MAI THỊ LINH KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG đa NHÂN CHỨA saccharomyces boulardii THEO PHƯƠNG PHÁP TÁCH PHA ĐÔNG TỤ KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược SĨ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THỊ LINH KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG ĐA NHÂN CHỨA Saccharomyces boulardii THEO PHƯƠNG PHÁP TÁCH PHA ĐÔNG TỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2021 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THỊ LINH MÃ SINH VIÊN: 1601445 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG ĐA NHÂN CHỨA Saccharomyces boulardii THEO PHƯƠNG PHÁP TÁCH PHA ĐÔNG TỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn ThS Kiều Thị Hồng Nơi thực hiện Bợ mơn Cơng nghiệp dược HÀ NỢI - 2021 LỜI CẢM ƠN Khóa luận được thực hiện và hoàn thành tại tổ Vi sinh – Bộ môn Công nghiệp Dược Trong thời gian thực hiện khóa luận, đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn, xin gửi lời cảm ơn đến ThS Kiều Thị Hồng, người thầy tận tình giúp đỡ, chỉ bảo từ những ngày đầu tiên cho đến hoàn thành khóa luận này Bên cạnh đó, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Đàm Thanh Xuân cùng tất cả thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công Nghiệp Dược đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt quá trình thực hiện đề tài Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho suốt năm học tập tại trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn bè đã đồng hành, ủng hộ học tập và cuộc sống Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Mai Thị Linh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về probiotic 1.1.1 Định nghĩa về probiotic 1.1.2 Các loài probiotic phổ biến 1.1.3 Các xu hướng chế phẩm chứa probiotic 1.2 Loài Saccharomyces boulardii 1.2.1 Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy 1.2.2 Vai trò của Saccharomyces boulardii đời sống 1.2.3 Các dạng chế phẩm chứa Saccharomyces boulardii hiện 1.3 Đại cương về vi nang hóa 1.3.1 Khái niệm và đặc điểm của vi nang 1.3.2 Đặc điểm của vi nang 1.3.3 Ưu và nhược điểm của phương pháp vi nang hóa bao gói tế bào .8 1.3.4 Các phương pháp tạo vi nang 1.4 Nguyên liệu tạo vi nang đa nhân 11 1.5 Một số nghiên cứu vi nang hóa Saccharomyces boulardii 13 PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 16 2.1.1 Chủng vi sinh vật 16 2.1.2 Hóa chất 16 2.1.3 Thiết bị 16 2.1.4 Dụng cụ 17 2.1.5 Môi trường sử dụng nghiên cứu 17 2.1.6 Dung dịch sử dụng nghiên cứu 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.2.1 Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii theo phương pháp tách pha đông tụ 18 2.2.2 Đánh giá khả bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn [4] 18 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 19 2.3.3 Phương pháp tạo vi nang theo nguyên tắc tách pha đông tụ 19 2.3.4 Phương pháp đông khô 20 2.3.5 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV [4] 21 2.3.6 Phương pháp phá hạt xác định số lượng VSV có mẫu hạt sau đông khô 22 2.3.7 Phương pháp xác định hình ảnh vi nang [7] 22 2.3.8 Phương pháp định tính tinh bột bằng thuốc thử lugol [7] 22 2.3.9 Phương pháp đánh giá khả bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân [7] 22 2.3.10 Phương pháp tính hiệu suất tạo vi nang 23 PHẦN 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 24 3.1 Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii