NGUYỄN THỊ TOÁN mã SINH VIÊN 1502062 NGHIÊN cứu mức độ NHIỄM nấm mốc và AFLATOXIN TRÊN vị THUỐC ý dĩ ( SEMEN COICIS) KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dƣợc sĩ

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ TOÁN MÃ SINH VIÊN: 1502062 NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM NẤM MỐC VÀ AFLATOXIN TRÊN VỊ THUỐC Ý DĨ ( SEMEN COICIS) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ TOÁN MÃ SINH VIÊN: 1502062 NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM NẤM MỐC VÀ AFLATOXIN TRÊN VỊ THUỐC Ý DĨ ( SEMEN COICIS) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Tạ Thu Lan Nơi thực hiện: Bộ môn Vi Sinh Sinh Học Viện Kiểm nghiệm thuốc TƢ HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng chân thành biết ơn sâu sắc đến người thầy ThS Tạ Thu Lan – Giảng viên Bộ môn Vi sinh Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội Cô người định hướng cho từ ngày đầu làm khóa luận Trong suốt thời gian làm khóa luận, ln tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện để thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo, cô giáo, chị kĩ thuật viên Bộ môn Vi sinh Sinh học tồn thể thầy trường Đại học Dược Hà Nội – người thầy chia sẻ giúp tơi có kiến thức quý báu học tập hành trang trình thực khóa luận Qua đây, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn em sinh viên nghiên cứu khoa học Bộ môn Vi sinh Sinh học người động viên, giúp đỡ tơi nhiều từ khóa luận bắt đầu tiến hành hồn thành Đồng thời, tơi xin gửi lời cám ơn đến gia đình tơi, đến bạn tơi Họ người ln bên cạnh khích lệ, động viên giúp đỡ suốt năm tháng qua, lời cảm ơn chân thành sâu sắc Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Toán MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN .5 1.1 Một vài nét đại cương chi Aspergillus .5 1.2 Một số nét đại cương chi Penicillium .7 1.3 Tình hình nghiên cứu nấm mốc mycotoxin thảo dược nước 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nấm mốc mycotoxin thảo dược nước………………………………………………………………… …………… 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nấm mốc mycotoxin thảo dược nước12 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .14 2.1 Đối tượng, trang thiết bị nghiên cứu 14 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .14 2.1.2 Môi trường phân lập xác định nấm mốc .14 2.1.3 Aflatoxin chuẩn 14 2.1.4 Thiết bị nghiên cứu .15 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu .15 2.3.2 Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu .16 2.3.3 Phương pháp phân lập nấm mốc .16 2.3.4 Phương pháp phân loại nấm mốc: …………………………………….….16 2.3.5 Các số đánh giá mức độ nhiễm nấm .17 2.3.6 Phương pháp phân tích độc tố aflatoxin…… ………………………… 17 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Hàm ẩm mẫu ý dĩ nghiên cứu .19 3.2 Mức độ nhiễm nấm mẫu ý dĩ nghiên cứu .19 3.2.1 Kết phân lập phân loại 19 3.2.2 Đặc điểm khuẩn lạc, vi học số loài phân lập từ mẫu ý dĩ nghiên cứu 25 3.3 Kết định lượng aflatoxin mẫu vị thuốc ý dĩ nghiên cứu 26 3.3.1 Nồng độ chuẩn làm việc………………………………………….