Bài giảng Công cụ di truyền mới trong chọn tạo giống cây trồng: Chương 3.2 - TS. Vũ Thị Thúy Hằng cung cấp đến học viên các kiến thức về mồi PCR/PCR primer; nguyên tắc chung trong thiết kế mồi; một số phần mềm trong thiết kế mồi;... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!
Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam MỒI PCR/ PCR PRIMER Vũ Thị Thúy Hằng Nội dung Khái niệm Nguyên tắc chung thiết kế mồi Một số phần mềm thiết kế mồi https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam PCR: công nghệ làm thay đổi giới The Polymerase Chain Reaction (PCR) làm cách mạng khoa học sống cho phép nhân số lượng lớn DNA cách thuận tiện, hiệu quả, có độ cậy Được phát minh năm 1983 Kary Mullis, dành giải Nobel năm 1993 Kỹ thuật PCR sử dụng rộng rãi phát Taq polymerase, DNA polymerase vi khuẩn Thermus aquaticus, bền với nhiệt Nguyên liệu dùng PCR: - DNA nucleotides: thành phần hình thành nên đoạn DNA - DNA khn: trình tự/đoạn DNA muốn nhân - Primers/Mồi: đoạn DNA mạch đơn gồm 16 50 nucleotide bắt cặp bổ sung với vùng ngắn đầu đoạn DNA khuôn - DNA polymerase: enzyme bền với nhiệt độ dùng để tổng hợp đoạn DNA Mồi – định thành công phản ứng PCR Đặc hiệu/ Chuyên biệt? Gắn với DNA khuôn https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Khái niệm Mồi đoạn nucletotit ngắn, bắt cặp bổ sung với đầu 5’ hay 3’ DNA mạch khuôn Thiết kế mồi tạo đoạn trình tự nucleotit ngắn sử dụng nhân vùng đặc hiệu DNA Mồi thiết kế dựa vào vùng trình tự biết nằm đầu đoạn gen cần nhân Mồi thiết kế dùng để : - Tìm gen - Xây dựng công cụ để nhận biết, phân biệt - Tối ưu sản phẩm PCR https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Nguyên tắc chung thiết kế mồi Trước thiết kế mồi – Đừng phát minh lại bánh xe! https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Trước thiết kế mồi – Tìm kiếm sử dụng nguồn thông tin! Mồi thiết kế dùng để làm gì? Nhân DNA nói chung? Phát khác cấp độ nucleotide/SNPs? Nghiên cứu Methylation (nhóm methyl gắn vào làm DNA thay đổi chức năng) Trong PCR để định lượng DNA nhân (Real-time PCR) Làm mồi dò cho microarray? Cho nhiều PCR phản ứng (sử dụng nhiều mồi) Bắt đầu từ đâu? Trình tự DNA mạch đơn/ Trình tự protein? Nhiều file trình tự DNA/protein? Ngân hàng gen (GenBank ID/Gene ID/Gene Symbol/rsSNP ID? Sau đó, xem xét số lựa chọn! Hầu hết mồi thiết kế từ số phần mềm khác Các phần mềm khác cho kết khác nhau, chủ yếu về: Cách tiếp cận Tiêu chí thiết kế mặc định (Designing criteria and default settings) Tính tồn diện Tính sử dụng Tốc độ Xem xét đến lựa chọn thứ khi: Bạn lần đầu thiết kế Bạn khơng có nhiều tự tin lựa chọn kết https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Những nguyên tắc chung thiết kế mồi Khi thiết kế mồi phải xem xét đến yếu tố: Chiều dài mồi đoạn nhân Nhiệt độ chảy Nhiệt độ gắn mồi Tính đặc hiệu/chuyên biệt tránh tương đồng chéo Hàm lượng GC; trình tự chạy trình tự lặp Tránh tương tác mồi – mồi hình thành cấu trúc bậc Kẹp GC (GC