ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG bảo vệ VI SINH vật TRONG ĐƢỜNG TIÊU hóa của VI NANG ĐÔNG tụ ALGINAT – INULIN KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dƣợc sĩ

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ OANH ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO VỆ VI SINH VẬT TRONG ĐƢỜNG TIÊU HĨA CỦA VI NANG ĐƠNG TỤ ALGINAT – INULIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ OANH MÃ SINH VIÊN: 1401467 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO VỆ VI SINH VẬT TRONG ĐƢỜNG TIÊU HĨA CỦA VI NANG ĐƠNG TỤ ALGINAT – INULIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Kiều Thị Hồng Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dƣợc HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực hoàn thành tổ Vi sinh - Bộ môn Công nghiệp Dược Trong suốt thời gian thực khóa luận, tơi nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ thầy cô, bạn bè gia đình Với tất kính trọng lòng biết ơn, tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ths Kiều Thị Hồng PGS TS Đàm Thanh Xuân, người thầy ln tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ từ ngày tơi hồn thành khóa luận Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn thầy giáo anh chị kỹ thuật viên môn Công nghiệp Dƣợc Viện Công Nghệ Dƣợc Phẩm Quốc Gia tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho thời gian học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân bạn bè ln động viên, ủng hộ tơi q trình học tập sống Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Oanh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng probiotic 1.1.1 Khái niệm probiotic .2 1.1.2 Các chủng probiotic phổ biến 1.1.3 Các hệ bào chế chế phẩm probiotic 1.2 Đại cƣơng prebiotic 1.2.1 Khái niệm prebiotic .4 1.2.2 Phân loại prebiotic 1.2.3 Tác dụng prebiotic với sức khỏe .6 1.3 Loài Lactobacillus acidophilus .7 1.3.1 Đặc điểm hình thái điều kiện nuôi cấy .7 1.3.2 Vai trò 1.4 Khái niệm vi nang vi nang hóa .8 1.4.1 Định nghĩa .8 1.4.2 Đặc điểm vi nang 1.4.3 Ưu điểm vi nang 10 1.4.4 Nhược điểm vi nang 10 1.4.5 Phương pháp vi nang hóa 10 1.4.6 Phương pháp tách pha đông tụ 11 1.5 Một số thành phần sử dụng vi nang probiotic .12 1.5.1 Alginat 12 1.5.2 Tinh bột 13 1.5.3 Chitosan .13 1.5.4 Inulin 14 1.6 Một số nghiên cứu sử dụng vi nang calci alginat phối hợp với tinh bột prebiotic 16 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.1 Nguyên liệu thiết bị 18 2.1.1 Chủng vi sinh vật 18 2.1.2 Hóa chất .18 2.1.3 Môi trường sử dụng nghiên cứu 18 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 19 2.1.5 Các dung dịch sử dụng nghiên cứu 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.2.1 Tạo vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin theo phương pháp tách pha đông tụ 20 2.2.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin dịch tiêu hóa mơ 20 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .20 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn .20 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 21 2.3.3 Phương pháp tạo vi nang .21 2.3.4 Phương pháp đông khô 22 2.3.5 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV 22 2.3.6 Phương pháp xác định hàm ẩm 23 2.3.7 Phương pháp xác định hình ảnh bề mặt vi nang kính lúp soi .23 2.3.8 Phương pháp đánh giá khả bảo vệ VSV môi trường dịch dày mô 24 2.3.8.1 Phương pháp định tính tinh bột thuốc thử Lugol .24 2.3.8.2 Phương pháp xác định mức độ trương nở vi nang môi trường dịch dày mô 24 2.3.9 Phương pháp đánh giá khả giải phóng VSV vi nang mơi trường dịch tiêu hóa mơ 25 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 26 3.1 Tạo vi nang alginat - tinh bột - chitosan - inulin chứa Lactobacillus acidophilus theo phƣơng pháp tách pha đông tụ .26 3.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin dịch tiêu hóa mơ 38 3.2.1 Đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin môi trường dịch dày mô 38 3.2.