…… 26 3.3.2 Kết kiểm tra độ thích hợp hệ thống……………………….……26 3.3.3 Kết nghiên cứu khoảng nồng độ tuyến tính aflatoxin………… 26 3.3.4 Kết xác định hàm lượng aflatoxin mẫu ý dĩ…………… 27 3.4 Một số ý kiến bàn luận …………………………………………………… 27 3.4.1 Về hàm ẩm dược thảo 27 3.4.2 Về mức độ nhiễm nấm 28 3.4.3 Về mức độ nhiễm độc tố aflatoxin 29 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………….30 Kết luận……………………………………………………………… 30 1.1 Mức độ nhiễm nấm mốc………………………………………… 30 1.2 Về mức độ nhiễm aflatoxin……………………………………….30 s2 Đề xuất kiến nghị………………………………………………… 31 2.1 Đề xuất 31 2.2 Kiến nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC: Sắc ký đồ định lượng aflatoxin DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADM : Aspergillus Differentiation Medium Base BGYF test : Bright greenish-yellow fluorescence test DĐVN IV : Dược điển Việt Nam IV DGM : Dichloran Glycerol Medium Base HPLC : Sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HPLC-MS/MS : Sắc kí lỏng hiệu cao kết hợp detector khối phổ lần (High performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry) IARC International Agency for Research on Cancer LÔ : Phố Lãn Ông MEA : Malt Extra Agar PDA : Potato Dextrose Agar TLC : Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) UPLC-MS/MS : Sắc kí siêu hiệu kết hợp detector khối phổ lần (Ultra performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry) PPB : phần triệu DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Hàm ẩm mẫu vị thuốc ý dĩ nghiên cứu ………… 19 Bảng 3.2 Số lượng chủng, chi loài nấm chủ yếu phân lập từ mẫu ý dĩ nghiên cứu .19 Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc số loài quan trọng phân lập từ mẫu ý dĩ nghiên cứu (môi trường Czapek Dox, 25oC, ngày nuôi)…………………………25 Bảng 3.4 Đặc điểm vi học số loài quan trọng phân lập từ mẫu ý dĩ nghiên cứu (môi trường Czapek Dox, 25oC, ngày nuôi) 25 Bảng 3.5 Mức độ nhiễm aflatoxin mẫu ý dĩ nghiên cứu….…………… 27 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 3.1 Lồi A parasiticus nhiễm vị thuốc ý dĩ…………….…………21 Hình 3.2 Lồi A.flavus nhiễm vị thuốc ý dĩ…………………………… 22 Hình 3.3 Loài A niger nhiễm vị thuốc ý dĩ:………………….……… 23 Hình 3.4 Lồi Penicillium sp1 nhiễm vị thuốc ý dĩ:……………….……24 ĐẶT VẤN ĐỀ Thảo dược chế phẩm chúng thường dễ bị nấm mốc xâm nhiễm phát triển, điều kiện khí hậu nóng ẩm Việt Nam Khi bị mốc sản phẩm bị giảm chất lượng làm giảm hiệu điều trị Hơn nữa, sản phẩm thường bị nhiễm chất chuyển hóa thứ cấp độc nấm gọi mycotoxin, gây nguy hiểm cho sức khỏe người sử dụng Các độc tố gây bệnh cho người động vật (mycotoxicosis), với tác động từ cấp tính đến mãn tính, dẫn đến qi thai, ung thư, …[5], [7], [19] Ý dĩ (Semen Coicis) thảo dược thường sử dụng đông y để chữa trị tả lỵ, lợi tiểu tiện, tiêu phù thũng, đặc biệt làm thuốc bồi bổ thể, thực phẩm chức có đầy đủ thành phần protid, chất béo tinh bột [8] Tuy