clamp) Chiều dài mồi đoạn nhân Chiều dài mồi định tính đặc hiệu ảnh hưởng lớn đến nhiệt độ gắn mồi: Quá ngắn: tính đặc hiệu kém, dẫn đến nhân đoạn không đặc hiệu Quá dài: giảm hiệu gắn với DNA khuôn nhiệt độ gắn mồi bình thường tăng xác suất hình thành cấu trúc bậc hai Chiều dài tối ưu 18-24 bp cho PCR thông thường 30-35 bp cho nhiều PCR phản ứng Chiều dài đoạn DNA nhân tối ưu 300-1000 bp cho PCR thông thường, tránh > kb 50-150 bp PCR để định lượng, tránh > 400 bp https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Chiều dài mồi Xác suất tìm thấy nucleotit A, G, C, T trình tự DNA là: 1/4 (4-1) Xác suất tìm thấy trình tự có nucleotit liền (vd AG) trình tự DNA là: 1/16 (4-2) Xác suất tìm thấy trình tự nucleotit liền trình tự DNA là: 1/256 (4-4) Cứ vậy, trình tự 16 nucleotit xuất lần tối thiểu 4-16 nucleotit, ~ tỷ nucleotit, ~ genome người ngô Nhiệt độ chảy (Tm) Tm nhiệt độ 50% DNA kép tháo xoắn thành mạch đơn Ảnh hưởng độ dài mồi, thành phần nucleotide nồng độ mồi Ảnh hưởng nồng độ muối (MgCl2) phản ứng PCR Tm = 2(A+T)+4(G+C) Nhiệt độ chảy 52°C 60°C Tm > 65°C thường tránh khả gắn mồi với cấu trúc bậc Tm (75°C 80°C) sử dụng để nhân đoạn có hàm lượng GC cao Sự khác biệt Tm mồi xuôi ngược < 5oC https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Nhiệt độ gắn mồi (Ta) Ta nhiệt độ mồi gắn vào mạch DNA khn Ta vs Tm Ta ảnh hưởng Tm mồi đoạn nhân bản: tối ưu: Ta=0.3 x Tm(mồi)+0.7 x Tm(sản phẩm PCR)-25 Nguyên lý chung: Ta thấp 5°C so với Tm Nhiệt đô Ta cao tăng tính đặc hiệu phản ứng cho lượng DNA nhân Tính đặc hiệu tránh tương đồng chéo Tính đặc hiệu Chỉ có vị trí bắt cặp mồi DNA khuôn Quyết định chiều dài mồi trình tự nucleotit Phụ thuộc vảo chất đoạn DNA làm khuôn Tương đồng chéo Mồi thiết kế không nhân gen khác phản ứng PCR Mồi chứa nhiều trình tự lặp lại thường nhân đoạn không đặc hiệu Để đảm bảo tính đặc hiệu tránh xảy tương đồng chéo BLAST trình tự mồi PCR thiết kế với trình tự NCBI xem nhân đoạn tương đồng khác không? https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam Hàm lượng GC; trình tự chạy trình tự lặp Hàm lượng G/C Tối ưu: 45-55% Thông thường G/C khoảng: 40-60% Trình tự chạy Mồi có trình tự chạy bazơ dài dẫn đến gắn mồi sai VD AGCGGGGGATGGGG trình tự chạy 'G' and Tối đa nucleotit Trình tự lặp Một trình tự lặp gồm 2-nucletotit liền lặp lặp lại nhiều lần VD: ATATATAT Số trình tự lặp tối đa đoàn mồi thiết kế Tránh hình thành cấu trúc bậc mồi Cấu trúc bậc mồi hình thành tương tác thân mồi cặp mồi với nhau, ảnh hưởng đến bắt cặp mồi với DNA khuôn ảnh hưởng tới phản ứng PCR Có thể dạng: Kẹp tóc/Hairpins Hình thành tương tác thân mồi: bắt cặp nucletotit mồi Tự bắt cặp/ Self-Dimer Do tương tác mồi: bắt cặp nucletotit mồi Bắt cặp chéo Do tương tác mồi xuôi mồi ngược: bắt cặp nucletotit mồi xuôi mồi ngược; https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Kẹp tóc Tự bắt cặp Bắt cặp chéo Kẹp GC (GC clamp) GC clamp Sự có mặt G C nucletotit cuối đầu 3’ mồi, giúp cho