Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 4 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng

Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 4 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng cung cấp đến học viên các kiến thức về chỉ thị phân tử, chỉ thị di truyền DNA, các loại chỉ thị phân tử DNA, chỉ thị phân tử dựa vào PCR,... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!

Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 KHÁI NIỆM CHỈ THỊ PHÂN TỬ CÁC LOẠI CHỈ THỊ PHÂN TỬ Chỉ thị phân tử TS Vũ Thúy Hằng Khái niệm  Chỉ thị dấu hiệu cho kiểu hình hay kiểu gen di truyền dễ dàng từ hệ sang hệ khác; Chỉ thị di truyền DNA gì?  Các loại thị:  Chỉ thị di truyền phân tử gen hay đoạn ADN sử dụng để phân biệt khác kiểu hình cá thể hay lồi - Chỉ thị hình thái: biến động hình thái đánh giá cá thể VD: màu hoa, thời gian sinh trưởng  Là biến động (hình thành đột biến hay thay đổi locut genom) - Chỉ thị sinh hóa: biến động kích cỡ điện tích protein, thành phần hóa học sản phẩm trao đổi chất (vd: đường…)  Chỉ thị di truyền trình tự ADN ngắn, trình tự thay đổi cặp ba zơ (SNP), hay trình tự dài minisatellites + Chỉ thị DNA: biến động trình tự DNA  Một thị phân tử DNA lý tưởng có tính chất sau: - Đa hình cao: xảy đồng thời cho tính trạng quần thể Chỉ thị di truyền = thị phân tử = thị ADN Chỉ thị đồng trội Gel configuration P1 P2 O1 O2 - Di truyền đồng trội: thị giúp phân biệt đồng hợp tử dị hợp tử; Đa hình -P1 : vạch (band) -P2 : vạch (đoạn có kích thước nhỏ hơn) -Con : dị hợp tử = có vạch P1, P2 -Con : đồng hợp tử với P1 - Xuất thường xun genome lồi - Phản ứng trung tính: trình tự DNA trung tính với điều kiện mơi trường biện pháp canh tác; Chỉ thị trội - Tiếp cận dễ dàng, có sẵn; Gel configuration - Sử dụng nhanh dễ; P1 - Có khả lặp lại cao - Dễ trao đổi số liệu với phòng nghiên cứu P2 O1 Đa hình -P1 : vạch O2 -P2 : khơng có vạch -Con : đồng hợp tử với P1 -Con 2: không biết: ???? https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Các loại thị phân tử DNA Có nhiều loại thị phân tử, thị phân nhóm dựa trên: 07/08/2017 Chỉ thị phân tử dựa phương pháp lai  Chỉ thị RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài đoạn DNA): - Xác định khác độ dài đoạn DNA - Hình thức di truyền: di truyền nhân, di truyền tế bào chất, di truyền nhân theo mẹ, di truyền tế bào chất từ mẹ, di truyền tế bào chất theo bố mẹ; - Yêu cầu DNA tinh - Thực DNA tổng số nhân - Hình thức hoạt động gen: thị trội, đồng trội; - Cắt phân tử DNA với số enzyme cắt - Tách đoạn cắt gel agarose - Chuyển đoạn cắt DNA từ agarose sang hệ thống lọc Sothern blotting (DNA dạng mạch đơn) - Phát đoạn DNA lai acid nucleotit với thị thăm dò đánh dấu phóng xạ; - Soi autodiography để xác định - Phương pháp phân tích: dựa lai, thị dựa PCR Các bước RFLP  Các bước: Ưu nhược điểm RFLP • Ưu điểm • Nhược điểm – Có thể lặp lại – Đồng trội – Đơn giản – Tốn thời gian – Đắt – Sử dụng đánh dấu phóng xạ Chỉ thị phân tử dựa vào PCR Có nhiều phương pháp, phương pháp khác dựa kĩ thuật PCR sử dụng mồi để khuyếch đại:  Mồi PCR thiết kế khơng dựa thơng tin trình tự  Mồi PCR thiết kế để khuếch đại đoạn DNA biết trình tự  Các bước gồm: Một số thị dựa PCR RAPD (random amplified polymorphic DNA) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Microsatellites (SSR) Trình tự gen (SNPs) - Chọn mồi (primers) - Thực phản ứng PCR - Chạy điện di xác định vạch ứng với có mặt sản phẩm PCR (score vạch) https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 RAPD (William et al., 1990) RAPD thị dựa trình tự ngẫu nhiên khuếch đại thơng qua sử dụng mồi ngẫu nhiên Ưu, nhược điểm RAPD Ưu điểm:  Khuếch đại đoạn DNA dùng mồi ngẫu nhiên  Nhanh phương pháp dễ sử dụng Nhược điểm:  Chỉ thị trội  Tính lặp lại Đa hình RAPD Polymorphisms mẫu giống lúa miến địa Trình tự of 10-mer RAPD primers Name Sequence OP A08 OP A15 OP A 17 M OP A19 OP D02 5’ –GTGACGTAGG- 3’ 5’ –TTCCGAACCC- 3’ 5’ –GACCGCTTGT- 3’ 5’ –CAAACGTCGG- 3’ 5’ –GGACCCAACC- 3’ RAPD gel configuration This image cannot currently be display ed Chỉ thị AFLP (Đa hình độ dài đoạn nhân lên) Nguyên lý  Cắt DNA enzyme giới hạn khác  Bổ sung adaptor đặc hiệu