ĐÀO THỊ hà LAN NGHIÊN cứu một số yếu tố ẢNH HƯỞNG đến QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO đặc GIÀU ACID GALLIC TOÀN PHẦN từ NGŨ bội tử (galla chinensis) KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THỊ HÀ LAN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO ĐẶC GIÀU ACID GALLIC TỒN PHẦN TỪ NGŨ BỢI TỬ (Galla chinensis) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THỊ HÀ LAN Mã sinh viên: 1701293 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO ĐẶC GIÀU ACID GALLIC TỒN PHẦN TỪ NGŨ BỢI TỬ (Galla chinensis) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Hoàng Quỳnh Hoa ThS Phạm Thị Linh Giang Nơi thực hiện: Bộ môn Thực Vật HÀ NỢI - 2022 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn tới TS Hồng Quỳnh Hoa - Trưởng mơn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, người hướng dẫn định hướng cho ngày nghiên cứu khoa học môn Thực vật Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Phạm Thị Linh Giang - Giảng viên môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, người dành nhiều thời gian, tâm huyết để hướng dẫn, bảo động viên tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Cơ cịn chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm truyền cho niềm đam mê với nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Trần Trọng Biên – Giảng viên môn Công nghiệp Dược cho nhận xét, góp ý để tơi hồn thiện khóa luận Tơi xin cảm ơn thầy, anh chị công tác môn Thực vật giúp đỡ q trình thực khóa luận Cảm ơn bạn Đỗ Bá Đại, bạn em nghiên cứu môn Thực vật Dược học cổ truyền ln động viên, giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, phịng ban tồn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho thời gian qua Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè ủng hộ, động viên nguồn động lực to lớn để học tập, rèn luyện nghiên cứu trường Đại học Dược Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Đào Thị Hà Lan MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Ngũ bội tử 1.1.1 Phân bố loài đặc điểm dược liệu Galla chinensis 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụng dược lý 1.1.4 Tác dụng theo y học cổ truyền 1.2 Phương pháp định lượng acid gallic toàn phần sắc ký lỏng hiệu cao 1.3 Các nghiên cứu phương pháp chiết xuất acid gallic Ngũ bội tử 1.4 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 1.4.1 Phương pháp thay đổi yếu tố 1.4.2 Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 1.5 Phương pháp điều chế cao đặc 12 1.5.1 Khái niệm 12 1.5.2 Phương pháp điều chế cao đặc 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 15 2.1.1 Nguyên liệu 15 2.1.2 Hóa chất, thiết bị phần mềm 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1 Nội dung 1: Thẩm định phương pháp định lượng Acid gallic Ngũ bội tử 16 2.2.2 Nội dung 2: Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử 16 2.2.3 Nội dung 3: Khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu cho trình chiết xuất cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử 16 2.2.4: Nội dung 4: Điều chế cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ dịch chiết Ngũ bội tử 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp định lượng acid gallic toàn phần 16 2.3.2 Phương pháp thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần Dược liệu Ngũ bội tử 19 2.3.3 Phương pháp khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 20 2.3.4 Phương pháp khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu cho trình chiết xuất 21 2.3.5 Phương pháp điều chế cao đặc Ngũ bội tử 22 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần dược liệu Ngũ bội tử 24 3.1.1 Độ đặc hiệu 24 3.1.2 Sự phù hợp hệ thống 24 3.1.3 Độ tuyến tính 25 3.1.4 Độ lặp lại 26 3.1.5 Độ 27 3.1.6 Hàm lượng acid gallic toàn phần dược liệu Ngũ bội tử 28 3.2 Kết khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất 28 3.2.1 Khảo sát tỉ lệ dược liệu/dung môi 28 3.2.2 Khảo sát nhiệt độ chiết xuất 29 3.2.3 Khảo sát thời gian chiết xuất 30 3.2.4 Khảo sát dung môi chiết xuất 30 3.3 Kết khảo sát lựa chọn điều kiện tối ưu cho trình