theo phương pháp tách pha đông tụ 24 3.1.1 Khảo sát nồng độ alginat của thành phần dịch bao ngoài ảnh hưởng đến quá trình tạo vi nang đa nhân 24 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa vi nang nhân và hỗn dịch bao gói tới quá trình tạo vi nang đa nhân 29 3.1.3 Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii 33 3.2 Đánh giá khả bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân 37 3.2.1 Đánh giá khả bảo vệ VSV và giữ cấu trúc vi nang dung dịch pH 1.2 37 3.2.2 Đánh giá khả giải phóng VSV của vi nang đa nhân 39 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 4.1 Kết luận 42 4.2 Đề xuất 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT B longum : Bifidobacterium longum CFU : Số đơn vị khuẩn lạc (Colony – Forming Units) FAO : Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) GRAS : được công nhận là an toàn (Generally Recogized As Safe) kl/tt : Khối lượng/thể tích L casei : Lactobacillus casei L reuteri LRE02 : Lactobacillus reuteri LRE02 L rhamnosus LR06 : Lactobacillus rhamnosus LR06 MT1 : Môi trường MT2 : Môi trường TCCS : Tiêu chuẩn sở TCNSX : Tiêu chuẩn nhà sản xuất TKHH : Tinh khiết hóa học VSV : Vi sinh vật WHO : Tổ chức y tế thế giới (World Heald Organization) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Ưu nhược điểm của các phương pháp tạo vi nang phổ biến 10 Bảng 2.1: Các nguyên liệu và hóa chất sử dụng 16 Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng 16 Bảng 3.1: Kết quả quá trình tạo vi nang đa nhân và đánh giá khả bao gói của các mẫu vi nang A-0.5; A-1; A-2 và A-3 25 Bảng 3.2: Tỷ lệ vi nang nhân : hỗn dịch bao gói cần khảo sát 30 Bảng 3.3: Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ phối hợp vi nang nhân và dịch bao ngoài tới quá trình tạo vi nang đa nhân 30 Bảng 3.4: Hiệu suất tạo vi nang 37 Bảng 3.5: Số lượng VSV giải phóng và sống sót tại các thời điểm khác 39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Hình ảnh Saccharomyces boulardii quan sát dưới kính hiển vi thường và kính hiển vi điện tử [19] Hình 1.2: loại vi nang chứa vi sinh vật thường gặp [11] Hình 1.3: Phương pháp tách pha đông tụ tạo vi nang [11] 11 Hình 1.4: Cấu trúc của Alginat [30] 12 Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Chitin [40] 12 Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của Chitosan [40] 13 Hình 3.1: Hình ảnh vi nang tươi a) Mẫu A-0.5; b) Mẫu A-1; Mẫu A-2; 27 Hình 3.2: Hình ảnh vi nang sau đông khô a) Mẫu A-0.5; b) Mẫu A-1; 27 Hình 3.3: Hình ảnh vi nang AT – 2.5 a) Trước đông khô; b) Sau đông khô 31 Hình 3.4: Hình ảnh vi nang AT – a) Trước đông khô; b) Sau đông khô 32 Hình 3.5: Hình ảnh vi nang AT – 10 a) Trước đông khô; b) Sau đông khô 32 Hình 3.6: Sơ đồ các bước tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii 35 Hình 3.7: Hình ảnh vi nang ATC – AT a) Trước đông khô b) Sau đông khô 35 Hình 3.8: Hình ảnh vi nang ATC-ATC a) Trước đông khô; b) Sau đông khô 36 Hình 3.9: a) Vi nang ATC – ATC; b) Vi nang ATC – AT dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại 25X 36 Hình 3.10: Kết quả thử định tính tinh bột dung dịch pH 1.2 sau 30 phút của các mẫu vi nang ATC – AT và ATC – ATC (theo thứ tự từ trái qua phải) 38 Hình 3.11: Biểu đồ biểu diễn số lượng VSV giải phóng dịch tiêu hóa mô phỏng tại các thời điểm khác 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm men Saccharomyces boulardii là probiotic được ứng