nhiên, có đề tài nước nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc mycotoxin vị thuốc Để góp phần đảm bảo chất lượng thuốc an toàn cho người sử dụng dược thảo nói chung, vị thuốc ý dĩ nói riêng, đề tài: “Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc aflatoxin vị thuốc ý dĩ (Semen Coicis)” thực với mục tiêu sau: Xác định mức độ nhiễm nấm mốc vị thuốc ý dĩ Phân tích độc tố aflatoxin nhiễm mẫu ý dĩ nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN Ý dĩ mọc hoang nơi ẩm mát, ven suối Một số tỉnh trồng Nghệ Tĩnh, Thanh Hóa, Lai Châu Hình cầu bầu dục cầu trịn, phía đáy tương đối rộng, bằng, phía đỉnh trịn đầy, dài 0,5 – 0,65cm, rộng 0,3 – 0,5cm Mặt mầu trắng trắng vàng, mặt sau có đường rãnh dọc sâu, rộng lịng, rãnh sù sì, mầu nâu, phần cuống lõm vào, có nốt nhỏ mầu nâu Chất cứng, đập vỡ có mầu trắng, có bột, khơng mùi, vị Thành phần hóa học: protein 16,2%, chất béo 4,65%, carbohydrate 79,17 %, lượng vitamin B1 (330 vi lượng%) ngồi cịn có amino acids (là leucine, lysine, arginine (Arg), tyrosine v.v…), coixol, coixenolide, hợp chất triterpenoid Công dụng: Kiện tỳ, bổ phế, nhiệt, lợi thấp.Trị tiết tả, thấp tý, gân mạch co rút, co duỗi khơng lợi, thủy thũng, cước khí, phế nuy, phế ung, trường ung, lâm trọc, bạch đới Nấm mốc dạng nấm sợi, có khơng có vách ngăn Trong đó, nhóm nấm mốc ưa khơ, đặc biệt chi Aspergillus Penicillium có vài trị quan trọng đời sống y dược học 1.1 Một số nét đại cƣơng chi Aspergillus Chi Aspergillus đặc trưng đặc điểm: Hệ sợi nấm gồm sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu, màu nhạt số trường hợp trở thành nâu hay màu sẫm khác vùng định khuẩn lạc Bộ máy mang bào tử trần phát triển từ tế bào có đường kính lớn hơn, màng tế bào dày đoạn lân cận sợi nấm (tế bào chân- foot cell) Giá bào tử trần phát triển từ tế bào chân, nhánh sợi nấm, gần thẳng góc với trục tế bào chân thường mặt chất Giá bào tử trần khơng có nhánh, khơng có có it vách ngang, có phần đỉnh to thành bọng (vesicle) hình chùy, hình elip, hình nửa cầu hình cầu Bọng hữu thụ (bọng đỉnh giá) mang thể bình (phialide) Các thể bình song song họp thành cụm đỉnh bọng xếp thành tia sát tồn bề mặt bọng Thể bình có tầng (uniseriate) có hai tầng (biseriate) Thể bình hai tầng tức là: Thể bình cấp (cịn gọi cuống thể A ustus Penicillium Penicillium sp Rhizopus R stolonifer Absidia 3 1 A corymbifera Tổng 4 51 11 17 31 2 30 13 7,5 1,2 13 7,5 10 5,8 11 173 100 (%) Nhận xét: Kết phân lâp, phân loại bảng 3.2 cho thấy: Từ 10 mẫu ý dĩ nghiên cứu phân lập 173 chủng nấm thuộc loài chi (Aspergillus, Penicillium, Rhizopus Absidia) Trong đó, chi Aspergillus có lồi phân lập gồm: A parasiticus [hình 3.1] chiếm tỷ lệ cao số chủng phân lập 48,6% (84/173) có mặt 50% (5/10) mẫu nghiên cứu Xếp thứ lồi A flavus [hình 3.2] có tỷ lệ số chủng phân lập chiếm 16,2% (22/173), có mặt 7/10 mẫu nghiên cứu, chiếm 70% Xếp thứ loài A ustus, với tỷ lệ chủng phân lập tỷ lệ mẫu có mặt 7,5% (13/173) 70% (7/10) Loài A niger [hình 