tính cellulase chủng vi sinh vật thuốc thử DNS Kí Đƣờng khử hiệu VSV sinh chủng VSV (mg/ml) K1 0,122 K2 Đƣờng khử Đƣờng khử Kí Đƣờng khử hiệu VSV sinh chủng VSV (mg/ml) 0,210 B5 0,428 0,535 0,306 0,359 B6 0,345 0,436 K3 0,385 0,496 B7 0,314 0,392 K4 0,525 0,650 B8 0,225 0,317 K5 0,278 0,393 B9 0,298 0,370 K6 0,081 0,158 B10 0,369 0,458 K7 0,259 0,380 N1 0,383 0,473 K8 0,398 0,480 N2 0,223 0,304 K9 0,248 0,336 N3 0,377 0,463 B1 0,439 0,577 N4 0,347 0,390 B2 0,456 0,599 N5 0,397 0,489 B3 0,331 0,411 N6 0,405 0,475 B4 0,325 0,412 N7 0,392 0,491 phản ứng enzyme tạo thành (mg/ml) 37 phản ứng enzyme tạo thành (mg/ml) A Hàm lƣợng đƣờng khử có sẵn dịch enzyme thơ chƣa bổ sung chất CMC B Hàm lƣợng đƣờng khử tạo cho dịch enzyme thô phân giải chất CMC Hình 3.2 Phản ứng xác định lƣợng đƣờng khử phƣơng pháp DNS Từ đây, ta tin tƣởng chọn lọc chủng K4, B2, B1 B5 có khả sinh cellulase mạnh 3.2.3 Xác định hoạt tính amylase ngoại bào chủng vi khuẩn tuyển chọn Sau xác định đƣợc chủng vi sinh vật có hoạt tính cellulose mạnh, ta tiến hành kiểm tra chủng có hệ enzyme amylase hay khơng Q trình phân giải tinh bột mơi trƣờng, nhuộm lugol, vịng hoạt tính chuyển từ màu xanh tím sang khơng màu 38 Hình 3.3 Khả sinh tổng hợp amylase chủng tuyển chọn Sau 48h ni cấy, từ hình Hình 3.5 cho thấy có phân giải tinh bột tạo vòng tròn sáng rõ tên bề mặt thạch CMC Vòng phân giải tinh bột rõ nét bề mặt môi trƣờng thể khả sinh tổng hợp enzyme amylase cao chủng Kết đƣợc thể rõ ràng so sánh với mẫu đối chứng sử dụng nƣớc cất khơng có tạo thành vịng phân giải 3.3 Xác định hình dạng tế bào chủng có hoạt tính cellulose mạnh đƣợc tuyển chọn Tiến hành làm tiêu quan sát hình dạng tế bào chủng đƣợc tuyển chọn dƣới kính hiển vi quang học vật kính 100X Kết quan sát đƣợc thể Hình 3.3 39 Hình 3.4 Hình dạng tế bào chủng vi khuẩn đƣợc chọn Cả chủng vi khuẩn B2, B1 B5 thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+), tế bào hình que hình que, tồn riêng lẻ chuỗi Chủng K4: thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+), có dạng hình cầu, tồn riêng lẻ chuỗi 3.4 Xác định khả đối kháng nấm Fusarium oxysporum chủng vi khuẩn tuyển chọn Tiến hành thử hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối nõn thân rễ Đục lỗ thạch nhỏ 50µ dịch khuẩn vào mơi trƣờng PDA cấy nấm Vòng đối kháng xuất xung quanh lỗ thạch môi trƣờng hơn, nấm gây bệnh không phát triển đƣợc Bảng 3.5 Kết thử hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn với chủng nấm gây bệnh Fusarium oxysporum 40 Chủng vi sinh vật Đƣờng kính vịng đối kháng D-d (mm) Fusarium oxysporum B1 29 0,15 B2 0,01 B5 16 0,3 K4 0,4 Một số hình ảnh kháng nấm chủng Hình 3.5 Hoạt tính đối kháng nấm Fusarium oxysporum chủng vi khuẩn Chủng B5 B1 có đƣờng kính vòng đối kháng lớn so với chủng lại với nấm Fusarium oxysporum lần lƣợt với đƣờng kính vòng đối kháng 29 mm 16 mm 41 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã phân lập đƣợc 19 chủng vi khuẩn chủng nấm có khả phân giải cellulose với hoạt tính từ yếu đến mạnh - Đã tuyển chọn đƣợc chủng vi sinh vật ký hiệu K4, B2, B1, B5 có hoạt tính cellulase ngoại bào mạnh nhất, với đƣờng kính vịng phân giải chất