dụng nhiều thực phẩm và dược phẩm với vai trò cải thiện sức khỏe người Các tác động tích cực tới sức khỏe của Saccharomyces boulardii có thể kể đến tăng cường khả miễn dịch chống nhiễm trùng đường ruột, ngăn ngừa và điều trị tiêu chảy, [34] Tuy nhiên, tiềm điều trị đó chỉ có thể đạt được chúng sống sót qua dạ dày, chống lại các tác động bất lợi đường tiêu hóa, bám dính vào niêm mạc ruột với số lượng đủ lớn tạo tác dụng [23] Ngoài ra, quá trình chế biến và bảo quản các yếu tố độ ẩm, áp suất, oxy hòa tan có thể làm giảm đáng kể số lượng vi khuẩn sống sót làm giảm hiệu quả điều trị [41] Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm nâng cao hiệu quả bảo vệ Saccharomyces boulardii bảo quản cũng đưa được VSV tới vị trí thích hợp ở ruột Phương pháp tạo vi nang đa nhân được tiến hành nhiều hoạt chất cho kết quả khả quan việc bao bọc và giải phóng hoạt chất so với các vi nang đơn nhân [21] Đề tài “ Khảo sát quá trình tạo vi nang đa nhân Saccharomyces boulardii theo phương pháp tách pha đông tụ” được tiến hành với mục tiêu sau: Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii theo phương pháp tách pha đông tụ Đánh giá khả bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về probiotic 1.1.1 Định nghĩa về probiotic Lịch sử ghi nhận việc sử dụng các vi sinh vật có lợi sữa lên men đã có niên đại từ 2500 năm trước công nguyên Nhưng mãi tới năm 1965 thì thuật ngữ probiotic mới được Lilley và Stillwell sử dụng lần đầu tiên để mô tả về “chất một vi sinh vật tiết để kích thích sự phát triển của VSV khác” [25] Thuật ngữ “probiotic” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “ dành cho sự sống” và nó mang nhiều ý nghĩa khác theo thời gian Tác dụng của các VSV này được đặt sở khoa học nghiên cứu của Elie Metchnikoff Những phát hiện mới và những nghiên cứu sâu về lợi ích sức khỏe của sữa lên men đã được ông đưa vào cuốn sách “Essais Optimistes” (1907) [25] Sau Lilley và Stillwell thì rất nhiều nhà khoa học đã nỗ lực để cải thiện định nghĩa về probiotic Parker (1974) đề xuất rằng “ Probiotic là những VSV góp phần cân bằng hệ vi sinh đường ruột” Năm 1989, Fuller đã định nghĩa lại probiotics là “ Một chất cung cấp các VSV sống có những tác động có lợi tới thể vật chủ thông qua việc cải thiện sự cân bằng vi sinh đường ruột” [25] Nhận việc định nghĩa không đồng thuận và chính xác về probiotic là một vấn đề lớn, rất nhiều các sản phẩm khai thác thuật ngữ này chưa chính xác vì thế chúng không đáp ứng được các tiêu chí cần thiết Đồng thời các sản phẩm men vi sinh đã nhận được sự quan tâm chính đáng của các quan quản lý tới việc bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng Năm 2002, qua nhiều cuộc tranh luận của các chuyên gia để làm lại định nghĩa probiotic, tổ chức FAO và WHO đã đưa một định nghĩa thống nhất về probiotic sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà đưa vào thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [29] Kể từ đó định nghĩa này trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi nhất toàn thế giới hầu hết các ấn phẩm khoa học 1.1.2 Các loài probiotic phổ biến Không có một bộ tiêu chí thống nhất để lựa chọn và phân loại một chủng vi a b Hình 3.8: Hình ảnh vi nang ATC-ATC a) Trước đông khô; b) Sau đông khô b a Hình 3.9: a) Vi nang ATC – ATC; b) Vi nang ATC – AT dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại 25X Về cảm quan, vi nang ATC – AT và vi nang ATC – ATC