chiết xuất acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử 31 3.3.1 Kết thực nghiệm 31 3.3.2 Kết tối ưu hóa trình chiết xuất 32 3.3.3 Kết lựa chọn điều kiện tối ưu biến đầu vào 34 3.4 Kết điều chế cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử 35 3.4.1 Quy trình điều chế cao đặc giàu acid gallic tồn phần từ Ngũ bội tử 35 3.4.2 Kết 36 3.5 Bàn luận 36 3.5.1 Về phương pháp chiết xuất acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử 36 3.5.2 Về nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết xuất acid gallic tồn phần từ Ngũ bội tử 37 3.5.3 Về kết tối ưu hóa q trình chiết xuất acid gallic tồn phần từ Ngũ bội tử 39 3.5.4 Về ứng dụng việc tối ưu hóa trình chiết xuất acid gallic tồn phần từ Ngũ bội tử phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 40 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA Phương pháp phân tích phương sai (Analysis of variance) AOAC CCD GC Hiệp hội nhà hóa phân tích thống Mơ hình phức hợp trung tâm (Central composite design) Galla chinensis HPLC Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) OFAT KL Phương pháp thay đổi yếu tố (One factor at a time) Khối lượng RSD RSM SD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology) Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) Spic STT TB Diện tích pic Số thứ tự Trung bình tR Thời gian lưu DANH MỤC CÁC BẢNG STT Kí hiệu Tên bảng 1.1 Một số hợp chất tanin phân lập từ Ngũ bội tử 3.1 Kết khảo sát phù hợp hệ thống 24 3.2 25 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 10 3.8 Kết khảo sát độ tuyến tính Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp định lượng acid gallic Kết khảo sát độ phương pháp định lượng acid gallic Tóm tắt kết thẩm định phương pháp định lượng acid gallic toàn phần dịch chiết ngũ bội tử Thiết kế thí nghiệm kết thực nghiệm Kết phân tích phương sai ANOVA mơ hình biểu thị phụ thuộc hiệu suất chiết acid gallic vào biến đầu vào Kết kiểm định mơ hình thực nghiệm 11 3.9 Kết điều chế cao đặc Ngũ bội tử 36 Trang 26 27 27 32 33 35 DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ STT Kí hiệu 1.1 1.2 2.1 3.1 3.2 Tên hình Quy trình tối ưu hóa phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Phương pháp điều chế cao đặc Trang 23 3.3 Quy trình chiết xuất cao đặc Ngũ bội tử dự kiến Kết thẩm định độ đặc hiệu phương pháp định lượng Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích pic acid gallic Kết khảo sát tỉ lệ dược liệu/dung môi 3.4 Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất 29 3.5 Kết khảo sát thời gian chiết xuất 30 3.6 31 10 3.7 11 3.8 Kết khảo sát dung môi chiết xuất Đồ thị biểu diễn phụ thuộc hiệu suất chiết acid gallic toàn phần vào biến đầu vào Quy trình điều chế cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử 10 12 24 26 29 34 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngũ bội tử (Galla chinensis) dược liệu sử dụng phổ biến Y học cổ truyền Trung Quốc để chữa bệnh tiêu chảy, chảy máu, ho, nôn mửa, bệnh trĩ, sa hậu môn, sa tử cung Kinh nghiệm sử dụng nghiên cứu theo y học đại cho thấy Ngũ bội tử dược liệu tiềm việc điều trị bệnh lý có triệu chứng nhiễm khuẩn đặc biệt nhiễm khuẩn tiêu hóa, hơ hấp sâu [22] Trong Ngũ bội tử, tanin xem nhóm hoạt chất với nhiều tác dụng dược lý quan trọng kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, chống ung thư [22] Mặt khác, nhóm hoạt chất sau thủy phân tạo thành phân tử acid gallic Acid gallic nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng chống sâu răng, kháng khuẩn, kháng virus chống oxy hóa… [19] Hiện nay, điều chế cao dược liệu với hàm lượng hoạt chất cao xu hướng phát triển dược phẩm Do đó, để ứng dụng dược liệu Ngũ bội tử nhiều trình nghiên cứu phát triển chế phẩm chăm sóc sức khỏe với hướng tác dụng kháng khuẩn, việc nghiên cứu bào chế cao bán thành phẩm giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử cần thiết Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử (Galla chinensis)” thực với hai mục tiêu: Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng tối ưu hóa điều kiện chiết xuất acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử Bước đầu điều chế cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử quy mô 50g/mẻ dựa điều kiện chiết xuất khảo sát Đồ thị biểu diễn phụ thuộc hiệu suất chiết acid gallic toàn phần vào nhiệt độ chiết, thời gian chiết nồng độ Ethanol dung mơi chiết xuất trình bày hình Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc hiệu suất chiết acid gallic toàn phần vào biến đầu vào Trong đó, đồ thị A1, A2, A3 biểu thị phụ thuộc hiệu suất chiết acid gallic toàn phần vào: Thời gian chiết xuất - nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất nồng độ Ethanol dung môi, nhiệt độ chiết xuất - nồng độ Ethanol dung môi 3.3.3 Kết lựa chọn điều kiện tối ưu biến đầu vào Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) thu điều kiện chiết xuất để đạt hiệu suất chiết acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử tối ưu sau: - Nhiệt độ chiết xuất: 68,792ºC Thời gian chiết xuất: 37,626 phút Nồng độ Ethanol dung môi: 23,167% (tt/tt) Tại điều kiện này, hiệu suất chiết acid gallic toàn phần 86,928% Để phù hợp điều kiện thực tế, mơ hình kiểm định thực nghiệm lần với điều kiện sau: - Nhiệt độ chiết xuất: 69ºC Thời gian chiết xuất: 38 phút 34 - Nồng độ Ethanol dung mơi: 23% Kết kiểm định mơ hình thực nghiệm trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết kiểm định mơ hình thực nghiệm Giá trị dự đốn Giá trị thực nghiệm Độ xác (%) 86,928 93,127 ± 0,527 93,34 Hiệu suất chiết acid gallic tồn phần (%) Nhận xét: Độ xác giá trị dự đoán giá trị thực nghiệm hiệu suất chiết toàn phần từ Ngũ bội tử 93,34% Có thể thấy có chênh lệch giá trị hiệu suất acid gallic toàn phần thực nghiệm dự đoán 3.4 Kết điều chế cao đặc giàu acid gallic tồn phần từ Ngũ bội tử 3.4.1 Quy trình điều chế cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử Từ kết lựa chọn yếu tố mục 3.3, bước đầu tiến hành chiết xuất Ngũ bội tử với điều kiện tối ưu, tiến hành cô để tạo cao đặc Ngũ bội tử quy mơ 50g dược liệu/mẻ theo quy trình hình 3.8 Hình 3.8 Quy trình điều chế cao đặc giàu acid gallic tồn phần từ Ngũ bội tử Mơ tả quy trình Ngũ bội tử xay nhỏ, rây qua rây có kích thước mắt rây 1400μm 355μm Lấy phần bột lọt qua rây 1400μm không lọt qua rây 355μm để bột dược liệu nửa thô 35 Cân 50g bột dược liệu vào bình thủy tinh nút mài, bổ sung 1000ml dung môi EtOH 23% khuấy Chiết siêu âm nhiệt độ 69ºC, thời gian 38 phút Sau đó, lọc lấy dịch chiết Cơ cách thủy dịch chiết thu cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử Tiến hành điều chế 03 mẻ Mỗi mẻ đánh giá cảm quan, độ ẩm hàm lượng acid gallic toàn phần cao 3.4.2 Kết Sau điều chế, nhận thấy cao đặc Ngũ bội tử khối đặc quánh, màu nâu, có mùi đặc trưng Kết hiệu suất điều chế cao, hàm ẩm, hàm lượng acid gallic toàn phần cao trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết điều chế cao đặc Ngũ bội tử STT KL dược liệu (g) KL cao điều chế (g) Hàm ẩm cao (%) Hiệu suất điều chế cao (%) Hàm lượng acid gallic toàn phần (%) 50,0450 38,0807 7,74 75,83 54,17 50,0065 37,8914 8,34 75,02 53,87 49,9880 35,3859 7,51 70,72 57,91 TB 7,86 73,86 55,31 SD 0,43 2,75 2,25 RSD (%) 5,45 3,72 4,07 Nhận xét: - Cao đặc thu đạt tiêu cảm quan - Hiệu suất chiết cao: 73,86 ± 2,75 (%) - Hàm lượng acid gallic toàn phần cao: 55,31 ± 2,25 (%) 3.5 Bàn luận 3.5.1 Về phương pháp chiết xuất acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử Việc chiết xuất acid gallic từ Ngũ bội tử nhiều tác giả thực với nhiều phương pháp khác Cụ thể, quy trình chiết xuất trực tiếp với dung mơi nước có ưu điểm đơn giản, khơng tồn dư dung mơi Tuy nhiên phương pháp có hiệu suất chiết không cao (49,3%), đồng thời yêu cầu thời gian chiết xuất dài (3 giờ) lượng tạp chất dịch 36 chiết cao Nếu chiết xuất trực tiếp với dung mơi acetone, hiệu suất chiết lên đến 93,91% tồn dư dung mơi làm giảm độ an toàn dịch chiết thu Vì đề tài lựa chọn phương pháp chiết xuất trực tiếp để chiết xuất acid gallic từ Ngũ bội tử, nhiên có thay đổi dung môi chiết xuất Về lựa chọn dung môi chiết xuất, ethanol dung mơi có giá thành phù hợp, thu hồi ứng dụng nhiều công nghiệp Mặt