Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 3.1 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng cung cấp đến học viên các kiến thức về một số kỹ thuật sử dụng trong chọn giống cây trồng; chiết tách, đánh giá độ sạch DNA; phương pháp PCR; điện di; giải trình tự DNA,... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!
CHƯƠNG 3: Một số kỹ thuật sử dụng chọn giống trồng 3.1 Chiết tách, đánh giá độ DNA 3.2 Phương pháp PCR 3.3 Điện di 3.4 Giải trình tự DNA 3.1 Chiết tách đánh giá độ sạnh DNA • Để thu nhận DNA tinh cần loại bỏ thành phần tạp nhiễm, quan trọng protein • Tách chiết DNA dựa ngun tắc hịa tan khác phân tử khác (nulceic acid/protein) • Thu DNA trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy tác nhân học hay hóa học • DNA tách chiết dùng phân tích di truyền - Khoa học: DNA sử dụng nhiều ứng dụng, vd đưa DNA vào tế bào cho mục đích chẩn đốn; - Y học: ứng dụng phổ biến: vd đánh giá độc tính sinh sinh vật, xác định nguồn gây bệnh; - Nghiên cứu tội phạm: cần phục hồi DNA Các bước Có nhiều phương pháp tách chiết khác nhau, tất phương pháp gồm: • B1: Phá màng tế bào, màng nhân • B2: Loại protein tạp chất khác • B3: Thu hồi nucleic acid • Sự lựa chọn phương pháp dựa nhiều yếu tố: A Hàm lượng khối lượng DNA B Yêu cầu độ tinh DNA cho ứng dụng C Thời gian chi phí Ngun tắc • Tách DNA khỏi thành phần tế bào khác proteins, lipids, RNA… • Trách làm đứt gãy đoạn dài DNA từ tác động học enzyme • Bất hoạt enzyme TB (DNase enzymes) ngăn chặn tác động làm ngắn/đứt gãy lên DNA bước quan trọng tinh DNA DNases bất hoạt sử dụng nhiệt chất hóa trị/chelating agents Tách chiết DNA Các bước • Phá màng tế bào, màng nhân • Loại bỏ tạp chất gồm Proteins RNA Các phân tử đa lượng khác • Kết tủa thu hồi DNA B1 Phá vỡ màng tế bào, màng nhân Nghiền tế bào, mô hỗn hơp chất tẩy (SDS) proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA mơi trường đồng thời phân hủy protein liên kết với DNA - Chất tẩy chất lưỡng cực, kết hợp với portein màng phân từ phospholipid làm vỡ cấu trúc màng - Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy khơng ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ B2 Loại bỏ tạp chất • DNA tách bỏ khỏi protein tạp chất sau nghiền mẫu Phương pháp tách bỏ: a) Dùng hợp chất hữu b) Các loại muối Phương pháp Sanger • Nguyên lý: dựa theo chế tổng hợp DNA Trong trình tổng hợp mạch đơn DNA bổ sung hàm lượng nhỏ dideoxinucleotid (ddNTP) • Do ddNTP nhóm OH (carbon số 3) ngẫu nhiên làm cho phản ứng tổng hợp DNA ngừng lại • Phản ứng tổng hợp DNA xảy ống riêng biệt • Kết thu sản phẩm DNA với kích thước khác kiểm tra điện di Bazơ cuối đoạn DNA xác định 2’, 3’ dideoxy nucleotide (Khơng thể hình thành liên kết phosphodiester với dNTP kế tiếp) Vật liệu: - Primer( 20 nucleotides) - DNA polymerase - DNA template - dNTP ddNTP - Vật liệu đánh dấu - Hệ thống điện di Bước 1: Biến tính DNA khn Điện di gel polyacrylamid để thu mạch đơn DNA, dùng DNA để tiến hành bước xử lý Bước 2: Chuẩn bị cho phản ứng tổng hợp DNA Lấy ống, cho thành phần cần thiết vào ống : mạch khn DNA, mồi có đánh dấu phóng xạ P32, enzyme DNA polymerase, loại dNTP, dung dịch đệm thích hợp thêm vào