đều có hình dạng không cầu đều, bề mặt không nhẵn, thể chất khô cứng và tách rời Mẫu ATC – ATC có màu nâu đậm so với mẫu ATC – AT có lớp chitosan bao phủ bên ngoài tạo nên màu sắc cho vi nang  Bàn luận Bề mặt của vi nang không nhẵn vi nang đông khô làm thăng hoa các phân tử nước dẫn tới vi nang co rút thể tích [33] Do sự sắp xếp của vi nang nhân bên không đạt được sự đồng nhất nên bề mặt vi nang sẽ không nhẵn và không đồng đều giữa các vi nang c Hiệu suất tạo vi nang 36 Hiệu suất tạo vi nang được tính theo phương pháp nêu ở mục 2.3.10 Bảng 3.4: Hiệu suất tạo vi nang Mẫu Số lượng VSV ban đầu (log CFU/ml) Vi nang sau đông khô (log CFU/g) Hiệu suất tạo vi nang Số lượng VSV Vi nang ATC - AT Vi nang ATC – ATC 7,37 7,37 6,32 6,62 85,75% 89.82% Hiệu suất tạo vi nang của mẫu ATC – AT và ATC – ATC đạt được lần lượt là 85.75% và 89,82% Không có sự khác biệt lớn giữa hai mẫu VSV vi nang giảm so với lượng sinh khối ban đầu có thể thất thoát quá trình nhỏ giọt tạo vi nang hoặc chết khuấy trộn, ngâm hoặc quá trình đông khô 3.2 Đánh giá khả bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân Theo định nghĩa của FAO/WHO, probiotic chỉ phát huy được tác dụng có lợi cho vật chủ đưa vào thể với số lượng đầy đủ, cụ thể là vào tới ruột số lượng VSV phải đạt được tối thiểu là – log CFU/g (theo tiêu chuẩn của FAO/WHO đối với chế phẩm probiotic) [22] Vì thế bên cạnh vai trò bảo vệ và trì khả sống sót của VSV qua đường tiêu hóa thì vi nang cần phải có khả giải phóng VSV tới vị trí tác dụng là tại ruột Các nghiên cứu tiếp theo được thiết kế nhằm mục đích đánh giá khả sống sót của Saccharomyces boulardii được bao gói vi nang đa nhân dịch dạ dày mô phỏng và khả giải phóng VSV dịch ruột mô phỏng 3.2.1 Đánh giá khả bảo vệ VSV và giữ cấu trúc vi nang dung dịch pH 1.2  Tiến hành 37 Ủ 1,00 g mẫu vi nang 100 ml dung dịch pH 1.2 (phương pháp nêu ở mục 2.3.9) Lấy µl dịch lắc đem đếm VSV thất thoát theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.5 Lấy ml dịch acid sau lắc định tính tinh bột bằng thuốc thử Lugol (phương pháp nêu ở mục 2.3.8)  Kết quả Sau lắc với dung dịch pH 1.2, quan sát thấy vi nang có sự trương nở về mặt kích thước, dịch ủ suốt có màu vàng nhạt ở mẫu ATC – ATC, dịch lắc cả mẫu âm tính với phép thử định tính tinh bột Dịch lắc của cả mẫu vi nang đều cho kết quả không có VSV thất thoát ngoài hoặc số lượng VSV thất thoát quá ít dưới ngưỡng phát hiện của phương pháp đếm VSV Hình 3.10: Kết quả thử định tính tinh bột dung dịch pH 1.2 sau 30 phút của các mẫu vi nang ATC – AT và ATC – ATC (theo thứ tự từ trái qua phải)  Bàn luận Sau thời gian lắc dung dịch pH 1.2, các mẫu vi nang đều có dấu hiệu trương nở về mặt cảm quan bên ngoài không có sự thất thoát vi nang nhân hay VSV ngoài cho thấy khả bảo vệ VSV cao dung dịch pH 1.2 của cả mẫu vi nang Cơ chế bảo vệ VSV được lý giải sau: Vi nang calci alginat được hình thành thông qua mô hình hộp trứng được tạo bởi alginat và Ca2+ bẫy các VSV đó; môi trường pH 1.2, ion H+ sẽ trao đổi với ion Ca2+ làm mất cấu trúc hộp trứng; điều này dẫn tới các VSV có thể thất thoát ngoài; 38 nhiên việc bẫy VSV nhân và bao thêm một lớp bên ngoài vi nang nhân giúp giảm đáng kể sự tác động trực tiếp của việc trao đổi ion tới lớp nhân bên Ngoài ra, ở vi nang nhân ATC – ATC việc sử dụng chitosan bao gói đã làm tăng hiệu quả bảo vệ Do chitosan tan ở pH thấp và dung dịch pH 1.2 alginat giảm sự tích điện Vì