CMC 1% chủng lần lƣợt 27 mm, 26 mm, 25 mm, 24 mm; hàm lƣợng đƣờng khử vi sinh vật sinh enzyme tạo thành lần lƣợt 0,525 mg/ml + 0,650 mg/ml (K4); 0,456 mg/ml +0,599 mg/ml (B2) 0,439 mg/ml + 0,577 mg/ml (B1); 0,428 mg/ml + 0,535 mg/ml (B5) - Đã xác định đƣợc hình dạng tế bào chủng K4, B2, B1, B5 có hoạt tính cellulase mạnh - Đã tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn ký hiệu B1 B5 có khả ức chế sinh trƣởng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thực vật với đƣờng kính vịng đối kháng nấm bệnh đạt 29 mm (chủng B1) 16 mm (chủng B5) - Cả chủng vi khuẩn K4, B2, B1, B5 khả sinh tổng hợp cellulase có khả sinh tổng hợp amylase ngoại bào với đƣờng kính vịng phân giải chất tinh bột 1% chủng lần lƣợt 33 mm, 33 mm, 27 mm, 28 mm 4.2 Kiến nghị - Khảo sát điều kiện nuôi cấy nhƣ: môi trƣờng (thành phần khoáng, dinh dƣỡng, loại chất hàm lƣợng,…), tốc độ lắc,… tối ƣu cho phát triển hoạt tính đối kháng dịng vi khuẩn vừa phân lập - Khảo sát thêm khả đối kháng số chủng vi khuẩn, nấm phân lập với số nấm gây bệnh trồng khác 42 - Kết hợp thêm số phƣơng pháp sinh hóa sinh học phân tử để định danh dịng có khả đối kháng nấm gây bệnh - Nhà Trƣờng Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp hỗ trợ kinh phí để đề tài đƣợc tiến hành tiếp tục 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Cao Cƣờng, Nguyễn Đức Lƣợng (2003) Khảo sát trình cảm ứng enzyme chitinase cellulase Trichoderma harzianum ảnh hưởng hai enzyme lên nấm bệnh Sclerotium rolfsii, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội tr 321324 [2] Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sấm (2004), Công nghệ Enzyme, NXB Khoa học Kỹ thuật [3] Hồng Quốc Khánh, Ngơ Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003), Khả sinh tổng hợp đặc điểm cellulose Aspergillus niger RNNL- 363, Báo cáo khoa học, Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 304 – 307 [4] Lại Văn Ê, 2003 Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng phòng trừ sinh học nấm Fusarium oxysporum Rhizoctonia solani Kühn gây bệnh chết vải (Gossypium hirsutum L.) Luận văn thạc sĩ, khoa Nông Nghiệp, Đại Học Cần Thơ [5] Lê Nhƣ Kiểu, 2008 Vai trò vi sinh vật chăm sóc trồng cải tạo đất Tạp chí khoa học đất, số 30, tr 137-141 [6] Lê Thị Hoàng Yến, Đào Thị Lƣơng, Nguyễn Anh Tuấn Dƣơng Văn Hợp (2013) Sơ nghiên cứu đa dạng loài chi Fusarium phân lập từ đất thu thập rừng Quốc gia từ bị bệnh Việt Nam Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội [7] Lê Thị Hồng Mai, 1989 Sinh tổng hợp số đặc tính cellulase (typ CMC-aza).Luận án phó tiến sĩ sinh học [8] Lê Văn Nhƣơng cộng sự, 1998 Nghiên cứu áp dụng công nghệ sinh học sản xuất phân bón vi sinh – hữu từ nguồn phế thải hữu rắn (Báo cáo tổng kết đề tài cấp nhà nuớc, MS: KHCN-02-04) – Hà Nội [9] Lê Thị Hồng Nga (2005) Nghiên cứu khả sinh enzyme cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, NXB Giáo dục [10] Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc (1999) Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose cao để nâng cao chất lượng phân hủy rác thải sinh hoạt nông nghiệp Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 