khác, ethanol điều chỉnh độ phân cực phù hợp với hoạt chất cần chiết cách thay đổi tỷ lệ ethanol nước Do đó, nghiên cứu lựa chọn ethanol làm dung môi khảo sát Ngồi ra, phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm giúp giảm thời gian chiết, cho hiệu suất cao, đồng thời thiết bị phổ biến, phù hợp với quy mơ phịng thí nghiệm Do đó, để đảm bảo thu sản phẩm chiết với chất lượng tốt, hiệu suất cao mà đáp ứng yêu cầu an toàn với môi trường, sức khỏe phù hợp với sản xuất thực tế, đề tài định lựa chọn phương pháp chiết acid gallic dung mơi ethanol có hỗ trợ sóng siêu âm Kết quả, điều kiện chiết xuất tối ưu dung môi ethanol 23% (tt/tt) nhiệt độ 69ºC, thời gian 38 phút, hiệu suất chiết acid gallic toàn phần lên đến 86,928% So sánh với nghiên cứu trước đây, nhận thấy phương pháp chiết xuất giúp tiết kiệm đáng kể thời gian chiết Trong khi, phương pháp chiết nước yêu cầu thời gian chiết lên đến giờ, chiết xuất CO2 siêu tới hạn yêu cầu chiết xuất 120 phút phương pháp chiết xuất có áp suất cần tiến hành 100 phút Bên cạnh đó, hiệu suất chiết phương pháp khảo sát cao (86,9%), cao đáng kể so với phương pháp chiết nước không hỗ trợ siêu âm (49,3%) 3.5.2 Về nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử Về kết nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất: Tỉ lệ dược liệu/dung môi Nếu tăng tỉ lệ dược liệu/dung mơi, lượng hoạt chất hịa tan tăng, đồng thời hiệu suất khuếch tán chất tan tăng, dẫn đến tăng hiệu suất chiết Tuy nhiên, dùng nhiều dung mơi chiết, dịch chiết lỗng dẫn đến khó thu sản phẩm, tốn dung môi thời gian loại dung mơi, ngồi ảnh hưởng đến độ ổn định hoạt chất Do đó, cần nghiên cứu để tối ưu hóa tỉ lệ dược liệu/dung mơi để thu dịch chiết với nồng độ tối ưu, đồng thời tiết kiệm thời gian dung môi chiết Theo kết khảo sát, tỉ lệ 1/20, hiệu suất chiết acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử cao Nhiệt độ chiết xuất Tăng nhiệt độ chiết xuất có tác dụng làm giảm độ nhớt sức căng bề mặt, từ tăng tính thấm dung mơi vào tế bào dược liệu, đồng thời tăng độ tan tốc độ khuếch tán hoạt chất từ dược liệu môi trường, giúp tăng tốc độ chiết tăng hiệu suất chiết 37 Tuy nhiên, nhiệt độ tăng gây số bất lợi phá hủy hoạt chất bền với nhiệt, đồng thời tăng độ tan tạp chất khiến dịch chiết nhiều tạp Bên cạnh đó, nhiệt độ cao làm bay dung môi ethanol (mặc dù chiết bình thủy tinh có đậy nắp kín bay dung môi đọng nắp), làm giảm độ tan hoạt chất giảm hiệu suất chiết Trong sản xuất cơng nghiệp với dung mơi có ethanol, nhiệt độ chiết xuất cao thiết bị cần có u cầu kỹ thuật phức tạp để đảm bảo an toàn Vì vậy, nhiệt độ chiết xuất ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, nên chọn yếu tố để nghiên cứu ảnh hưởng đến trình chiết xuất Kết là, nhiệt độ 70ºC, hiệu suất chiết acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử cao nhất, tăng nhiệt độ lên 80ºC, hiệu suất chiết giảm Kết phù hợp với lý thuyết trình bày Thời gian chiết xuất Thông thường, hoạt chất cần thời gian để khuếch tán từ dược liệu môi trường Khi đạt cân chiết (hàm lượng hoạt chất dược liệu cân với mơi trường), q trình khuếch tán dừng lại Lúc này, hiệu suất chiết cao Ngồi ra, hoạt chất thường có khối lượng phân tử nhỏ tạp chất nên khuếch tán nhanh đạt cân chiết sớm Nên thời gian chiết lâu, hàm lượng hoạt chất chiết không tăng mà tăng tỉ lệ tạp chất, đồng thời tăng nguy phân hủy hoạt chất bền, gây ảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết hiệu suất chiết Do đó, cần khảo sát thời gian chiết xuất tối ưu để thu dịch chiết có hàm lượng chất lượng cao Kết cho thấy, thời gian chiết xuất 40 phút cho hiệu suất chiết acid gallic toàn phần cao nhất, kéo dài thời gian chiết hiệu suất chiết giảm, phù hợp với lý thuyết Nồng độ Ethanol dung môi Thành phần tanin Ngũ bội tử có cấu trúc phức tạp với nhiều hợp chất khác nhau, tùy thuộc vào số lượng gốc acid gallic thêm vào phân tử đường trung tâm mà tạo chất có độ phân cực khác Do đó, nghiên cứu nồng độ Ethanol để tìm dung mơi có khoảng phân cực thích hợp với cấu trúc tỷ lệ thành phần nhóm tanin Ngũ bội tử, giúp chiết xuất hoạt chất tối đa