thế, chitosan trao đổi với ion H+ giúp giảm thiểu sự mất mát ion Ca2+ [16] Do đó, dịch lắc pH 1.2 của mẫu ATC – ATC có màu vàng nhạt chitosan thất thoát ngoài 3.2.2 Đánh giá khả giải phóng VSV vi nang đa nhân  Tiến hành Ủ 1,00 g mẫu vi nang vào 100 ml dung dịch pH 1.2 sau đó tiếp tục ủ với dung dịch pH 6.8 (phương pháp nêu ở mục 2.3.9) Hút chính xác 1,00 ml dịch và xác định số lượng VSV đã giải phóng qua dịch tiêu hóa mô phỏng theo phương pháp pha loãng liên tục đã nêu ở mục 2.3.5  Kết quả Kết quả đếm số lượng VSV giải phóng và sống sót tại các thời điểm 2,5 giờ và 3,5 giờ được trình bày bảng dưới đây: Bảng 3.5: Số lượng VSV giải phóng và sống sót tại các thời điểm khác Mẫu Thời gian ủ Số lượng VSV (log CFU/g) ATC – ATC ATC - AT Mẫu phá hạt 5,72 5,41 Sau 2,5 giờ 4,83 5,03 Sau 3,5 giờ 5,21 5,10  Nhận xét Tại thời điểm sau ủ 2,5 giờ số lượng VSV giải phóng của vi nang đa nhân ATC – AT là 5,03 log CFU/g nhiều lượng VSV giải phóng của mẫu vi nang đa nhân ATC – ATC là 4,83 log CFU/g Tại thời điểm 3.,5 giờ mẫu ATC – ATC có số lượng VSV giải phóng nhiều 39 5.8 Số lượng VSV (log CFU/g) 5.6 5.4 5.2 4.8 4.6 4.4 4.2 giờ giờ 30 phút giờ 30 phút Thời gian vi nang đường tiêu hóa (giờ) ATC - ATC ATC - AT Hình 3.11: Biểu đồ biểu diễn số lượng VSV giải phóng dịch tiêu hóa mô phỏng tại các thời điểm khác  Bàn luận So sánh mẫu vi nang sau 30 phút ủ dung dịch pH 1.2 và giờ ủ dung dịch pH 6.8, mẫu vi nang có chứa chitosan lớp bao ngoài là ATC – ATC có số lượng VSV giải phóng thấp so với mẫu không chứa chitosan ATC – AT Tiếp tục ủ dung dịch pH 6.8 thêm giờ thì mẫu ATC – ATC lại giải phóng số lượng VSV nhiều so với mẫu còn lại Có thể dễ dàng nhận thấy tốc độ giải phóng VSV của mẫu vi nang ATC – ATC ban đầu chậm so với mẫu ATC – AT, sau đó tốc độ giải phóng của mẫu vi nang ATC – ATC lại nhanh mẫu còn lại thông qua biểu đồ biểu diễn số lượng VSV giải phóng hình 3.11 Điều này có thể giải thích đặc tính của chitosan không tan ở pH 6,0 [40] Vì thế giai đoạn đầu dung dịch pH 6,8, mẫu ATC – ATC có chứa chitosan lớp bao ngoài sẽ cản trở sự giải phóng vi nang nhân ngoài Theo thời gian vi nang sẽ hút nước trương nở làm mất tác dụng của chitosan lớp bao ngoài Vì thế vi nang nhân cũng vi sinh vật sẽ giải phóng nhanh chóng ở giai đoạn sau 40 Ngoài ra, ở pH cao 6,5 chitosan giảm tích điện vì thế tương tác với phân tử anion alginat giảm [16] Do đó, tại thời điểm 3,5 giờ mẫu ATC – ATC đạt được số lượng giải phóng VSV nhiều Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hằng đã đưa kết quả tương tự, môi trường dịch ruột mô phỏng mẫu vi nang bao đa lớp có chứa chitosan giải phóng chậm tại giờ tốc độ giải phóng nhanh khoảng – giờ so với mẫu vi nang bao một lớp và mẫu bao lớp không có chitosan [7] Như vậy, mẫu vi nang đa nhân có bao chitosan lớp ngoài cùng đem lại kỳ vọng về khả có thể vận chuyển VSV xa đường tiêu hóa Sau 3,5 giờ thử giải phóng thì ở cả mẫu vi nang đều có số lượng VSV giải phóng thấp kỳ vọng là – log CFU/g (yêu cầu về chế phẩm probiotic của FAO/WHO) Vì vậy để cải thiện số lượng VSV giải phóng khỏi chế phẩm dịch tiêu hóa cần phải nâng số lượng VSV hỗn dịch tạo vi nang nhân ban đầu Như vậy, vi nang đa nhân có lớp bao ngoài có hoặc không có chitosan đều có khả bảo vệ tốt VSV dung dịch pH 1,2 Vi nang đa nhân có lớp bao ngoài chứa chitosan có xu hướng kéo dài thời gian giải phóng VSV Cụ thể tại thời điểm 2,5 giờ thử giải phóng, mẫu có chitosan bao