NGHIÊN cứu TÍNH đa DẠNG LOÀI của CHI ASPERGILLUS FR FR và AFLATOXIN TRÊN hạt SEN (SEMEN NELUMBINIS NUCIFERAE)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ THỊ XN QUỲNH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG LỒI CỦA CHI ASPERGILLUS FR.: FR VÀ AFLATOXIN TRÊN HẠT SEN (SEMEN NELUMBINIS NUCIFERAE) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ THỊ XUÂN QUỲNH MÃ SINH VIÊN: 1401513 NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG LỒI CỦA CHI ASPERGILLUS FR.: FR VÀ AFLATOXIN TRÊN HẠT SEN (SEMEN NELUMBINIS NUCIFERAE) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Lê Thị Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh Sinh học Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương HÀ NỘI – 2019 MỤC LỤC DANH MỤC TÊN VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1.1 TỔNG QUAN Một vài nét chi Aspergillus Fr.: Fr 1.1.1 Đặc điểm hình thái chi Aspergillus 1.1.2 Vai trò tác dụng bất lợi chi Aspergillus đời sống 1.1.3 Vài nét độc tố aflatoxin 1.1.4 Vài nét chất hạt sen 1.2 Tình hình nghiên cứu chi Aspergillus độc tố thảo dược nước 1.3 Tình hình nghiên cứu Aspegillus độc tố thảo dược nước: 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, TRANG THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng, trang thiết bị nghiên cứu 14 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2 Môi trường phân lập xác định nấm mốc 14 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 15 2.3.2 Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu 15 2.3.3 Phương pháp phân lập nấm mốc 15 2.3.4 Phương pháp phân loại nấm mốc 16 2.3.5 Các số đánh giá mức độ nhiễm nấm 16 2.3.6 Phương pháp phân tích aflatoxin 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Hàm ẩm mẫu hạt sen nghiên cứu 20 3.2 Mức độ nhiễm loài chi Aspergillus Fr.: Fr hạt sen 20 3.3 Mức độ nhiễm aflatoxin tự nhiên mẫu hạt sen nghiên cứu 26 3.3.1 Kết kiểm tra độ thích hợp hệ thống 26 3.3.2 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính phân tích aflatoxin 26 3.3.3 Kết xác định hàm lượng aflatoxin mẫu hạt sen 28 BÀN LUẬN 30 Hàm ẩm dược liệu 30 Mức độ nhiễm loài thuộc chi Aspergillus 30 Mức độ nhiễm aflatoxin 31 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33 Kết luận 33 Đề xuất 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng chân thành biết ơn sâu sắc đến người thầy ThS Lê Thị Thu Hương – Giảng viên Bộ môn Vi sinh Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội Cơ tận tình bảo, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện để thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới TS Trần Trịnh Công – Giảng viên Bộ môn Vi sinh Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, thầy cô Hương hướng dẫn, giảng dạy cặn kẽ, tận tình đồng thời giúp đỡ, động viên tơi nhiệt tình suốt thời gian tơi thực khóa luận môn Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo, cô giáo, chị kỹ thuật viên Bộ mơn Vi sinh Sinh học tồn thể thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội – người thầy chia sẻ giúp tơi có kiến thức q báu học tập hành trang q trình thực khóa luận Qua đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn Trần Quỳnh Anh, Mai Thị Kim Oanh bạn, chị, em sinh viên nghiên cứu khoa học Bộ môn Vi Sinh Sinh học người động viên, giúp đỡ tơi nhiều từ khóa luận bắt đầu tiến hành kết thúc Cuối cùng, tơi muốn gửi đến bố mẹ tơi, gia đình tôi, mảnh đất nơi sinh tôi, nuôi dưỡng lớn lên bên cạnh động viên suốt năm tháng qua lời cảm ơn chân thành sâu sắc Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2019 Sinh viên Hồ Thị Xuân Quỳnh DANH MỤC TÊN VIẾT TẮT ADM (AFPA): Aspergillus Differentiation Medium Base AOAC: Association of Official Analytical Chemist A flavus: Aspergillus flavus A fumigatus : Aspergillus fumigatus A niger: Aspergillus niger A paraciticus: Aspergillus paraciticus A penicillioides: Aspergillus