3.3] chiếm vị trí thứ số chủng phân lập được, với 6,4% (11/173) phân lập từ 70% (7/10) mẫu nghiên cứu Các loài A aculeatus A fumigatus xếp vị trí thứ 6, với tỷ lệ chủng tỷ lệ mẫu có mặt 4,1% (7/173) 50% (5/10); 2,9% 40% (4/10) Các chi nấm tiếp hợp có lồi phân lập R Stolonifer Absidia corymbifera với tỷ lệ chủng số có mặt 7,5% (13/173) 50% (5/10); 5,8% (10/173) 50% (5/10) Chi Penicillium với chủng phân lập (thuộc loài chưa xác định), chiếm tỷ lệ chủng phân lập 1,2% có mặt mẫu nghiên cứu [hình 3.4] 20 (a) (b) (c) (d) (e) (f) Hình 3.1 Lồi A parasiticus nhiễm vị thuốc ý dĩ: (a): A parasiticus nhiễm mẫu dược liệu 63A LƠ (mơi trường PDA); (b): Khuẩn lạc môi trường Czapek Dox (25OC, ngày nuôi); (c) (d): Cấu trúc sinh conidi tầng & conidi (e) & (f): Mặt trước & sau khuẩn lạc AFPA 300C, 48h 21 (a) (b) (c) (d) (e) (f) Hình 3.2 Lồi A flavus nhiễm vị thuốc ý dĩ: (a): Lồi A flavus nhiễm mẫu 36LƠ (PDA); (b) (c): Mặt trước sau khuẩn lạc (Czapek Dox, 25oC, ngày nuôi); (d): Cấu trúc sinh conidi tầng loài (e) (f): Mặt trước sau khuẩn lạc (ADM, 30oC, 48h) 22 (b) (a) (c) (d) Hình 3.3 Lồi A niger nhiễm vị thuốc ý dĩ: (a): Loài A niger nhiễm mẫu 63A LƠ (mơi trường DGM); (b) (c): Mặt trước sau khuẩn lạc (Czapek Dox, 25oC, ngày nuôi); (d): Cấu trúc sinh conidi tầng & conidi loài 23 (a) (b) (c) (d) Hình 3.4 Lồi Penicillium sp1 nhiễm vị thuốc ý dĩ: (a): Loài Penicillium sp1 nhiễm mẫu 63A LƠ (mơi trường DGM); (b): Khuẩn lạc lồi Czapek Dox (25OC, ngày ni); (c) (d): Cấu trúc chổi sinh conidi tầng conidi loài 24 3.2.2 Đặc điểm khuẩn lạc, vi học số loài phân lập từ mẫu ý dĩ nghiên cứu Đặc điểm khuẩn lạc vi học chủng nấm khảo sát việc nuôi cấy đơn điểm đĩa Petri chứa môi trường chuẩn Czapek Dox Agar ủ 25oC sau ngày [25] - Bảng 3.3 trình bày đặc điểm khuẩn lạc số loài quan trọng phân lập từ mẫu ý dĩ nghiên cứu Đây loài thuộc chi Aspergillus, có khả sinh nhiều độc tố khác Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc số loài quan trọng phân lập từ mẫu ý dĩ nghiên cứu (môi trường Czapek Dox, 25oC, ngày nuôi) Mặt phải Mặt trái Đƣờng kính khuẩn lạc (cm) Vàng xanh xanh Đen Xanh xám Nâu tím Màu kem Trắng xám Xám nhạt Vàng nhạt Không màu Không màu Không màu 3,5-6 3-4,1 3,5-5,0 3,5-5,0 4,0-5,5 3,5-5,5 Màu sắc khuẩn lạc TT Tên loài A flavus A parasiticus A niger A fumigatus A aculeatus A ustus - Đặc điểm vi học số loài quan trọng phân lập từ mẫu ý dĩ nghiên cứu trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Đặc điểm vi học số loài quan trọng phân lập từ mẫu ý dĩ nghiên cứu (môi trường Czapek Dox, 25oC, ngày nuôi) Tên lồi Cấu trúc sinh conidi (conidial head) Đƣờng kính bọng (μm) Cuống thể bình (μm) Thể bình (μm) 6-10 x 3-5 6-11 x 4-6 6-10 x 3-6 Dạng Số tầng A flavus R 25-50 A parasiticus R 19-41 A niger R 45-105 25 15-27 x 6,5-10 x Conidi (μm) 3-4,5 2,9-5,5 3,5-5 4-6 A fumigatus C 18-32 A aculeatus G 35-100 A ustus R 6,5-16 4,5-7,5 x 3-4,5 3-4,5 5,5-8 x 2-3,5 6-10 x 3-5 4-7,5 x 2,5-4 2-3,5 3-4 x 4-5 3-5 (Ghi R: dạng