ngoài cho số lượng VSV giải phóng thấp mẫu không có chitosan Nhưng tại thời điểm 3,5 giờ, mẫu có chitosan lại có số lượng VSV giải phóng cao mẫu còn lại Kết quả cho thấy, chitosan có xu hướng ảnh hướng tới khả giải phóng VSV khỏi vi nang dịch tiêu hóa mô phỏng 41 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu đề tài đã đạt được mục tiêu đề và có được một số kết quả chính sau: 4.1.1 Đã khảo sát và lựa chọn được một số thông số tối ưu tạo được vi nang đa nhân gồm:  Vi nang nhân: Hỗn dịch tạo vi nang nhân chứa natri alginat 3%, tinh bột 10%, sinh khối VSV và dung dịch gel hóa CaCl2 2%/Chitosan 3%  Hỗn dịch bao gói ngoài chứa natri alginat 3%, tinh bột 10%; dung dịch gel hóa là CaCl2 2% hoặc CaCl2 2%/ chitosan 3%  Tỷ lệ vi nang nhân và hỗn dịch bao gói: 1:5 Công thức tạo vi nang cho kết quả khả quan để tạo được vi nang nhân tròn đều, tách rời, bề mặt không lộ hạt và khả bao gói VSV cao 4.1.2 Đã đánh giá khả bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân tạo thành dịch tiêu hóa mô phỏng Kết quả cho thấy:  Vi nang đa nhân có lớp bao ngoài có hoặc không có chitosan đều có khả bảo vệ tốt VSV dung dịch pH 1,2  Chitosan hỗn dịch bao gói ngoài có xu hướng ảnh hưởng tới khả giải phóng VSV khỏi vi nang đa nhân Tại thời điểm 2,5 giờ mẫu ATC – ATC cho số lượng VSV giải phóng thấp mẫu ATC – AT Còn tại thời điểm 3,5 giờ, mẫu ATC – ATC lại có số lượng VSV giải phóng cao mẫu ATC – AT 4.2 Đề xuất Bên cạnh những kết quả đạt được, thời gian làm khóa luận còn hạn chế nên đề tài xin được đưa một số đề xuất nhằm hoàn thiện và nâng cao tính ứng dụng thực tế sau: Nghiên cứu các biện pháp gia tăng độ đồng đều của nhân vi nang, tiến hành đánh giá lặp lại thí nghiệm giải phóng để khẳng định kết quả 42 Theo dõi độ ổn định của vi nang đa nhân quá trình bảo quản để đánh giá khả bảo vệ VSV của vi nang đa nhân theo thời gian 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Thị Hoàng Anh (2020), Khảo sát quá trình tạo vi nang đa lớp chứa Lactobacillus acidophilus và Saccharomyces boulardii, Khóa luận tốt nghiệp DSĐH, Trường đại học Dược Hà Nội Ngô Nguyễn Quỳnh Anh (2020), Nghiên cứu tạo vi nang chứa Lactobacillus acidophilus Saccaromyces boulardii, Luận văn thạc sĩ dược học, Trường đại học Dược Hà Nội Bộ môn bào chế - Đại học Dược Hà Nội (2005), Một số chuyên đề về bào chế hiện đại Nhà xuất bản Y học Hà Nội, tr.112 - 128 Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, PL.16.1, tr.414-415 Trần Cát Đông (2015), Xu hướng nghiên cứu và ứng dụng chủng lợi khuẩn probiotic y học và thực phẩm chức năng, Trung tâm Thông tin Khoa học và Công nghệ TP.HCM, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng (2012), Vi Sinh Vật học Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội, tr.221 - 228 Nguyễn Thị Hằng (2020), Đánh giá vai trò bảo vệ vi sinh vật đường tiêu hóa của vi nang đông tụ alginat – chitosan bao đa lớp, Khóa luận tốt nghiệp DSĐH, Trường đại học Dược Hà Nội Từ Minh Kóong (2017), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm tập II: Kỹ thuật sản xuất thuốc bằng phương pháp sinh tổng hợp, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội Đàm Thanh Xuân và cộng sự (2015), "Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics bằng phương pháp đông tụ", Tạp chí Dược học, tr.61-65 Tài liệu tiếng Anh 10 Arslan Sultan, Erbas Mustafa, et al (2015), "Microencapsulation of probiotic Saccharomyces cerevisiae var