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin dịch tiêu hóa mơ .41 KẾT LUẬN 47 ĐỀ XUẤT .47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Alg : Alginat ATCC : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ (American Type Culture Collection) B infantis : Bifidobacterium infantis B longum : Bifidobacterium longum CFU : Số đơn vị khuẩn lạc (Colony Forming Units) CTS : Chitosan FAO : Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) In : Inulin ISAPP : Hiệp hội khoa học quốc tế Probiotic Prebiotic kl/tt : Khối lượng/thể tích L acidophilus : Lactobacillus acidophilus L casei : Lactobacillus casei L plantarum : Lactobacillus plantarum L rhamnosus : Lactobacillus rhamnosus MRS : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe) MT : Môi trường SGF : Dịch dày mô (Simulated Gastric Fluid) SIF : Dịch ruột mô (Simulated Intestinal Fluid) TB : Tinh bột VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật WHO : Tổ chức y tế giới (World Health Organization) WGO : Tổ chức Vị tràng học giới (World Gastroenterology Organization) DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc FOS Hình 1.2 Quá trình tạo thành GOS Hình 1.3 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus kính hiển vi điện tử .8 Hình 1.4 Cấu trúc alginat .12 Hình 1.5 Cấu trúc phân tử chitin chitosan .14 Hình 1.6 Cấu trúc hóa học Inulin 15 Hình 3.1 Ảnh chụp camera thường mẫu vi nang AI0-C, AI1-C AI3-C sau đông khô 28 Hình 3.2 Ảnh chụp kính lúp soi có độ phóng đại 10X mẫu vi nang AI0C, AI1-C AI3-C 29 Hình 3.3 Hình ảnh bề mặt mẫu vi nang AI3-C, AC AI3 quan sát camera thường 32 Hình 3.4 Hình ảnh bề mặt mẫu vi nang AI3-C, AC AI3 quan sát kính lúp soi có độ phóng đại 10X 32 Hình 3.5 Biểu đồ thể hàm ẩm vi nang AI3-C AI3 thời gian bảo quản .34 Hình 3.6 Biểu đồ thể số lượng VSV trung bình sau đơng khơ sau tháng bảo quản vi nang AI3-C .36 Hình 3.7 Mẫu vi nang AI3-C trước sau lắc môi trường dịch dày mô thời gian 30 phút 39 Hình 3.8 Mẫu vi nang AI3-C sau ủ 30 phút môi trường dịch dày mô dịch ruột mô 42 Hình 3.9 Biểu đồ thể số lượng VSV trung bình giải phóng sau ủ dịch tiêu hóa mô vi nang AI3-C 43 Hình 3.10 Khuẩn lạc Lactobacillus acidophilus môi trường MRS thạch 43 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Nguyên liệu hóa chất sử dụng 18 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng nghiên cứu .19 Bảng 3.1.Thành phần tinh bột inulin vi nang khảo sát .26 Bảng 3.2 Hàm ẩm vi nang AI0-C, AI1-C AI3-C sau đông khô (%) 29 Bảng 3.3 Công thức mẫu vi nang AC, AI, AI3-C .31 Bảng 3.4 Đường kính mẫu vi nang AI3-C, AC AI3 sau đông khô 32 Bảng 3.5 Hàm ẩm mẫu vi nang AI3-C AI3 thời gian bảo quản 34 Bảng 3.6 Số lượng tế bào L acidophilus vi nang AI3-C sau đông khô trình bảo quản 35 Bảng 3.7 Đường kính vi nang AI3-C AC trước sau lắc dịch dày mô .39 Bảng 3.8 Số lượng VSV sống sót vi nang AI3-C sau đông khô, sau ủ dịch dày mô dịch ruột mô 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Đường tiêu hóa người bị chiếm lĩnh hệ sinh thái phức tạp vi khuẩn Việc đưa probiotic, prebiotic hay synbiotic vào chế độ ăn uống người giúp tạo ra, phục hồi trì cân vi sinh vật đường tiêu hóa [41] Chúng cung cấp từ rau sống, trái sản phẩm từ sữa Một nguồn khác từ số dược phẩm hay thực phẩm chức Tiềm điều trị vi khuẩn probiotic phụ thuộc vào khả sống sót chúng q trình sản xuất bảo quản Khi đưa vào thể theo đường uống, số lượng vi sinh vật sống sót bị ảnh hưởng nhiều yếu tố như: pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật cản trở cân vi sinh đường ruột Trên giới, nhiều nghiên cứu tiến hành nhằm tăng khả chống chịu vi khuẩn trước điều kiện bất lợi Vi nang hóa q trình bất động ngun liệu khn gói, bảo vệ vi sinh vật chống lại môi trường khắc nghiệt Phương pháp tạo vi nang alginat – tinh bột đông khô phương pháp đơn giản, sử dụng phổ biến nay, có khả bao gói lượng lớn vi khuẩn, cải thiện số lượng VK sau đông khô, bảo vệ VK thời gian bảo quản qua mơi trường khắc nghiệt đường tiêu hóa [38] Việc sử dụng chitosan làm vật liệu bao gói giúp bảo vệ, tăng khả sống sót vi sinh vật, hạn chế tác động acid dịch vị muối mật Công thức vi nang bổ sung inulin với nồng độ phù hợp làm tăng khả bảo vệ vi khuẩn với pH acid, giúp hình thành chế phẩm synbiotic đường uống với kiểm sốt giải phóng đến đại tràng Xuất phát từ lí trên, đề tài ―Đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa vi nang đơng tụ Alginat – Inulin ” thực với mục tiêu sau:  Tạo vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin chứa Lactobacillus acidophilus theo phương pháp tách pha đông tụ  Đánh giá khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin dịch tiêu hóa mơ tiêu dịch acid khơng thấy có mặt tinh bột khơng phát tế bào Lactobacillus acidophilus Kết từ bảng 3.7 cho thấy, sau ủ dịch acid pH 1,2; kích thước vi nang AI3-C chứa inulin tăng 5,03% từ 3083 µm đến 3238 µm; kích thước vi nang AC tăng 6,84% từ 3258 µm đến 3481 µm Như vậy, sau 30 phút ủ dịch dày mô phỏng, trương nở vi nang AC lớn vi nang AI3-C Bàn luận: Cả mẫu vi nang AI3-C AC trương nở tăng kích thước sau ủ dịch dày mô Sự trương nở nguyên nhân sau: Thứ nhất, thành phần tinh bột vi nang tiếp xúc với nước dịch dày mô nhanh chóng hấp thụ nước tăng thể tích Thứ hai, ion hóa trị I dịch dày mô H+, Na+ thay ion Ca2+ có vi nang calci alginat, làm ion Ca2+ mơ hình ―vi trứng‖, độ bền gel calci alginat giảm [26] Dù vậy, thời gian ủ 30 phút, thay ion diễn với số lượng nhỏ, vi nang khơng xảy tượng rã theo chế hòa tan gel, tinh bột vi sinh vật bảo toàn vi nang Bên cạnh đó, tương tác chitosan alginat giúp tạo nên lớp áo polycation bao phủ bên vi nang, hạn chế tác động môi trường acid dày Với vi nang AI3-C, vai trò inulin việc góp phần bảo tồn cấu trúc vi nang mơi trường SGF nhắc tới Theo số tác giả, lượng nhỏ inulin thêm vào công thức vi nang góp phần củng cố mạng lưới polyme thơng qua tương tác alginat – inulin, inulin làm giảm độ xốp mạng lưới polyme [18] Ngược lại, inulin dùng với lượng lớn gây ổn định cấu trúc ―vỉ trứng‖ trở ngại không gian, làm suy yếu mạng lưới polyme Xét mức độ trương nở dịch dày mơ phỏng, mức độ gia tăng kích thước vi nang AI3-C thấp vi nang AC Điều giải thích nồng độ tinh bột vi nang AI3-C (7%) thấp so với vi nang AC (10%) tinh bột cho nguyên nhân gây trương nở Các kết cho thấy, dung dịch pH 1,2 không ảnh hưởng đến khung mạng lưới calci alginat nên vi nang AI3-C giữ nguyên cấu trúc bảo toàn khả nhốt giữ, tế bào VSV khơng bị rửa trơi bên ngồi, kết phù hợp với nhiều nghiên cứu trước [10] 40 Tóm lại, vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin với nồng độ inulin 3% sau qua môi trường dịch dày mô pH 1,2 có màu vàng nhạt so với ban đầu, khơng có thất VSV thành phần tinh bột vi nang Sự trương nở vi nang có chứa inulin thấp so với vi nang khơng chứa inulin phần cho thấy tín hiệu tốt việc hạn chế thay đổi cấu trúc vi nang AI3-C pH acid dày Như vậy, vi nang AI3-C tạo thành theo phương pháp tách pha đông tụ cho thấy bảo vệ tốt VSV môi trường dịch dày mô 3.2.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin dịch tiêu hóa mơ Sự bao gói VSV vi nang giúp bảo vệ VSV khỏi điều kiện bất lợi đường tiêu hóa Tuy nhiên bao gói cần đảm bảo VSV phải giải phóng vào đến ruột với số lượng tối thiểu 106-107 CFU/g (theo tiêu chuẩn FAO/WHO chế phẩm probiotic) Do đó, nghiên cứu thiết kế để kiểm tra khả bảo vệ L acidophilus vi nang Alg-TB-CTS-In (AI3-C) dịch dày mơ khả giải phóng VSV khỏi vi nang dịch ruột mô a Mục tiêu: Khảo sát khả bảo vệ L acidophilus dịch dày mơ khả giải phóng VSV dịch ruột mô vi nang Alg-TB-CTS-In b Tiến hành: Tiến hành tạo vi nang Alg-TB-CTS-In chứa L acidophilus