ống tương ứng loại ddNTP định Bước : Thực phản ứng tổng hợp DNA Mồi đánh dấu sử dụng để khởi động tổng hợp DNA loại ddNTPs ngẫu nhiên kết thúc tổng hợp đoạn DNA Bước 4: Điện di kết quả, so sánh kết chuỗi mạch đơn DNA tổng hợp để xác định trình tự mạch khn Các đoạn DNA được phân tách gel, chiếu đèn và chụp ảnh Giải trình tự máy tự động (Sequencer) • Theo nguyên tắc sử dụng ddNTP phương pháp Sanger • Trong trình tổng hợp DNA sử dụng mồi dNTP đánh dấu huỳnh quang, loại dNTP có màu khác • Máy tổng hợp mạch đơn mạch khuôn,dùng phần mềm để xử lý kết • Phản ứng thực ống tất sản phẩm thu ống • Các sản phẩm phân tách theo kích cớ chạy điện di Giải trình tự máy tự động • Các vạch đánh dấu màu phụ thuộc vào ddNTP kết thúc đoạn DNA • Máy laser scan màu huỳnh quang gắn vạch chạy qua phận phân tích phát màu Xử lý kết quả, tự động in trình tự gen Các bước phản ứng giải trình tự gen Sản phẩm PCR tinh Chuẩn bị cho phản ứng sequencing Thực chu kì sequening Đọc trình tự nucleotit kết thúc (trình tự DNA) Xử lý đoạn DNA tổng hợp Các công nghệ giải trình tự gen • 2005: 454 Sequencing • 2006: Illumnia Sequencing • 2007: ABI solid Sequencing Trình tự gen để làm gì? • So sánh đoạn ADN với liệu ngân hàng gen xác định đoạn ADN sinh vật • Biết trình tự xếp nucleotit đoạn ADN suy trình tự axit amin tương ứng mạch polypeptide đoạn ADN mã hóa • Xác định đột biến, sai khác trình tự nucleotit sản phẩm gen, có ý nghĩa nghiên cứu tiến hóa ứng dụng thực tiễn • Tạo sinh vật mang đặc tính mong muốn chuyển gen vào tế bào vi khuẩn, nấm men… để sản xuất sản phẩm gen theo đường tái tổ hợp (protein, enzym, vaccine hợp chất có hoạt tính sinh học) NCBI - BLAST NCBI home page Go to www.ncbi.nlm.nih.gov : 1) Dùng để tìm xác định trình tự có trình tự với đoạn gen thử nghiệm database 2) Xếp trình tự tìm kiếm theo mức độ tương đồng (E value) 3) Biểu thị liên kết trình tự thử nghiệm trình tự giống database Programs available for BLAST searches Protein sequence (this is the best option) blastp compares an amino acid query sequence against a protein sequence database tblastn compares a protein query sequence against a nucleotide sequence database translated in all reading frames DNA sequence blastn compares a nucleotide query sequence against a nucleotide sequence database blastx compares a nucleotide query sequence translated in all reading frames against a protein sequence database tblastx compares the six-frame translations of a nucleotide query sequence against the six-frame translations of a nucleotide sequence database ... chuỗi xoắn kép (Denaturation) - 9 4-9 6oC - Chuỗi xoắn kép thành đoạn mạch đơn DNA • B2: Gắn mồi (Annealing) - 5 0-6 5oC - Các mồi gắn vào mạch khn • B3: Kéo dài mạch DNA - 72oC Các nucleotit gắn vào... Electrophoresis) Điện di - Electrophoresis • Chuẩn bị mẫu, gel (agarose, polyacrylamide…), bồn điện di, buffer, dung dịch điện di? ?? • Nạp mẫu • Chạy điện di • Nhuộm gel Chất nhộm gel - Stain Điện di gel agarose... động -Nếu nhiều: phản ứng đặc hiệu • Enzyme DNA polymerase: - Kéo dài mạch DNA - Taq thu nhận từ Thermus acquaticus enzyme khác tương tự - Enzyme chịu nhiệt - Chiều tổng hợp 5’ 3’ 3.3 Điện di