penicillioides A tamarii: Aspergillus tamarii A terreus: Aspergillus terreus A ustus: Aspergillus ustus DĐVN IV: Dược điển Việt Nam IV DGM: Dichloran Glycerol Medium Base FQ: Isolation Frequency HPLC: High Performance Liquid Chromatography HPLC MS/MS: Ultra performance liquid chromatography – tandem mass spectrometry IARC: International Agency for Research LFT: Lateral flow test LÔ: Phố Lãn Ông MEA: Malt Extra Agar PDA: Potato Dextrose Agar PPB: Parts per billion RD: Relative Fungal Density TRC: Tolco research company USFDA: United States Food and Drug Administration DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Các chất aflatoxin chuẩn sử dụng 18 Bảng 3.1 Hàm ẩm mẫu hạt sen nghiên cứu 20 Bảng 3.2 Các loài chủ yếu số lượng chủng chi Aspergillus phân lập từ 10 mẫu hạt sen 21 Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc số loài quan trọng phân lập từ mẫu hạt sen nghiên cứu (môi trường Czapek Dox, 30℃, ngày nuôi) 22 Bảng 3.4 Đặc điểm vi học số loài quan trọng phân lập từ mẫu hạt sen nghiên cứu (môi trường Czapek Dox, 30℃, ngày nuôi) 22 Bảng 3.5 Kết kiểm tra độ thích hợp hệ thống HPLC 26 Bảng 3.6 Kết biểu thị phụ thuộc diện tích pic (A) nồng độ aflatoxin (C) 27 Bảng 3.7 Kết định lượng aflatoxin số mẫu hạt sen thu thập từ hiệu thuốc đông dược 28 Bảng 3.8 Tần suất xuất mật độ loài thuộc chi Aspergillus Fr.: Fr 10 mẫu hạt sen nghiên cứu 33 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Hệ bào tử trần bọng đỉnh giá mang thể bình mang cuống thể bình, thể bình số lồi thuộc chi Aspergillus Hình 1.2 Công thức cấu tạo aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1, M2, B2A, G2A Hình 3.1 Loài A flavus nhiễm vị thuốc hạt sen 23 Hình 3.2 Loài A tamarii nhiễm vị thuốc hạt sen 24 Hình 3.3 Loài A niger nhiễm vị thuốc hạt sen 25 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích pic nồng độ aflatoxin 27 ĐẶT VẤN ĐỀ Các nguyên liệu làm thuốc có nguồn gốc thực vật sản phẩm chúng thường nhạy cảm với nấm mốc, điều kiện khí hậu nóng ẩm Việt Nam Khi bị nấm mốc xâm nhiễm phát triển sản phẩm bị giảm chất lượng nên bị giảm hiệu điều trị Ngoài ra, sản phẩm bị nhiễm độc tố nấm (mycotoxin), gây an toàn cho người sử dụng [5], [18], [21] Hạt sen (Semen Nelumbinis nuciferae) gọi thạch liên tử hay liên nhục, thường sử dụng đông y để chữa trị lỵ cấm khẩu, thuốc bổ, cố tinh, chữa di tinh, ngủ, thần kinh suy nhược…[3] Tuy nhiên, đề tài nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc aflatoxin vị thuốc Để góp phần đảm bảo hiệu sử dụng an tồn cho người tiêu dùng thảo dược nói chung, hạt sen nói riêng, đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng loài chi Aspergillus Fr.: Fr aflatoxin hạt sen (Semen Nelumbinis nuciferae)” thực với mục tiêu sau: Xác định mức độ nhiễm lồi thuộc chi Aspergillus hạt sen Phân tích aflatoxin nhiễm mẫu hạt sen nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Một vài nét chi Aspergillus Fr.: Fr 1.1.1 Đặc điểm hình thái chi Aspergillus Chi Aspergillus P.A Micheli lần mô tả năm 1729 (Maren A Klich, 2002), sau đến năm 1832 Fries chấp nhận theo luật quốc tế danh pháp thực vật, chi Aspergillus thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries Sau Fries lại xem xét bổ sung nên mang tên Aspergillus Fries ex Fries Hệ thống phân loại chi Aspergillus Raper Fennell (1965) gồm 18 nhóm có 132 lồi với 18 thứ Samson (1979, 1992, 1994a & b) cơng bố sưu tập liệu lồi, thứ mô tả từ 1965 bất hợp lý số taxon cơng bố Đến nay, số lượng lồi chi phát tới 200 loài, có khoảng 70 lồi trạng thái hữu tính, khoảng 20 lồi gây hại cho người Chi Aspergillus Fries ex Fries đặc trưng đặc điểm sau: Hệ sợi nấm gồm sợi có vách ngăn, phân nhánh, không màu, màu nhạt số vùng định khuẩn lạc trở thành màu nâu hay màu sẫm, chí số ngả màu xanh khác vùng khác Chi Aspergillus sinh sản chủ yếu hình thức vơ tính bào tử trần (conidia) Hình thái hệ bào tử trần