546-551 [11] Nguyễn Văn Hạnh, (2009), Các phản ứng sinh hóa [12] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 2000 Vi Sinh Vật Học Nxb Giáo Dục [13] Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzyme, NXB Khoa học Kỹ thuật [14] Nguyễn Thế Trang, Trần Thanh Thùy, Lê Thị Thanh Xuân, Nguyễn Thị Hồng Hà Lê Anh Thƣ (2) (2013) Ảnh hưởng số yếu tố lên sinh trưởng tổng hợp cellulose chủng Bacillus coagulans BL04 phân lập từ biển Việt Nam Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam trang 607 – 611 [15] Nguyễn Lê Anh Đào, Đỗ Thị Thanh Hƣơng, Trần Nhân Dũng Bùi Thị Minh Diệu (2013) Phân lập tuyển chọn dịng nấm mốc Aspergillus spp có khả sinh tổng hợp cellulose.Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam trang 104 – 108 [16] Nguyễn Xuân Thành (2003) Giáo trình Cơng nghệ vi sinh vật sản xuất nơng nghiệp xử lý ô nhiễm môi trường NXB Nông nghiệp [17] Nguyễn Văn Tuấn (2009), Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học, Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus Awamori sinh tổng hợp Endo- -1,4- Glucanase đánh giá tính chất lý hóa Endo- -1,4-Glucanase, NXB Đại học Thái Nguyên [18] Nguyễn Kim Vân cộng ( 2010) Kết nghiên cứu chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh hại có nguồn gốc đất miền Bắc Việt Nam p 449-457 Hội nghị khoa học cơng nghệ tồn quốc bảo vệ thực vật lần thứ NXB Khoa học tự nhiên công nghệ [19] Nguyễn Hoàng Anh*, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Vĩnh Hoàng (2017), Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn bacillus spp từ cỏ bị có khả sinh enzyme β-glucanase bước đầu xác định đặc tính enzyme, Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2017, tập 15, số 1: 85-91 [20] Nguyễn Lê Anh Đào cộng (2013) Phân lập tuyển chọn dòng nấm mốc Aspergillus spp Có khả sinh tổng hợp cellulase Trƣờng Đại học Cần Thơ [21] Phạm Quang Thu, Trần Thanh Trăng (2003), Phân lập tuyển chọn vi khuẩn đối kháng với nấm gây bệnh vùng rễ thông, Thông tin khoa học kĩ thuật lâm nghiệp 3, tr 2- 5.n [22] Phạm Thị Trân Châu (Chủ biên),(năm 2005) Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Trƣờng, Thực hành hóa sinh, NXB Giáo dục [23] Phạm Văn Toản (2003), Khả sử dụng hỗn hợp vi sinh vật làm phân bón chức cho số trồng nơng nghiệp, công nghiệp lâm nghiệp, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, trang 127 - 131 [24] Phạm Văn Toản, Trƣơng Hợp Tác (2004), Phân bón vi sinh vật nông nghiệp, NXB Nông nghiệp [25] Phạm Văn Toản (2005), Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật làm phân bón, NXB Nơng nghiệp [26]Trƣơng Phƣớc Thiên Hồng (2007), Khảo sát hoạt tính số enzyme thủy phân amylase, cellulase, petinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ miền đông Nam bộ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Tp Hồ Chí Minh [27] Trịnh Đình Khá (2006) Tuyển chọn, ni cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp cellulose đánh giá tính chất lý hóa cellulose, Luận văn thác sĩ khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tƣ nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội [28] ThS Tôn Nữ Minh Nguyệt (2012) - Trƣờng ĐHBK TPHCM Phương pháp