bắt cặp đặc hiệu mồi DNA khuôn (do liên kết mạnh G/C - liên kết hydro) Tránh có nhiều >3 G C đầu 3’ https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 10 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Kết luận: Một mồi tốt mồi: Độ dài: 18-24 bases Tỷ lệ G/C: 40-60% Cân đối G/C A/T (1:1) Tm cho phép gắn mồi nhiệt đột 55-65°C Khơng có bắt cặp mồi tạo thành cấu trúc bậc Có G C nucletotit cuối đầu 3’ Cặp mồi xuôi ngược cần: Nhiệt độ chảy tương đương nhau, không khác q 5°C Khơng có bắt cặp chéo mồi xuôi mồi ngược Một số phần mềm thiết kế mồi Việc tính tốn thủ cơng để kiểm tra yêu cầu cho đoạn mồi dự định thiết kế tồn thời gian công sức Việc làm trở nên dễ dàng nhanh chóng nhờ sử dụng phần mềm thiết kế mồi như: Oligo Primer PrimerQuest Primer3Plus PrimerZ PerlPrimer https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 11 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Các bước thiết kế mồi Có trình tự khn DNA Bằng cách: - Giải trình tự DNA/RNA sinh vật, từ thiết kế mồi theo trình tự giải - Lấy trình tự nucletotit sinh vật liệu NCBI từ thiết kế mồi dựa vào phần mềm Nhập thơng tin trình tự khuôn DNA Yêu cầu thông số thiết kế mồi phần mềm Phần mềm tính tốn cung cấp trình tự mồi Kiểm tra xem mồi có thỏa mãn yêu cầu mồi tốt, khơng lặp lại thiết kế Khơng Tìm trình tự Giải trình tự/ NCBI/ Cơ sở liệu Thiết kế mồi Các phần mềm thiết kế Kiểm tra Thỏa mãn u cầu khơng? Dựa tiêu chí mồi tốt: - Tm - độ dài - độ đặc hiệu - cấu trúc bậc - Có Phản ứng PCR …điện di kiểm tra tính đặc hiệu, phản ứng https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 12 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam General Purpose PCR Primer Design Tool– Primer3 http://simgene.com/Primer3 General Purpose PCR Primer Design Tool– Primer3Plus http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 13 Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam General Purpose PCR Primer Design Tool– PrimerZ Web Site: http://genepipe.ncgm.sinica.edu.tw/primerz/beginDesign.do General Purpose PCR Primer Design Tool – PerlPrimer Web Site: http://perlprimer.sourceforge.net/index.html PerlPrimer screenshots: http://perlprimer.sourceforge.net/screenshots.html More Info: http://www.hsls.pitt.edu/guides/genetics/obrc/dna/pcr_oligos/URL1167845497/info https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 14 ... mồi tốt: - Tm - độ dài - độ đặc hiệu - cấu trúc bậc - Có Phản ứng PCR …điện di kiểm tra tính đặc hiệu, phản ứng https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home 12 Lớp Học Phần VNUA - Khoa... thiết kế dùng để : - Tìm gen - Xây dựng cơng cụ để nhận biết, phân biệt - Tối ưu sản phẩm PCR https://sites.google.com/site/lophocphank57vnua/home Lớp Học Phần VNUA - Khoa Nông Học - Học Viện Nông... Chiều dài tối ưu 1 8-2 4 bp cho PCR thông thường 3 0-3 5 bp cho nhiều PCR phản ứng Chiều dài đoạn DNA nhân tối ưu 30 0-1 000 bp cho PCR thông thường, tránh > kb 5 0-1 50 bp PCR để định lượng,