theo phương pháp nêu mục 2.3.3.1, đông khô vi nang theo phương pháp nêu mục 2.3.4 Chuẩn bị dịch dày dịch ruột mô theo phương pháp nêu mục 2.1.5 Cân xác 1,00 g vi nang đơng khơ vào bình nón chứa 100 ml dịch dày mơ pH 1,2 hấp tiệt khuẩn để nguội Mẫu vi nang ủ máy lắc 37ºC, tốc độ 75 vòng/phút 30 phút Sau thời gian ủ, đánh giá trạng thái vi nang Tách riêng vi nang dịch acid Dịch acid xác định số lượng VSV sống sót phương pháp pha lỗng liên tục theo phương pháp nêu mục 2.3.5 Vi nang chuyển vào bình nón có chứa dịch ruột mơ pH 6,8 hấp tiệt khuẩn Lắc vi nang giờ, tốc độ 75 vòng/phút, nhiệt độ 37ºC Sau giờ, đánh giá trạng thái vi nang xác định số lượng VSV giải phóng phương pháp pha lỗng liên tục c Kết quả: 41 Hình 3.8 Vi nang AI3-C sau ủ 30 phút môi trƣờng dịch dày mô dịch ruột mô Bảng 3.8 Số lƣợng VSV sống sót vi nang AI3-C sau đơng khơ, sau ủ dịch dày mô dịch ruột mô Số lƣợng VSV (log CFU/g) Mẫu Mẫu Trung bình Trong vi nang sau đông khô Trong dịch acid sau ủ 30 phút dịch dày mô pH 1,2 Trong dịch lắc sau ủ 30 phút SGF SIF Chú thích: (–): khơng có vi sinh vật 42 9,68 9,74 9,71 _ _ _ 7,66 7,21 7,43 Hình 3.9 Biểu đồ thể số lƣợng VSV trung bình giải phóng sau ủ dịch tiêu hóa mơ vi nang AI3-C Hình 3.10 Khuẩn lạc Lactobacillus acidophilus môi trƣờng MRS thạch Nhận xét: Trước lắc dịch dày mô phỏng, vi nang AI3-C có bề mặt nhăn nheo, thể chất tương đối rắn Sau lắc 30 phút dịch dày mô phỏng, vi nang trương nở phần khơng có tượng nứt vỡ Sau lắc dịch ruột mô 43 phỏng,vi nang trương nở hoàn toàn, bề mặt xuất vết nứt, vi nang vỡ thành mảnh, thể chất mềm nhũn Kết từ bảng 3.8 cho thấy, thời điểm sau đông khô, số lượng VSV mẫu vi nang đạt log CFU/g Sau ủ 30 phút dịch dày mô phỏng, lấy dịch lắc đem đếm số lượng VSV thất thoát phương pháp pha lỗng liên tục khơng thấy xuất VSV dịch lắc acid Sau ủ dịch ruột mô phỏng, kết cho thấy số lượng VSV mẫu vi nang đạt log CFU/g, cụ thể 7,66 7,21 tương ứng với mẫu mẫu Điều cho thấy số lượng VSV giải phóng môi trường dịch ruột mô đạt 107 CFU/g, đáp ứng tiêu chuẩn số lượng VSV giải phóng FAO/WHO chế phẩm probiotic Bàn luận: Sự trương nở phần bảo toàn cấu trúc vi nang dịch dày mô bàn luận mục 3.2.1 Dịch lắc acid đem xác định số lượng VSV giải phóng phương pháp pháp pha lỗng liên tục với mơi trường thạch MRS không thấy xuất khuẩn lạc L acidophilus chứng tỏ vi nang cung cấp bảo vệ tốt VSV dịch dày mô Trong vài nghiên cứu trước cho thấy điều kiện acid (pH 1,0-1,5 hay pH 3,0) trao đổi vi nang môi trường hạn chế, cấu trúc ―hộp trứng‖ cấu trúc hỗ trợ alginat – inulin toàn vẹn [10], [13] Ở pH cao so với pH 1,2 thời gian lắc lâu hơn, nhận thấy có thất thoát VSV mức 0,01% so với tổng lượng VSV bao gói [6] Sau ủ dịch ruột mô phỏng, vi nang trương nở to nứt vỡ thành mảnh nhỏ Lý giải cho tượng sau: Các ion Ca2+ liên kết với nhóm – COO- đơn vị polyguluronat alginat Trong giai đoạn đầu trình trương nở, lượng nhỏ ion Ca2+ có mặt đơn vị polyguluronat trao đổi với ion H+, Na+ dịch dày, dẫn đến trương nở Trong giai đoạn sau, ion H+, Na+ thâm nhập sâu trao đổi với ion Ca2+ diễn mạnh mẽ hơn, cấu trúc gel giãn trở nên xốp dẫn đến trương nở mạnh tan rã cấu trúc vi nang, giải phóng VK probiotic [62] Thời gian lắc lâu, vi nang vỡ, tạo thành mảnh vụn nhỏ 44 Trong dịch mật, phản ứng trao đổi ion xảy vi nang hấp thụ muối mật, bao chitosan làm giảm khả thấm muối mật vào vi nang Do vậy, lớp chitosan cung cấp bảo vệ tốt dung dịch muối mật Bàn luận tác dụng Inulin Những thí nghiệm cho thấy vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin với nồng độ inulin % tạo thành theo phương pháp tách pha đông tụ đạt yêu cầu hàm ẩm số lượng vi sinh vật bao gói Sự có mặt inulin với nồng độ phù hợp vi nang yếu tố góp phần bảo tồn số lượng VSV qua dày không ảnh hưởng tới giải phóng VSV ruột non Iyer cộng chứng minh việc bao gói probiotic vi nang alginat – prebiotic (tinh bột biến tính, inulin) cải thiện bảo vệ L acidophilus CSCC 2400 CSCC 2409 điều kiện acid dày, muối mật sữa chua [16] Theo nghiên cứu trước tác giả Hoàng Thị Minh Thu, bổ sung inulin với nồng độ 0,25%; 0,5%; 1%; 2%; 3% vào môi trường nuôi cấy L acidophilus ATCC 4653, số lượng VSV tăng nhẹ từ 1,1 đến 1,2 lần so với không bổ sung inulin [11] Trong báo cáo D Ozer, S Akin B Ozer [45], tiến hành với nồng độ 0,5% 1%, tác giả nhận thấy khơng có khác biệt rõ rệt số lượng L acidophilus LA-5 mẫu không bổ sung inulin mẫu có bổ sung inulin SiokKoon Yeo Min-Tze Liong thu kết tương tự nghiên cứu ảnh hưởng inulin lên chủng L acidophilus FTDC 8033 L acidophilus ATCC 4356 sữa đậu nành [61] Tuy vậy, ngày inulin sử dụng prebiotic tác dụng thể rõ xuống tới đại tràng Tác dụng biết đến nhiều kích thích phát triển vi khuẩn lactic vi khuẩn bifido ruột Khác với loại carbohydrat thông thường, inulin không bị tiêu hóa amylase, acid dày hay enzym thủy phân khác ruột non Nó bị thủy phân đáng kể enzym inulinase sản xuất bifidobacteria đại tràng sử dụng làm thức ăn cho vi khuẩn có lợi Việc bổ sung inulin với nồng độ thích hợp giúp tăng đặc tính bám dính hạt với niêm mạc đại tràng Đây đặc tính quan trọng chế phẩm muốn hướng tới giải phóng đại tràng Cơ chế bám dính giải thích liên kết polyme chất nhầy theo lí thuyết khuếch tán – thâm nhập [18] Bước vi nang tiếp xúc với chất nhầy, sau thâm nhập 45 chuỗi polyme từ vi nang vào chất nhầy liên kết yếu lực Van der Waals liên kết hydro Sự khuếch tán polyme phụ thuộc vào hệ số khuếch tán pha trọng lượng phân tử, mật độ liên kết ngang độ phân nhánh polyme Hệ số khuếch tán (Db) thường cao polyme tuyến tính inulin thường giảm mức độ phân nhánh polyme tăng Khi bám dính vi nang với chất nhầy đại tràng tăng lên, thời gian lưu hạt kéo dài, giúp VSV lại vi nang khỏi hạt xâm chiếm ruột kết từ tạo tác động có lợi vật chủ Trong thử nghiệm độ bám dính với niêm mạc đại tràng vi nang với nồng độ inulin khác cho thấy, hạt không chứa inulin sau phút cường độ bám dính giảm đáng kể 0% sau 60 phút Ở nồng độ inulin cao (20%), sau 45 phút đại tràng, vi nang bị hòa tan hồn tồn Tuy nhiên, với vi nang nồng độ inulin 5%, cường độ bám dính hạt tăng lên đáng kể, tồn đến 120 phút đại tràng [18] Như vậy, có mặt inulin với nồng độ thích hợp cần nghiên cứu để tăng thời gian lưu vi nang đích tác dụng đại tràng 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, đề tài giải số mục tiêu sau: Tạo vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin chứa Lactobacillus acidophilus theo phương pháp tách pha đông tụ  Đã tạo vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin với nồng độ inulin 3% chứa Lactobacillus acidophilus theo phương pháp tách pha đông tụ  Kết khảo sát số đặc tính vi nang sau đơng khơ:  Về thể chất vi nang: vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin với nồng độ inulin 3% có hình dạng tương đối đồng đều, màu vàng, đường kính vi nang khoảng 2-4 mm  Hàm ẩm vi nang sau đông khô 2,98%; sau tháng bảo quản nhiệt độ 2-8oC, hàm ẩm tăng nhẹ đến 3,15%  Số lượng VSV bao gói sau đơng khơ trung bình đạt 9,71×109 CFU/g; sau tháng bảo quản 9,48×109 CFU/g Đánh giá khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin dịch tiêu hóa mơ  Sau ủ 30 phút dịch dày mô pH 1,2; vi nang trương nở phần, khơng có giải phóng VSV tinh bột từ vi nang mơi trường, vi nang màu vàng chitosan  Sau ủ 30 phút dịch dày mô pH 1,2 chuyển sang ủ dịch ruột mô giờ, vi nang nứt vỡ, mềm nhũn, số lượng VSV giải phóng log CFU/g ĐỀ XUẤT Do thời gian thực khóa luận có hạn nên chúng tơi xin đưa đề xuất sau:  Tiếp tục nghiên cứu bào chế vi nang L acidophilus kết hợp với số probiotic prebiotic khác để tạo thêm nhiều sản phẩm phục vụ cho nhu cầu ngày tăng sản phẩm probiotic  Tiếp tục khảo sát độ ổn định khả giải phóng VSV vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin 47  Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng inulin tới kiểm sốt giải phóng đại tràng 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hóa phân tích tập 1, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học Nguyễn Lân Dũng (2000), Vi sinh vật học, Nhà xuất giáo dục, Hà Nội, tr 221-228 Nguyễn Trọng Hiệp, Bùi Tùng Hiệp (2009), "Bàn việc đảm bảo khả sống sót vi sinh vật sản phẩm probiotic", Tạp chí Dược học, Bộ Y Tế, 393, tr.2-5 Lê Thị Hoa (2018), Đánh giá khả sống sót dịch tiêu hóa mơ vi nang alginat-tinh bột-chitosan chứa Lactobacillus acidophilus, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Mai Hương (2014), Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ q trình tạo ngun liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Văn Long (2005), Một số chuyên đề bào chế đại, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 112-128 Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa (2007), Bào chế sinh dược học,, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội 10 Bùi Thị Kim Lanh (2017), Đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật vi nang calci - alginat bao chitosan, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội 11 Hoàng Thị Minh Thu (2015), Khảo sát ảnh hưởng số prebiotics lên q trình ni cấy lactobacillus acidophilus bifidobaterium longum, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội 12 Đàm Thanh Xuân cộng (2016), "Đánh giá vai trò tinh bột sữa gầy đến trình tạo vi nang probiotic chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ATCC 4356", Tạp chí Dược học, Bộ Y Tế, 56(487), tr 8-11 13 Đàm Thanh Xuân cộng (2016), "Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics phương pháp đơng tụ", Tạp chí Dược học, Bộ Y tế, 481, tr 61-65 Tài liệu Tiếng Anh 14 Anal Anil Kumar, Singh Harjinder (2007), "Recent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery", Trends in food science & technology, 18(5), pp 240-251 15 Anderson James W, Gilliland Stanley E (1999), "Effect of fermented milk (yogurt) containing Lactobacillus acidophilus L1 on serum cholesterol in hypercholesterolemic humans", Journal of the American College of Nutrition, 18(1), pp 43-50 16 Anjani Kavya, Iyer Chandra, et al (2004), "Survival of co-encapsulated complementary probiotics and prebiotics in yoghurt", Milchwissenschaf, Milk Science International 17 Arnaud J-P, Lacroix C, et al (1992), "Effect of agitation rate on cell release rate and metabolism during continuous fermentation with entrapped growing", Biotechnology Techniques, 6(3), pp 265-270 18 Atia A., Gomma A I., et al (2017), "Molecular and biopharmaceutical investigation of alginate-inulin synbiotic coencapsulation of probiotic to target the colon", J Microencapsul, 34(2), pp 171-184 19 Belkum Alex van, E Edward Nieuwenhuis (2007), Life in commercial probiotics, in FEMS Immunol Med Microbiol, pp 281-283 20 Bhardwaj Tilak R, Kanwar Meenakshi, et al (2000), "Natural gums and modified natural gums as sustained-release carriers", Drug development and industrial pharmacy, 26(10), pp 1025-1038 21 Bull Matthew, Plummer Sue, et al (2013), "The life history of Lactobacillus acidophilus as a probiotic: a tale of revisionary taxonomy, misidentification and commercial success", FEMS Microbiology Letters, 349(2), pp 77-87 22 C Rowe Raymond, Jn Sheskey Paul (2009), Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press, London 23 Chan Eng-Seng, Wong Sze-Ling, et al (2011), "Effects of starch filler on the physical properties of lyophilized calcium–alginate beads and the viability of encapsulated cells", Carbohydrate Polymers, 83(1), pp 225-232 24 Charalampopoulos Dimitris, Rastall Robert, et al (2009), Probiotics and Prebiotics science and technology, Spinger 25 De Araújo Etchepare Mariana, Raddatz Greice Carine, et al (2016), "Effect of resistant starch and chitosan on survival of Lactobacillus acidophilus microencapsulated with sodium alginate", LWT - Food Science and Technology, 65, pp 511-517 26 Doumèche B., Küppers M., et al (2004), "New approaches to the visualization, quantification and explanation of acid-induced water loss from Ca-alginate hydrogel beads", Journal of Microencapsulation, 21(5), pp 565-573 27 Ghulam Murtaza (2011), "Alginate microparticles for biodelivery: A review", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5(25) 28 Gibson Glenn R., Roberfroid Marcel B (1995), "Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics", The Journal of Nutrition, 125(6), pp 1401-1412 29 Goktepe Ipek, Juneja Vijay K., et al (2006), Probiotics in Food Safety and Human Health, NW 30 Goldstein Ellie JC, Tyrrell Kerin L, et al (2015), "Lactobacillus species: taxonomic complexity and controversial susceptibilities", Clinical Infectious Diseases, 60(suppl_2), pp S98-S107 31 Gombotz Wayne R., Wee SiowFong (1998), "Protein release from alginate matrices", Advanced Drug Delivery Reviews, 31(3), pp 267-285 32 Gouin Sébastien (2004), "Microencapsulation: industrial appraisal of existing technologies and trends", Trends in Food Science & Technology, 15(7), pp 330-347 33 Grant Gregor T., Morris Edwin R., et al (1973), "Biological interactions between polysaccharides and divalent cations: The egg-box model", FEBS Letters, 32(1), pp 195-198 34 Guarner Francisco, Khan Aamir G., et al (2012), "World Gastroenterology Organisation Global Guidelines: Probiotics and Prebiotics October 2011", Journal of Clinical Gastroenterology, 46(6), pp 468-481 35 Heidebach Thomas, Först Petra, et al (2010), "Influence of casein-based microencapsulation on freeze-drying and storage of probiotic cells", Journal of Food Engineering, 98(3), pp 309-316 36 J Zuidam N., E Shimoni (2009), Overview of Microencapsulates for Use in Food Products or Processes and Methods to Make Them, Springer, The Netherlands, pp 3-26 37 Jankowski T., Zielinska M., et al (1997), "Encapsulation of lactic acid bacteria with alginate/starch capsules", Biotechnology Techniques, 11(1), pp 31-34 38 Kailasapathy K (2002), "Microencapsulation of probiotic bacteria : technology and potential applications", Curr Issues Intest Microbiol., 3, pp 39-48 39 Karimi Reza, Azizi Mohammad Hossein, et al (2015), "Application of inulin in cheese as prebiotic, fat replacer and texturizer: A review", Carbohydrate Polymers, 119, pp 85-100 40 Lilly Daniel M., Stillwell Rosalie H (1965), "Probiotics: Growth-Promoting Factors Produced by Microorganisms", Science, 147(3659), pp 747 41 Markowiak Paulina, Śliżewska Katarzyna (2017), "Effects of Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics on Human Health", Nutrients, 9(9), pp 1021 42 Mensink Maarten A., Frijlink Henderik W., et al (2015), "Inulin, a flexible oligosaccharide II: Review of its pharmaceutical applications", Carbohydrate Polymers, 134, pp 418-428 43 Mokarram R.R., Mortazavi S.A., et al (2009), "The influence of multi stage alginate coating on survivability of potential probiotic bacteria in simulated gastric and intestinal juice", Food research international, 2009 v.42 no.8(no 8), pp pp 1040-1045 44 Nussinovitch A., Zvitov-Marabi R (2008), "Unique shape, surface and porosity of dried electrified alginate gels", Food Hydrocolloids, 22(3), pp 364-372 45 Özer D., Akin S., et al (2005), "Effect of Inulin and Lactulose on Survival of Lactobacillus acidophilus LA-5 and Bifidobacterium bifidum BB-02 in Acidophilus-Bifidus Yoghurt", Food Science and Technology International, 11(1), pp 19-24 46 Ozgul Fatih, Ahmed Imen (2011), Lactic Acid Bacteria | Lactobacillus spp.: Lactobacillus acidophilus, in Encyclopedia of Dairy Sciences pp 91-95 47 Ramos Philippe E., Cerqueira Miguel