boulardii with different wall materials by spray drying", LWT-Food Science Technology, 63(1), pp.685690 11 Asgari Shadi, Pourjavadi Ali, et al (2020), "Polymeric carriers for enhanced delivery of probiotics", Advanced Drug Delivery Reviews 12 Berger Jerome, Reist Marianne, et al (2004), "Structure and interactions in chitosan hydrogels formed by complexation or aggregation for biomedical applications", European journal of Pharmaceutics Biopharmaceutics, 57(1), pp.35-52 13 Blandino Ana, Macias Manuel, et al (1999), "Formation of calcium alginate gel capsules: influence of sodium alginate and CaCl concentration on gelation kinetics", Journal of Bioscience Bioengineering, 88(6), pp.686689 14 Chan Eng-Seng, et al (2011), "Effects of starch filler on the physical properties of lyophilized calcium–alginate beads and the viability of encapsulated cells", Carbohydrate polymers, 83(1), pp.225-232 15 Chan Eng-Seng, Lee Boon-Beng, et al (2009), "Prediction models for shape and size of ca-alginate macrobeads produced through extrusion–dripping method", Journal of Colloid Interface Science, 338(1), pp.63-72 16 Cook Michael T, Tzortzis George, et al (2011), "Production and evaluation of dry alginate-chitosan microcapsules as an enteric delivery vehicle for probiotic bacteria", Biomacromolecules, 12(7), pp.2834-2840 17 Czerucka D, Piche T, et al (2007), "Yeast as probiotics–Saccharomyces boulardii", Alimentary pharmacology therapeutics, 26(6), pp.767-778 18 Dubey Rama (2009), "Microencapsulation technology and applications", Defence Science Journal, 59(1), pp.82 19 Duongthingoc Diep , et al (2013), "Effect of whey protein agglomeration on spray dried microcapsules containing Saccharomyces boulardii", Food chemistry, 141(3), pp.1782-1788 20 e Silva J Paulo Sousa, Freitas Ana Cristina (2014), Probiotic bacteria: fundamentals, therapy, and technological aspects, Crc Press 21 Eqbal Md Danish, Gundabala Venkat (2017), "Controlled fabrication of multi-core alginate microcapsules", Journal of colloid interface science, 507, pp.27-34 22 FAO/WHO (2002), "Guidelines for the evaluation of probiotics in food", Report of a joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food Guidelines for the evaluation of Probiotics in Food Report of a joint FAO/WHO working group on drafting guidelines for the evaluation of Probiotics in Food, FAO, pp.1-8 23 Favaro-Trindade CS, Heinemann RJB, et al (2011), "Developments in probiotic encapsulation", CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources, 6, pp.1-8 24 Frakolaki Georgia, Giannou Virginia, et al (2021), "A review of the microencapsulation techniques for the incorporation of probiotic bacteria in functional foods", Critical reviews in food science nutrition, 61(9), pp.1515-1536 25 Fuller Roy (1992), "History and development of probiotics", Probiotics, Springer, pp.1-8 26 Gbassi Gildas K, Vandamme Thierry (2012), "Probiotic encapsulation technology: from microencapsulation to release into the gut", Pharmaceutics, 4(1), pp.49-163 27 Ghorbani-Choboghlo Hassan, Nikaein Donya, et al (2019), "Effect of microencapsulation on Saccharomyces cerevisiae var boulardii viability in the gastrointestinal tract and level of some blood biochemical factors in wistar rats", Iranian journal of microbiology, 11(2), pp.160 28 HJ Chaudhary, Ami R Patel (2019), "Microencapsulation technology to enhance the