phóng xạ; C: dạng cột; G: dạng cầu) 3.3 Kết định lƣợng aflatoxin mẫu vị thuốc ý dĩ nghiên cứu 3.3.1 Nồng độ chuẩn làm việc G1 (μg/ml): G2 (μg/ml): 100 100 B1 (μg/ml): B2 (μg/ml): 100 100 3.3.2 Kết kiểm tra độ thích hợp hệ thống Aflatoxin RSD G2 5793400 5799218 5800645 5791241 5792660 5790441 0.1 G1 94670 92349 93693 92403 92572 92002 1.1 B2 2161354 2162930 2162760 2158030 2157270 2161742 0.1 B1 161592 164403 162977 161329 161244 160272 0.9 Nhận xét: Với kết RSD dao động khoảng 0,1-1,1 (˂ 2%) cho thấy hệ thống ổn định, thích hợp cho việc phân tích độc tố aflatoxin 3.3.3 Kết nghiên cứu khoảng nồng độ tuyến tính aflatoxin Aflatoxin G1 S1 S2 S3 S4 S5 Nồng độ (ng/ml) 1.6 3.2 6.4 12.8 25.6 Diện tích 6970 13457 26509 54359 110537 Phương trình hồi qui tuyến tính: y = 4326,4x – 551,3 (R = 0,9999) Aflatoxin G2 S1 S2 S3 S4 S5 Nồng độ (ng/ml) 0.4 0.8 1.6 3.2 6.4 Diện tích 115330 231571 457384 913846 1893289 Phương trình hồi qui tuyến tính: y = 296045x – 11907,5 (R2 = 0,9998) 26 Aflatoxin B1 S1 S2 S3 S4 S5 Nồng độ (ng/ml) 1.6 3.2 6.4 12.8 25.6 Diện tích 12060 26236 50091 102271 205359 Phương trình hồi qui tuyến tính: y = 8037,2x – 525,9 (R = 0,99996) Aflatoxin B2 S1 S2 S3 S4 S5 Nồng độ (ng/ml) 0.4 0.8 1.6 3.2 6.4 Diện tích 32231 63416 125339 250812 515583 Phương trình hồi qui tuyến tính: y = 80552,4x – 2293,8 (R = 0,9999) Nhận xét: Kết khảo sát đường chuẩn cho thấy nồng độ aflatoxin khoảng khảo sát có mối tương quan chặt chẽ với diện tích pic (R2 ≥ 0,9998) 3.3.4 Kết xác định hàm lượng aflatoxin mẫu ý dĩ Kết phân tích aflatoxin mẫu ý dĩ nghiên cứu trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Mức độ nhiễm aflatoxin mẫu ý dĩ nghiên cứu TT mẫu Hàm lượng aflatoxin dược liệu (ppb = ng/g) Toàn G2 G1 B2 B1 phần TT Mẫu 63A LÔ - 276,3 12,7 17,7 306,7 24 LÔ - 20,0 13,8 6,6 40,4 51A LÔ - 57,6 5,8 4,8 68,2 (Ghi N/A: không phát được; -: thấp giới hạn định lượng dưới) Nhận xét: Cả mẫu ý dĩ nghiên cứu bị nhiễm aflatoxin B1 aflatoxin toàn phần (B1+B2+G1+G2) vượt qui định cho phép DĐVN IV nhiều lần (Phụ lục 12.21 qui định: Các dược liệu nhiễm aflatoxin B1 không µg/kg nhiễm aflatoxin tồn phần khơng q µg/kg) 3.4 Một số ý kiến bàn luận 3.4.1 Về hàm ẩm dược thảo - Từ kết xác định hàm ẩm mẫu ý dĩ nghiên cứu kết phân lập phân loại chủng nấm (bảng 3.1 3.2) cho thấy: Tất mẫu thảo 27 dược nghiên cứu có hàm ẩm đạt (≤ 12%) không đạt yêu cầu DĐVN IV (˃12%) bị nhiễm nấm; khác biệt mức độ nhiễm nấm mẫu có hàm ẩm đạt khơng đạt u cầu Dược điển khơng thấy rõ; chí có mẫu có mức độ nhiễm nấm cao lại có hàm ẩm thấp Đây điều chưa hợp lý Giải thích cho kết này, theo chúng tơi: mẫu thảo dược thu thập để nghiên cứu, nguồn gốc, xuất xứ, điều kiện thu hái, chế biến, làm khô bảo quản Các mẫu thảo dược bị nhiễm nấm (ở ngồi đồng ruộng, trang trại, trình thu hoạch, chuyển, chế biến bảo quản) trước bán hiệu thuốc đông dược Tương tự, hàm ẩm dược thảo khơng kiểm sốt, theo dõi q trình làm khơ sau thu hoạch, bảo quản buôn bán hiệu thuốc đông dược