A., et al (2018), "Physiological protection of probiotic microcapsules by coatings", Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 58(11), pp 1864-1877 48 Rinaudo Marguerite (2006), "Chitin and chitosan: Properties and applications", Progress in Polymer Science, 31(7), pp 603-632 49 Roberfroid Marcel (2007), "Prebiotics: The Concept Revisited", The Journal of Nutrition, 137(3), pp 830S-837 50 Rokka Susanna, Rantamäki Pirjo (2010), "Protecting probiotic bacteria by microencapsulation: challenges for industrial applications", European Food Research and Technology, 231(1), pp 1-12 51 Sabina Fijan (2014), "Microorganisms with claimed probiotic properties: an overview of recent literature", Int J Environ Res Public Health, 11(5), pp 474567 52 Sanders M E., Akkermans L M., et al (2010), "Safety assessment of probiotics for human use", Gut Microbes, 1(3), pp 164-85 53 Schrezenmeir Jürgen, de Vrese Michael (2001), "Probiotics, prebiotics, and synbiotics—approaching a definition", The American Journal of Clinical Nutrition, 73(2), pp 361-364 54 Sinha V R., Singla A K., et al (2004), "Chitosan microspheres as a potential carrier for drugs", International Journal of Pharmaceutics, 274(1), pp 1-33 55 Sriamornsak Pornsak, Thirawong Nartaya, et al (2008), "Cryo-scanning electron microscopy (cryo-SEM) as a tool for studying the ultrastructure during bead formation by ionotropic gelation of calcium pectinate", International Journal of Pharmaceutics, 352(1), pp 115-122 56 Talwalkar A., Kailasapathy K (2004), "A Review of Oxygen Toxicity in Probiotic Yogurts: Influence on the Survival of Probiotic Bacteria and Protective Techniques", Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 3(3), pp 117-124 57 Vivek K (2013), "Use of encapsulated probiotics in dairy based foods", International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences, 3(1), pp 188-199 58 Fiordaliso M., Kok N., et al (1995), "Dietary oligofructose lowers triglycerides, phospholipids and cholesterol in serum and very low density lipoproteins of rats", Lipids, 30(2) 59 Khosravi Zanjani Mohammad Ali, Ghiassi Tarzi Babak, et al (2014), "Microencapsulation of Probiotics by Calcium Alginate-gelatinized Starch with Chitosan Coating and Evaluation of Survival in Simulated Human Gastrointestinal Condition", Iranian journal of pharmaceutical research IJPR, 13(3), pp 843-852 60 Kruse H P., Kleessen B., et al (1999), "Effects of inulin on faecal bifidobacteria in human subjects", Br J Nutr, 82(5), pp 375-82 61 Yeo S K., Liong M T (2010), "Effect of prebiotics on viability and growth characteristics of probiotics in soymilk", J Sci Food Agric, 90(2), pp 267-75 62 Adhiyaman Rajendran, Basu S K (2009), "Alginate-chitosan particulate system for sustained release of nimodipine", Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 8(5), pp 433-440 63 Favaro-Trindale C S., Grosso C R F (2002), "Microencapsulation of Lacidophilus (La-05) and B-lactis (Bb-12) and evaluation of their survival at the pH values of the stomach and in bile", Journal of Microencapsulation, 19(4), pp 485-494 ... pha đông tụ .26 3.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng vi sinh vật vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin dịch tiêu hóa mơ 38 3.2.1 Đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật vi nang alginat. .. TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ OANH MÃ SINH VI N: 1401467 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO VỆ VI SINH VẬT TRONG ĐƢỜNG TIÊU HÓA CỦA VI NANG ĐƠNG TỤ ALGINAT – INULIN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng... từ lí trên, đề tài Đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa vi nang đơng tụ Alginat – Inulin ” thực với mục tiêu sau:  Tạo vi nang alginat – tinh bột – chitosan – inulin chứa Lactobacillus