vào DNA cắt tạo nên đoạn mút giống nhau, đặc trưng cho mồi chọn trước  Khuếch đại đoạn DNA cắt PCR Mồi phản ứng PCR thiết kế dựa trình tự adaptor chứa trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide;  Chỉ phân đoạn DNA chứa trình tự adaptor trình tự chọn lọc khuếch đại  Sản phẩm PCR chạy gel acrylamide https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 07/08/2017 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Các loại enzyme cắt giới hạn Loại I - Những enzyme giới hạn loại I có trình tự nhận biết đặc hiệu Vị trí cắt enzyme loại nằm ngồi trình tự nhận biết khoảng cách không định, dao động từ 1.000 đến 5.000 nucleotide - Do khơng có tính đặc hiệu cắt đoạn nên sản phẩm khơng đồng không phát điện di gel Loại II - Bao gồm enzyme có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu Khi nhận biết trình tự đó, chúng cắt vị trí nhận biết - Do có tính đặc hiệu cắt đoạn DNA nên sản phẩm thủy phân tập hợp đoạn DNA đặc hiệu cho phép phát điện di gel agarose - Ngày có 1.000 RE loại II tách từ tế bào procaryote khác có 70 loại thương mại hóa thị trường Loại III - Bao gồm enzyme sau nhận biết trình tự DNA đặc hiệu cắt vị trí cách 20 nucleotide tạo số đầu cắt khác - Tuy vị trí điểm cắt gần trình tự nhận biết khó đốn trước điểm cắt Vì mà RE loại III RE loại I không sử dụng rộng rãi công nghệ di truyền Một số kiểu cắt RE loại II Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt phân tử DNA giữa, tạo hai đoạn DNA đầu Sau cắt, hai đầu khơng có khả tự kết hợp trở lại Chỉ thị AFLP Cắt đầu dính (đầu lệch): RE cắt tạo hai đầu lệch vài bazơ Trong trường hợp này, đầu dính bổ sung bị bắt cặp trở lại Như vậy, DNA khác nguồn có chứa trình tự nhận biết đặc hiệu RE, sau bị cắt có đầu dính bổ sung giống nên đoạn DNA khác nguồn nối lại để tạo phân tử lai Đây sở phương pháp tạo dòng gen, phương pháp thúc đẩy phát triển công nghệ di truyền SSR (Simple sequence repeat) Là đoạn DNA có chứa trình tự lặp lại nhiều lần liên tục genome  Yêu cầu kỹ thuật  Có độ tin cậy ổn định  Giá thành vừa phải  Cần sử dụng kits khác cho kích thước genome phân tích Sequence ACTGTCGACACACACACACACGCTAGCT TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA Primer (AC)7 ACTGTCGACACACACACACACACGCTAGCT TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA (AC)8 ACTGTCGACACACACACACACACACACGCTAGCT TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA (AC)10 ACTGTCGACACACACACACACACACACACACGCTAGCT TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA (AC)12 https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 07/08/2017 Đa hình SSR P1 AATCCGGACTAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTTAGCGAATTAGG P2 AAGGTTATTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTAGGCTAGGCG P1 P2 Điện di gel SNPs (Đa hình nucleotide) DNA sequencing Là chị thị phân tử mà đa hình xác định khác nucleotide SNPs DNA strand Lai sử dụng huỳnh quang Sequencer Bất kì hai đoạn DNA khác cặp nucleotide 1000 cặp coi SNPs Nhiều SNPs khơng ảnh hưởng đến chức tế bào nên sử dụng làm thị Sequencing gel Sequencing graph Đặc điểm thị di truyền Đặc điểm Số locut Chỉ thị hình thái Chỉ thị protein Giới hạn Giới hạn Di truyền Trội Ưu điểm Quan sát thấy RFLP RAPD SSR Hầu không giới hạn Không giới hạn Nhiều Đồng trội Đồng trội Trội Đồng trội Dễ phát Sử dụng trước có kĩ thuật khác Nhanh với nhiều thị Phân bố genome, đa hình cao u cầu phóng xạ, đắt Đầu tư cao Đắt Nhược điểm Có thể liên Có thể cho kết gen với tế bào đặc tính trạng hiệu khơng mong muốn Hết chương IV https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home ... DNA): - Xác định khác độ dài đoạn DNA - Hình thức di truyền: di truyền nhân, di truyền tế bào chất, di truyền nhân theo mẹ, di truyền tế bào chất từ mẹ, di truyền tế bào chất theo bố mẹ; - Yêu... đến chức tế bào nên sử dụng làm thị Sequencing gel Sequencing graph Đặc điểm thị di truyền Đặc điểm Số locut Chỉ thị hình thái Chỉ thị protein Giới hạn Giới hạn Di truyền Trội Ưu điểm Quan sát thấy... Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Các loại thị phân tử DNA Có nhiều loại thị phân tử, thị phân nhóm dựa trên: 07/08/2017 Chỉ thị phân tử dựa phương pháp lai  Chỉ thị RFLP