Điều này, gây khó khăn cho việc đánh giá mối tương quan hàm ẩm dược thảo mức độ nhiễm nấm 3.4.2 Về mức độ nhiễm nấm - Từ kết phân lập, phân loại nấm từ 10 mẫu ý dĩ trình bày bảng 3.2 cho thấy: Các mẫu vị thuốc bị nhiễm chủ yếu loài chi Aspergillus Kết phù hợp với kết nghiên cứu số tác giả nước [5], [6], [10] nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc mycotoxin thảo dược Đây chi nấm thường nhiễm sản phẩm có nguồn gốc thực vật, loại quả, hạt trình bảo quản sinh nhiều độc tố [5] Trong loài chi phân lập đáng ý là: + Hai loài A parasiticus A flavus bị nhiễm cao thứ số chủng phân lập được, với số có mặt 50 70% số mẫu nghiên cứu, báo hiệu nguy cao bị nhiễm độc tố aflatoxin vị thuốc Lồi A ustus xếp vị trí thứ số chủng phân lập (chiếm 7,5%), cho thấy nguy nhiễm độc tố austamide, austdiol, austins austocystins [25] Với xuất 6,4% số chủng mẫu ý dĩ nghiên cứu, cho thấy mẫu ý dĩ có 28 nguy bị nhiễm độc tố ochratoxin A loài A niger tạo Hai loài A fumigatus A aculeatus có tỷ lệ chủng phân lập mức 2,9 4,1%, có nguy nhiễm độc tố loài nấm tạo gliotoxin, verrucologen, fumitremorgin A&B, fumitoxins, tryptoqquivalins [22], [25] + Chi Penicillium – nhóm nấm có nhiều lồi sinh độc tố Tuy nhiên, xuất với tỷ lệ chủng mức 1,2%, cho thấy nguy bị nhiễm độc tố chi nấm khơng cao + Nhóm nấm thứ phân lập mẫu ý dĩ nghiên cứu nấm tiếp hợp với loài phân lập Rhizopus stolonifer Absidia corymbifera, có tỷ lệ chủng phân lập 7,5% 5,8% Đây nhóm nấm sinh độc tố khả hoại sinh mạnh, làm giảm nhanh chất lượng dược thảo, cần lưu ý trình bảo quản [22], [25] 3.4.3 Về mức độ nhiễm độc tố aflatoxin Với kết phân tích độc tố aflatoxin mẫu ý dĩ nghiên cứu bảng 3.5 cho thấy, dược liệu bị nhiễm với tỷ lệ cao (vượt qui định cho phép nhiều lần DĐVN IV (Phụ lục 12.21) lượng aflatoxin B1 aflatoxin toàn phần Kết nghiên cứu phù hợp với số nghiên cứu nước [5], [14], [16] cho thấy, dược liệu mối đe dọa sức khỏe người tiêu dùng không bảo quản tốt Do vậy, nguồn liệu cần phải kiểm soát chặt chẽ, đặc biệt tiêu chuẩn aflatoxin trước đưa vào chế biến cho người sử dụng 29 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Qua q trình phân tích nấm aflatoxin nhiễm 10 mẫu ý dĩ thu thập từ hiệu thuốc đông dược địa bàn Hà Nội, rút số kết luận sau: 1.1 Mức độ nhiễm nấm mốc - Đã phân lập 173 chủng nấm, thuộc loài chi nấm gồm: Aspergillus, Penicillium, Rhizopus Absidia - Chi nấm Aspergillus có loài phân lập gồm: + Loài A parasiticus với số có nhiều 48,6% số có mặt 50% + Lồi A flavus có số có nhiều: 16,2%, số có mặt: 70% + Các lồi A ustus, A niger với số có nhiều có mặt 7,5%; 70% 6,4%; 70% + Các loài A aculeatus A fumigatus có số có nhiều số có mặt loài 4,1%; 50% 2,9%; 40% - Hai chi nấm tiếp hợp Rhizopus Absidia phân lập loài: R stolonifer A corymbifera với số có nhiều tỷ có mặt lồi 7,5%; 50% 5,8% 50% - Chi Penicillium với chủng phân lập (thuộc loài chưa xác định), chiếm tỷ lệ chủng 1,2% xuất 2/10 mẫu nghiên cứu 1.2 Về mức độ nhiễm aflatoxin - Ba mẫu ý dĩ nghiên cứu bị nhiễm aflatoxin với hàm lượng bảng đây: (Ghi chú: -: thấp giới hạn định lượng dưới) TT mẫu Hàm lượng aflatoxin dược liệu (ppb = ng/g) Toàn Mẫu TT G2 G1 B2 B1 phần 63A LÔ 276,3 12,7 17,7 306,7 24 LÔ 20,0 13,8 6,6 40,4 51A LÔ 57,6 5,8 4,8 68,2 30 Đề xuất kiến nghị 2.1 Đề xuất: Tiếp tục nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc aflatoxin vị thuốc ý dĩ với qui mô mẫu tăng thêm mở rộng phạm vi lấy mẫu 2.2 Kiến nghị: Nên có qui định cụ thể giới hạn tối đa cho phép độc tố aflatoxin thảo dược nói chung vị thuốc ý dĩ nói riêng (nhiều nước giới Trung Quốc, Hàn Quốc, Đức, Ý, Châu Âu có qui định cụ thể Dược điển [10], [13], [21]) Hiện tại, Việt Nam có qui định mức nhiễm tối đa cho phép aflatoxin (B1, aflatoxin toàn phần M1) lương thực thực phẩm [1], qui định chung cho dược liệu phụ lục PL12.21 DĐVN IV [2] 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ Y tế (2007), “Giới hạn tối đa nhiễm sinh học hóa học thực phẩm”, Ban hành kèm theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007 Bộ trưởng Bộ Y tế Bộ Y tế (2015), “Dược điển Việt Nam IV”, Nhà xuất Y học Trần Trịnh Công (2003), “Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc khả sinh aflatoxin nhóm Aspergillus flavus số vị thuốc đơng dược lưu hành địa bàn Hà Nội”, Luận văn Thạc sỹ Dược học, Đại học Dược Hà Nội Trần Trịnh Công cộng (2003), “Nghiên cứu mức độ nhiễm loài Aspergillus flavus aflatoxin hạt sen số địa điểm Hà Nội”, Tạp chí Dược học Trần Trịnh Công cộng (2008), “Phân lập nghiên cứu khả sinh độc tố số nấm mốc số vị thuốc đông dược Việt Nam”, Đề tài NCKH cấp Bộ Y tế Trần Trịnh Công cộng (2017), “Nghiên cứu tính đa dạng lồi chi Aspergillus Fr.: Fr vị thuốc ý dĩ (Semen Coicis) lưu hành số hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn Hà Nội”, Tạp chí Y học thực hành Bùi Xuân Đồng (2004), “Nguyên lý phòng chống nấm mốc mycotoxin”, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Đỗ Tất Lợi (1986), “Những thuốc vị thuốc Việt Nam”, Nhà Xuất khoa học kỹ thuật Hà Nộị Tiếng Anh: Al-juraifani A A (2011), “Natural occurrence of fungi and aflatoxins of cinnamon in the Saudi Arabia”, Afr J food Sci., Vol 5(8), pp.460-465 10 Ashiq S., et al (2014), “Natrural occurrence of mycotoxins in medicinal plants: A review”, Fungal genetics and biology 66, pp.1-10 32 11 Aziz N H et al (1998), “Contamination of some common medicinal plant samples and spices by fungi and their mycotoxins”, Bot Bull Acad Sin., Vol 39, pp.279-285 12 Barnett H L and Hunter B B (1972), “Illustrated Genera of Imperfect Fungi”, Burgess Publishing Company, Third Edition 13 Chen A J et al (2015), “Mycobiota and mycotoxins in traditional medicinal seeds from China”, Toxins 7, pp 3858-3875 14 Chien M-Y et al (2018), “Investigation of aflatoxins contamination in herbal materia medica in a Taiwan pharmaceutiacl factory”, Journal of food and drug analysis 26, pp 1154-1159 15 Didwania N and Joshi M (2013), “Mycotoxins: A critical review on