tạp chất tối thiểu Kết cho thấy, dung mơi có nồng độ Ethanol 25% cho hiệu suất chiết acid gallic toàn phần cao Ngoài ra, kích thước dược liệu ảnh hưởng đến hiệu suất chiết acid gallic toàn phần Chia nhỏ dược liệu làm tăng diện tích tiếp xúc dược liệu dung môi, làm giảm quãng đường khuếch tán, tăng tỉ lệ tế bào bị phá vỡ để tăng tốc độ chiết xuất Vì vậy, kích thước dược liệu nhỏ giúp giảm thời gian chiết, tăng hiệu suất chiết tiết kiệm dung môi Tuy nhiên, dược liệu mịn dễ bết dính vón cục, khó thấm dung mơi, khó khuấy trộn khó rút dịch chiết, dẫn đến giảm hiệu suất chiết 38 Trong thực tế, dược liệu Ngũ bội tử chất giịn dễ nghiền nhỏ, tạo thành bột nửa thô Việc xay để tạo kích thước mịn vừa tốn cơng vừa gây bất lợi trình chiết xuất thu dịch chiết Do đó, đề tài khơng khảo sát ảnh hưởng kích thước dược liệu đến hiệu suất chiết acid gallic tồn phần mà sử dụng kích thước bột nửa thơ để tiến hành khảo sát Về phương pháp khảo sát, yếu tố tỉ lệ dược liệu/dung môi, nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất nồng độ Ethanol dung môi nghiên cứu ảnh hưởng đến trình chiết xuất phương pháp thay đổi yếu tố (OFAT) Phương pháp có ưu điểm thiết kế thí nghiệm đơn giản, dễ thực khơng địi hỏi thống kê, phân tích liệu Phương pháp thích hợp với biến nhận vài giá trị cụ thể Do vậy, số lượng yếu tố cần khảo sát khơng nhiều, biến hồn tồn độc lập ảnh hưởng yếu tố gây nhiễu nhỏ so với yếu tố khảo sát, phương pháp thay đổi yếu tố lựa chọn [7] Tuy nhiên, việc tối ưu hóa quy trình sản xuất phương pháp OFAT tốn thời gian chi phí, đặc biệt có nhiều yếu tố cần khảo sát Khi yếu tố khảo sát có tương tác lẫn nhau, kết khơng xác [24] Ngồi ra, phương pháp đưa điều kiện tối ưu nằm giá trị khảo sát Do đó, yếu tố có khoảng khảo sát rộng, việc tìm điều kiện tối ưu khó khả thi [7] Để khắc phục nhược điểm trên, loạt phương pháp thiết kế thí nghiệm dựa nguyên lý thống kê đưa Một phương pháp sử dụng phổ biến phương pháp bề mặt đáp ứng 3.5.3 Về kết tối ưu hóa q trình chiết xuất acid gallic tồn phần từ Ngũ bội tử Các yếu tố nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất nồng độ Ethanol dung môi biến liên tục Do đó, khảo sát lựa chọn điều kiện chiết tối ưu sử dụng phương pháp thay đổi yếu tố cần làm nhiều thí nghiệm, gây tốn Vì vậy, phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng Thiết kế thí nghiệm theo mơ hình CCD cho phép đánh giá đầy đủ xác vai trị yếu tố tới biến đầu với số lượng thí nghiệm giảm đáng kể so với phương pháp khác, giúp tiết kiệm thời gian, cơng sức chi phí [18], [39] Có thể thấy, với biến đầu vào, biến có mức yếu tố, thiết kế theo mơ hình đầy đủ, số thí nghiệm cần thực tối thiểu 3³ = 27 Trong đó, theo mơ hình CCD, cần N = 2³ + 2.3 + = 20 thí nghiệm (6 thí nghiệm tâm nhằm đánh giá khả lặp lại mô hình) Với phương pháp bề mặt đáp ứng, mơ hình xây dựng có ý nghĩa thống kê, việc tìm điều kiện chiết xuất tối ưu trở nên dễ dàng, có độ xác cao Về kết quả, mơ hình xây dựng mục 3.3.2 có hệ số R2 0,9336 cho thấy khoảng 93% lượng acid gallic tồn phần phụ thuộc vào mơ hình, khoảng 7% khơng 39 giải thích mơ hình Điều q trình tiến hành thí nghiệm, số thao tác, thiết bị gây sai số: - Máy siêu âm có tần số sóng khơng ổn định Q trình chiết siêu âm lúc 10 - mẫu, hiệu suất chiết thấp chiết lúc với số mẫu Quy trình định lượng có thêm bước thủy phân gây sai số lớn Thời gian thủy phân kéo dài 3,5 Mặc dù nhóm nghiên cứu cố gắng cố định điều kiện nhiệt độ trình thủy phân mẫu chênh lệch nhiều yếu tố từ môi trường thiết bị đun, dẫn đến sai số Hiệu suất chiết acid gallic tồn phần tối ưu hóa 86,928%, kết khảo sát yếu tố tỉ lệ dược liệu/dung môi, nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất dung mơi chiết xuất, hiệu suất chiết lên đến 92,53% Tuy nhiên, kiểm định mô hình xây dựng thực nghiệm, hiệu suất chiết điều kiện tối ưu khảo sát 93,127%, chênh lệch so với dự đốn mơ hình Điều giải thích sai số thiết bị Trong trình thực nghiệm, nhận thấy chiết xuất máy siêu âm, số lượng mẫu chiết mẻ ảnh hưởng đến hiệu suất siêu âm, dẫn đến ảnh hưởng đến hiệu suất chiết Do đó, nhóm nghiên cứu tiến hành thí