xác định đường khử đường tổng [29] Trịnh Đình Khá cộng ( 2007).Phân lập tuyển chọn số chủng vi sinh vật có khả sinh enzyme cellulase từ rong giấy Hòn Chồng - Nha Trang, NXB Giáo dục [30] Vũ Triệu Mân, Lê Lƣơng Tề (1998) Bệnh nông nghiệp p 21-69 NXB Nông nghiệp Tài liệu tiếng anh [31] A Hammed, T Keshavarz, C.S Evan (1999), Effect of dissolved oxygen tension and pH on the production of extracellular protease from a new isolate of Bacillus subtilis K2, for use in leather processing, J Chem Technol Biotechnol 74 [32] Burgess L W, Summerell B A., S Bullock, Gott K P and Backhouse D (1994) Fusarium research 3rd edition University of Sydney [33] H Outtrup, T.S Jorgensen ST, The importance of Bacillus species in the production of industrial enzymes In: Berkeley R, Heyndrickx M, Logan N, De Vos P (eds), Applications and systematics of Bacillus and relatives, Blackwell publishing, UK, 2002, pp 206-218 [34] Muhammad S and Amusa N A (2003) In-vitro inhibition of growth of some seedling blingt inducing pathogens by compost-inhabiting microbes African Journal Biotechnology Vol (6) pp: 161 – 16 [35] M Schallmey, A Singh, P.O.Ward (2004), Developments in the use of Bacillus species for industrial production, Can J Microbiol 50 [36] Nelson P.E., Tuossoun T A and Cook R J E (1981) Fusarium: Diseases, Biology and Taxonomy The Pennsylvania state University Press, University Part and London [37] Shengewei Huang, Ping Sheng and Hongyu Zhang (2012) Isolation and Identification of Cellulolytic Bacteria from the Gut of Holtrichia parallela Larvaar (Coleoptera: Scarabaeidae) [38] Varsha Goyal, Arpana Mittal, Anish Kumari Bhuwal, Gulab Singh, Anita Yadav, and Neeraj Kumar (2014) AggarwalParametric Optimization of Cultural Conditions for Carboxymethyl Cellulase Production Using Pretreated Rice Straw by Bacillus sp 313SI under Stationary and Shaking Conditions [39] Weiping Yang, Fanxu Meng, Jiayin Peng, Peng Han, Fang Fang, Li Ma, Binyun (năm 2014) solation and identification of a cellulolytic bacterium from the Tibetan pig’s intestine and inverstigation of its cellulase production [40] Ziad Jaradat, Ahlam Dawagreh, Qotaiba Ababneh, (Ismail Saadoun) (2008) Influence of Culture Conditions on Cellulase Production by Streptomyces Sp (Strain J2) Trang web http://www.nhandan.com.vn/kinhte/chuyen-lam-an/item/35729602-phanbon-sach-nong-nghiep-moi-ben-vung.html http://hueuni.edu.vn http://luanvan.co http://tai-lieu.com http://vi.wikipedia.org http://123.doc ... NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập sàng lọc đƣợc số chủng vi sinh vật có khả phân giải cellulose ức chế vi sinh vật kiểm định 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu phân lập chủng vi sinh. .. vi? ??c bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải vi? ??c tạo chế phẩm vi sinh có chứa vi sinh vật sinh cellulase đƣợc nghiên cứu sản xuất 1.2 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật phân giải. .. giàu nguồn gen vi sinh vật nông nghiệp với chủng giống vi sinh vật có hoạt lực phân giải cellulose vi sinh vật có khả đối kháng với số nấm gây bệnh hại trồng, thích ứng với điều kiện số tỉnh phía