occurrence and significance”, Int Pharm Pharm Sci., Vol 5, Issue 3, pp 1014-1019 16 Do K H et al (2015), “Nation-based occurrence and endogenous biological reduction of mycotoxins in medicinal herbs and spices”, Toxins 7, pp 4111-4130 17 Gautam A K., et al (2016), “Mycotoxins: the silent killers inside herbal drugs A critical review of the literature”, Bio bulletin, Vol 2(1), pp.26-39 18 Gonzalez H H L et al (1999), “Relationship between Fusarium and Alternaria alternate contamination and deoxynivalenol occurrence on Argentinian durum”, Mycopathologia, Vol 144, pp 97-102 19 IARC (2012), “Improving public health through mycotoxin control”, WHO Press 20 Khati P (2014), “Mycoflora and aflatoxin assessment of crude herbal drugs during storage in Haridwar, Uttarakhand, India”, Indian Phytopath., Vol 67(4), pp.407-411 21 Lee et al (2014), “Incidence and level of aflatoxins contamination in medicinal plants in Korea”, Mycobiology, Vol 42(4): 339-345 33 22 Pitt J I and Hocking A D (2009), “Fungi and Food Spoilage”, Academic Press 23 Raper K B and Fennell D I (1965), “Genus Aspergillus”, Baltimo, Williams and Wilkins, USA 24 Rizzo I., et al (2004), “Assessment of toxigenic fungi on Argentinean medicinal herbs”, Microbiological Research 159, pp.113-120 25 Samson R A et al (1995), “Introduction to food-borne fungi”, Fourth edition, CBS press 26 Santos L et al (2013), “Mycotoxin in medical/aromatic herbs – a review”, Boletín Latinoamericano y del Caribe de plants medicales y aromáticas 12(2), pp.119-142 27 Sauer D B and Burroughs R (1986), “Disinfection of seed surfaces with sodium hypochlorite”, Phytopathology Vol 76: 745-749 28 Sharma et al (2013), “Investigation on the mycoflora and mycotoxin contamination of dried medicinal leaves of Azadirachta indica A Juss., and Justicia adhatoda Linn., from Jammu and Kashmir state (India)”, International Journal of advanced research, Vol 1, Iss 4, pp.131-138 29 Siddique N A et al (2013), “Determination of aflatoxins in medicinal plants by high-performance liquid chromatography - tandem mass spectometry”, J Pharam Sci., Vol 16(2), pp.321-330 30 Walsh T J., et al (2008), “Treatment of aspergillosis: clinical practice guidelines of the infectous diseases society of America”, Clin Infect Dis., 46, pp 327-360 34 ... TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ TOÁN MÃ SINH VIÊN: 1502062 NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM NẤM MỐC VÀ AFLATOXIN TRÊN VỊ THUỐC Ý DĨ ( SEMEN COICIS) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn:... thuốc an tồn cho người sử dụng dược thảo nói chung, vị thuốc ý dĩ nói riêng, đề tài: ? ?Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc aflatoxin vị thuốc ý dĩ (Semen Coicis)? ?? thực với mục tiêu sau: Xác định mức. .. trình nghiên cứu 12 mức độ nhiễm nấm mốc aflatoxin tác giả Trần Trịnh Công cộng [5] vị thuốc gồm: Hạt sen (Semen Nelumbinis): 70 mẫu; Ngũ vị tử (Fructus Kadsurae), ý dĩ (Semen coicis): vị 20