nghiệm so sánh điều kiện để giảm thiểu sai số 3.5.4 Về ứng dụng việc tối ưu hóa q trình chiết xuất acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Từ kết nghiên cứu điều kiện tối ưu để chiết xuất acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử, tiến hành điều chế cao đặc giàu acid gallic toàn phần Đây bước đầu quy trình hồn thiện sản phẩm có tác dụng điều trị, đặc biệt sản phẩm có tác dụng kháng khuẩn chứa hàm lượng cao acid gallic toàn phần Ban đầu, nhóm nghiên cứu chưa xác định dung mơi chiết xuất dược liệu tối ưu dự đốn khó khăn q trình điều chế cao khơ, nên bước đầu tiến hành điều chế cao đặc Ngũ bội tử Tuy nhiên, trình thực nghiệm, nhận thấy dịch chiết Ngũ bội tử dễ dàng đặc tạo cao khơ Do đó, nghiên cứu đề xuất tiếp tục nghiên cứu điều chế cao khô Ngũ bội tử để tạo sản phẩm cao khô Ngũ bội tử có hàm lượng hoạt chất cao, đồng thời vận chuyển sử dụng dễ dàng Về kết điều chế cao, nhận thấy hiệu suất chiết cao quy mô 50g/mẻ đạt hiệu suất 73,86 ± 2,75%, thấp hiệu suất chiết acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử theo mơ hình tối ưu Kết bị ảnh hưởng điều kiện chiết xuất thiết bị chiết xuất: Khối lượng dược liệu thể tích dung mơi tăng lên 20 lần công suất, tần số thiết bị siêu âm không thay đổi Mặt khác, thể tích lớn nên hạn chế việc tiếp xúc sóng siêu âm vào tồn thể tích dịch chiết dẫn đến giảm hiệu suất chiết Do 40 đó, hàm lượng acid gallic cao đạt 55,31 ± 2,25 (%) Để khắc phục tượng điều kiện thiết bị nghiên cứu cố định, nhóm nghiên cứu đề xuất cần hồn thiện nghiên cứu cách tăng số lần chiết thay đổi tỷ lệ dược liệu dung môi với điều kiện khảo sát để tăng hàm lượng acid gallic tồn phần cao đặc Thời gian có hạn nên nhóm nghiên cứu chưa thực hoạt động Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu hồn thiện quy trình điều chế cao dược liệu có hàm lượng acid gallic cao từ Ngũ bội tử để đưa vào ứng dụng Trong trinh định lượng, nhóm nghiên cứu tiến hành định lượng đồng thời hàm lượng acid gallic tự acid gallic toàn phần cao đặc Ngũ bội tử Kết cho thấy, hàm lượng acid gallic toàn phần 0, 5531 (g/g) hàm lượng acid gallic tự 0,1146 (g/g) Tanin gallic tự Ngũ bội tử có nhiều nghiên cứu khả kháng khuẩn, nhiên, sử dụng theo đường uống, dược liệu nhiều tanin thường gây tác dụng phụ táo bón làm giảm tiết dịch giảm nhu động ruột [45] Do đó, có thể, cần tiến hành khảo sát cụ thể phương pháp điều chế cao (pH, nhiệt độ) nhằm tạo cao đặc có hàm lượng tanin vừa có tác dụng kháng khuẩn phù hợp để đảm bảo hiệu kháng khuẩn vừa hạn chế tác dụng không mong muốn kể chế phẩm 41 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau thời gian triển khai thực hiện, đề tài hoàn thành mục tiêu đề thu kết quả: Đã khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử, bao gồm: tỉ lệ dược liệu/dung môi, nhiệt độ, thời gian dung mơi chiết xuất Từ đó, lựa chọn điều kiện tối ưu để chiết xuất acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử phương pháp bề mặt đáp ứng sau: - Nhiệt độ chiết xuất: 69ºC Thời gian chiết xuất: 38 phút - Nồng độ Ethanol dung môi: 23% (tt/tt) Bước đầu điều chế cao đặc giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử quy mô 50g/mẻ dựa điều kiện chiết xuất khảo sát với hiệu suất chiết cao 73,86 ± 2,75 % hàm lượng acid gallic toàn phần cao 55,31 ± 2,25% KIẾN NGHỊ Nghiên cứu hồn thiện quy trình điều chế cao đặc giàu acid gallic từ Ngũ bội tử, sau nâng cấp chiết xuất quy mô pilot quy mô công nghiệp Tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn cao đặc Ngũ bội tử 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ môn Dược học cổ truyền Dược học cổ truyền Nhà xuất Y học, Hà Nội, pp Bộ môn Dược liệu (2010), Dược liệu học Trường Đại học Dược Hà Nội, pp 489-490 Bộ Y tế, Dược điển Việt Nam V 2017, Nhà xuất Y học: Hà Nội Tiếng Anh Ahn YJ, Kwon JH, et al (1994), "Growth-inhibitory responses of human intestinal bacteria to extracts of oriental medicinal plants", 7(5), pp 257-261 Buziashvili I Sh, Komissarenko NF, et al (1973), "The structure of gallotannins", 9(6), pp 752-755 Chen Jaw-Chyun, Ho Tin-Yun, et al (2006), "Anti-diarrheal