viability of probiotic bacteria in fermented foods: An overview", International Journal of Fermented Foods, 8(2), pp.63-72 29 Hotel Amerian Córdoba Park, Cordoba A (2001), "Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria", Prevention, 5(1), pp.1-10 30 Liu Fan, Chen Qiuhong, et al (2018), "Natural polymers for organ 3D bioprinting", Polymers 10(11), pp.1278 31 McFarland Lynne V (2010), "Systematic review and meta-analysis of Saccharomyces boulardii in adult patients", World journal of gastroenterology, 16(18), pp.2202 32 McFarland Lyrirtf V, Bernasconi P (1993), "Saccharomyces boulardii' A review of an innovative biotherapeutic agent", Microbial ecology in health disease, 6(4), pp.157-171 33 Nussinovitch A, Zvitov-Marabi, (2008), "Unique shape, surface and porosity of dried electrified alginate gels", Food hydrocolloids, 22(3), pp.364-372 34 Ouwehand Arthur C, Salminen Seppo, et al (2002), "Probiotics: an overview of beneficial effects", Lactic acid bacteria: genetics, metabolism applications, pp.279-289 35 Rowe Raymond C, Sheskey Paul, et al (2009), Handbook of pharmaceutical excipients, Libros Digitales-Pharmaceutical Press 36 Sazawal Sunil, Hiremath Girish, et al (2006), "Efficacy of probiotics in prevention of acute diarrhoea: a meta-analysis of masked, randomised, placebo-controlled trials", The Lancet infectious diseases, 6(6), pp.374382 37 Sinha VR, Singla Anil Kumar, et al (2004), "Chitosan microspheres as a potential carrier for drugs", International journal of pharmaceutics, 274(12), pp.1-33 38 Susanna Rokka, Pirjo Rantamäki (2010), "Protecting probiotic bacteria by microencapsulation: challenges for industrial applications", European Food Research Technology, 231(1), pp.1-12 39 van der Aa Kühle Alis, Jespersen Len (2003), "The taxonomic position of Saccharomyces boulardii as evaluated by sequence analysis of the D1/D2 domain of 26S rDNA, the ITS1-5.8 S rDNA-ITS2 region and the mitochondrial cytochrome-c oxidase II gene", Systematic Applied Microbiology, 26(4), pp.564-571 40 Yeul Vijay S, Rayalu Sadhana S (2013), "Unprecedented chitin and chitosan: A chemical overview", Journal of Polymers the Environment, 21(2), pp.606-614 41 Zimmermann Heiko, Shirley Stephen G, et al (2007), "Alginate-based encapsulation of cells: past, present, and future", Nature Communications, 7(4), pp.314-320 PHỤ LỤC Hình ảnh cắt ngang của mẫu vi nang ATC – ATC và ATC – AT chụp từ kính lúp soi nổi có độ phóng đại 20X Vi nang ATC – AT Vi nang ATC – ATC Hình ảnh nuôi cấy đếm VSV của mẫu ATC – AT và ATC – ATC Mẫu phá hạt ATC – AT Mẫu phá hạt ATC- ATC Mẫu lắc 2h SIF ATC – ATC Mẫu lắc 2h SIF ATC - AT Mẫu lắc 3h SIF ATC – AT Mẫu lắc 3h SIF ATC – ATC Sinh khối pha loãng 10-4 ... ĐA? ?I HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THỊ LINH MÃ SINH VI? ?N: 1601445 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG ĐA NHÂN CHỨA Saccharomyces boulardii THEO PHƯƠNG PHA? ?P TÁCH PHA ĐÔNG TỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... 2.2.1 Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii theo phương pha? ?p tách pha đông tụ 18 2.2.2 Đa? ?nh giá khả bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân 18 2.3 Phương pha? ?p. .. quan vi? ?̣c bao bọc và giải phóng hoạt chất so với các vi nang đơn nhân [21] Đề tài “ Khảo sát quá trình tạo vi nang đa nhân Saccharomyces boulardii theo phương pha? ?p tách pha đông