effect of Galla Chinensis on the Escherichia coli heat-labile enterotoxin and ganglioside interaction", 103(3), pp 385-391 Czitrom Veronica J The American Statistician (1999), "One-factor-at-a-time versus designed experiments", 53(2), pp 126-131 Djakpo Odilon, Yao Weirong J Phytotherapy Research (2010), "Rhus chinensis and Galla Chinensis –folklore to modern evidence", 24(12), pp 1739-1747 Duan Deliang, Li Zhengquan, et al (2004), "Antiviral compounds from traditional Chinese medicines Galla chinensis as inhibitors of HCV NS3 protease", 14(24), pp 6041-6044 10 Gunst Richard F, Response surface methodology: process and product optimization using designed experiments 1996, Taylor & Francis 11 Huang Zhengwei, Zhou Xuedong, et al (2003), "The effects of traditional Chinese medicines on the adherence of Streptococcus mutans to salivary acquired pellicle in vitro", 34(1), pp 135-137 12 Int AOAC International Methods Committee J AOAC (2011), "Standard method performance requirements-AOAC International methods committee guidelines for validation of biological threat agent methods and/or procedures", 94, pp 1359-1381 13 Kang Mi-Sun, Oh Jong-Suk, et al (2008), "Inhibitory effect of methyl gallate and gallic acid on oral bacteria", 46(6), pp 744-750 14 Kwon O Jun, Bae Jong-Sup, et al (2013), "Pancreatic lipase inhibitory gallotannins from Galla rhois with inhibitory effects on adipocyte differentiation in 3T3-L1 cells", 18(9), pp 10629-10638 15 Li CY, Ding WJ, et al (2008), "Study on the chemical constituents of Galla chinensis Chinese Herbal Medicine", pp 1129-1132 16 LI Zhongxing, WANG Xiuhua, et al (1993), "In-vitro antibacterial activity of ethanol-extract of Galla chinensis against Staphycoccus aureus", pp 17 Liu TJ, The Microbiology Basis of Oral Disease 1999, People's Medical Publishing House, Beijing 18 Myers Raymond H, Montgomery Douglas C, et al (2016), Response surface methodology: process and product optimization using designed experiments, John Wiley & Sons, pp 19 Nabavi Seyed Fazel, Habtemariam Solomon, et al (2012), "Protective role of gallic acid on sodium fluoride induced oxidative stress in rat brain", 89(1), pp 73-77 20 Pan Tingshuang, Yan Maocang, Aquaculture International (2020), "The screening of traditional Chinese herbs on nonspecific immune response and protection of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) from Vibrio harveyi infection", 28(2), pp 767776 21 Paolini Alessandro, Curti Valeria, et al (2015), "Gallic acid exerts a protective or an anti-proliferative effect on glioma T98G cells via dose-dependent epigenetic regulation mediated by miRNAs", 46(4), pp 1491-1497 22 Ren Yuan-yuan, Zhang Xiao-rui, et al (2021), "Galla Chinensis, a Traditional Chinese Medicine: Comprehensive review of botany, traditional uses, chemical composition, pharmacology and toxicology", 278, pp 114247 23 Russell Larry H, Mazzio Elizabeth, et al (2012), "Autoxidation of gallic acid induces ROS-dependent death in human prostate cancer LNCaP cells", 32(5), pp 15951602 24 Saha Shyama Prasad, Mazumdar Deepika, Biocatalysis, et al (2019), "Optimization of process parameter for alpha-amylase produced by Bacillus cereus amy3 using one factor at a time (OFAT) and central composite rotatable (CCRD) design based response surface methodology (RSM)", 19, pp 101168 25 Sun Kai, Song Xu, et al (2018), "Evaluation of analgesic and anti-inflammatory activities of water extract of Galla chinensis in vivo models", 2018, pp 26 Tian Fang, Li Bo, et al (2009), "Antioxidant and antimicrobial activities of consecutive extracts from Galla chinensis: The polarity affects the bioactivities", 113(1), pp 173-179 27 WANG Dong-Mei, Chinese Traditional, Drugs Herbal (2013), "Activity of antiepidermal growth factor receptor in Galla Chinensis and UPLC/Q-TOF-MS analysis on its effective part", pp 2515-2519 28 Wang Ke, Zhu Xue, et al (2014), "Investigation of gallic acid induced anticancer effect in human breast carcinoma MCF‐7 cells", 28(9), pp 387-393 29 Weng Shu-Wen, Hsu Shu-Chun, et al (2015), "Gallic acid induces DNA damage and inhibits DNA repair-associated protein expression in human oral cancer SCC-4 cells", 35(4), pp 2077-2084 30 Wu-Yuan CD, Chen CY, et al (1988), "Gallotannins inhibit growth, water-insoluble glucan synthesis, and aggregation of Mutans Streptococci", 67(1), pp 51-55 31 Wu Jian, Jahncke Michael L, et al (2016), "Pomegranate peel (Punica granatum L) extract and Chinese gall (Galla chinensis) extract inhibit Vibrio parahaemolyticus and Listeria monocytogenes on cooked shrimp and raw tuna", 59, pp 695-699 32 Wu Shizhou, Liu Yunjie, et al (2019), "The pathogenicity and transcriptome analysis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in response to water extract of Galla chinensis", 2019, pp 33 Xiao Wenjun Shengda, Gong Zhihua, Yang Li, Wang Keqin, Deng Yanli (2013), "Method for extracting Galla chinensis tannic acid with assistance of radiation pretreatment", pp 34 Yang Hu-Ping, Chen Xi, et al (2016), Study on the optimization and management of electricity purchase in jiangxi province based on the electricity markets, 2016 IEEE 20th International Conference on Computer Supported Cooperative Work in Design (CSCWD), IEEE,pp 566-569 35 Yap Ling Sze, Lee Wai Leng, et al (2021), "Optimization of L-asparaginase production from endophytic Fusarium proliferatum using OFAT and RSM and its cytotoxic evaluation", 191, pp 106358 36 Yeh Ru-Duan, Chen Jung-Chou, et al (2011), "Gallic acid induces G0/G1 phase arrest and apoptosis in human leukemia HL-60 cells through inhibiting cyclin D and E, and activating mitochondria-dependent pathway", 31(9), pp 2821-2832 37 You Bo Ra, Park Woo Hyun, Journal of agricultural, et al (2011), "The effects of mitogen-activated protein kinase inhibitors or small interfering RNAs on gallic acidinduced HeLa cell death in relation to reactive oxygen species and glutathione", 59(2), pp 763-771 38 Zhang Tieting, Chu Jinpu, et al (2015), "Anti‐carious effects of Galla chinensis: A systematic review", 29(12), pp 1837-1842 39 Bhattacharya Sankha (2021), "Central composite design for response surface methodology and its application in pharmacy", Response surface methodology in engineering science, IntechOpen, pp 40 Hao Jifu, Wang Fugang, et al (2012), "Development and optimization of baicalinloaded solid lipid nanoparticles prepared by coacervation method using central composite design", 47(2), pp 497-505 41 Juntachote T, Berghofer Emmerich, et al (2006), "The application of response surface methodology to the production of phenolic extracts of lemon grass, galangal, holy basil and rosemary", 41(2), pp 121-133 42 Lambert Joshua D, Elias Ryan J, Archives of biochemistry, et al (2010), "The antioxidant and pro-oxidant activities of green tea polyphenols: a role in cancer prevention", 501(1), pp 65-72 43 Sarapultsev PA, Chupakhin ON, et al (2015), "The impact of immunomodulator compound from the group of substituted thiadiazines on the course of stress reaction", 25(2), pp 440-449 44 Wu Peng-fei, Zhang Zui, et al (2010), "Natural compounds from traditional medicinal herbs in the treatment of cerebral ischemia/reperfusion injury", 31(12), pp 1523-1531 45 Yang Yi, Luo Huihui, et al (2017), "Preparation of Galla Chinensis oral solution as well as its stability, safety, and antidiarrheal activity evaluation", 2017, pp PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phiếu giám định tên dược liệu ... HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THỊ HÀ LAN Mã sinh viên: 1701293 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO ĐẶC GIÀU ACID GALLIC TỒN PHẦN TỪ NGŨ BỢI TỬ (Galla chinensis) KHÓA LUẬN... chế cao bán thành phẩm giàu acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử cần thiết Vì vậy, đề tài ? ?Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất cao đặc giàu acid gallic tồn phần từ Ngũ bội tử (Galla. .. chiết xuất acid gallic toàn phần từ Ngũ bội tử 36 3.5.2 Về nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết xuất acid gallic tồn phần từ Ngũ bội tử 37 3.5.3 Về kết tối ưu hóa q trình