đặc điểm chủ yếu đặc trưng dùng phân loại chi Cấu trúc mang bào tử trần phát triển từ tế bào có đường kính lớn hơn, thành tế bào dày đoạn lân cận sợi nấm (tế bào chân – foot cell) Giá bào tử trần (conidiophore) phát triển từ tế bào chân, nhánh sợi nấm, gần thẳng gốc với trục tế bào chân thường mặt chất Giá cấu tạo cuống (stipe) khơng phân nhánh, khơng có có vách ngang, với phần đỉnh phồng to gọi bọng (vesicle) hình chùy, hình elip, hình bầu, hình bàn trang (phần đỉnh bọng giá thẳng), hình cầu nửa cầu Bọng mang thể bình Các thể bình song song hợp thành cụm phần bọng, xếp thành tia sát tồn bề mặt bọng Các thể bình (phialide) gọi thể bình tầng (uniseriate phialide), thể bình hai tầng (biseriate phialide) Trong trường hợp sau, thể bình cấp (cũng gọi cuống thể bình, metula) mang cụm gồm hai ba, nhiều thể bình cấp hai phần đỉnh Conidi (Conidium) tạo thành nối tiếp miệng thể bình, thành chuỗi hướng góc (bào tử miệng thể bình bào tử non (a) (b) (c) (d) Hình 3.2 Loài A tamarii nhiễm vị thuốc hạt sen: (a): Loài A tamarii nhiễm mẫu 30 LƠ (mơi trường DGM); (b): Khuẩn lạc mơi trường Czapek Dox (25oC, ngày nuôi); (c) & (d): Cấu trúc sinh conidi tầng & conidi 24 (a) (b) (c) (d) Hình 3.3 Loài A niger nhiễm vị thuốc hạt sen: (a): Loài A niger nhiễm mẫu 55 LƠ (mơi trường PDA); (b) (c): Mặt trước sau khuẩn lạc Czapek Dox (25oC, ngày nuôi); (d): Conidi cấu trúc sinh conidi tầng loài 25 3.3 Mức độ nhiễm aflatoxin tự nhiên mẫu hạt sen nghiên cứu 3.3.1 Kết kiểm tra độ thích hợp hệ thống Tiến hành xác định tính phù hợp của hệ thống HPLC mô tả phần phương pháp Yêu cầu kết độ phân giải (RS) aflatoxin phải không 1,5 RSD thông số : thời gian lưu, diện tích pic aflatoxin phải khơng lớn 2,0% Mỗi ngày phân tích kiểm tra tiêu trước tiến hành tiến hành phân tích độ phù hợp hệ thống đạt yêu cầu Ở đây, giới hạn quy mô đề tài nghiên cứu, xin đưa kết RSD thơng số diện tích pic aflatoxin kiểm tra độ thích hợp hệ thống HPLC Shimadzu LC-20AD mà sử dụng Bảng 3.5 trình bày kết kiểm tra độ thích hợp hệ thống thơng qua thơng số RSD diện tích pic aflatoxin phân tích độc tố aflatoxin mẫu hạt sen nghiên cứu Bảng 3.5 Kết kiểm tra độ thích hợp hệ thống HPLC Aflatoxin G2 G1 B2 B1 5793400 94670 2161354 161592 5799218 92349 2162930 164403 5800645 93693 2162760 162977 5791241 92403 2158030 161329 5792660 92572 2157270 161244 5790441 92002 2161742 160272 RSD 0.1 1.1 0.1 0.9 Nhận xét: Với kết RSD dao động khoảng 0,1-1,1 (˂ 2%) cho thấy hệ thống ổn định, thích hợp cho việc phân tích độc tố aflatoxin 3.3.2 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính phân tích aflatoxin Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn aflatoxin với điều kiện sắc ký mô tả phần phương pháp Yêu cầu đường hồi quy thu phải có dạng đường thẳng giá trị hệ số tương quan phải không nhỏ 0,99 Kết thu biểu thị diện tích pic (A) aflatoxin trình bày bảng 3.6 hình 3.4 26 Bảng 3.6 Kết biểu thị phụ thuộc diện tích pic (A) nồng độ aflatoxin (C) Aflatoxin G1 C (ng/ml) A 1.6 6970 Aflatoxin G2 C (ng/ml) A 0.4 115330 Aflatoxin B1 C (ng/ml) A 1.6 12060 Aflatoxin B2 C (ng/ml) A 0.4 32231 3.2 13457 0.8 231571 3.2 26236 0.8 63416 6.4 26509 1.6 457384 6.4 50091 1.6 125339 12.8 54359 3.2 913846 12.8 102271 3.2 250812 25.6 110537 6.4 1893289 25.6 205359 6.4 515583 y =4326,4x– 551,3 y=296045x– 11907,5 y = 8037,2x – 525,9 y=80552,4x -2293,8 R2 = 0,9998 R2 = 0,9997 R2 = 0,9999 G1 G2 y = 4326.4x - 551.33 R² = 0.9998 120000 Diện tích pic A DIện tích pic A 100000 80000 60000 40000 20000 0 10 20 y = 296045x - 11907 R² = 0.9997 2000000 1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 30 nồng độ aflatoxin C B2 y = 80552,4x - 2293.8 R² = 0.9998 250000 600000 200000 500000 Diện tích pic A Diện tích pic A Nồng độ aflatoxin C y = 8037.2x - 525.88 R² = 0.9999 B1 R2 = 0,9998 150000 100000 50000 400000 300000 200000 100000 0 10 20 30 Nồng độ aflatoxin C Nồng độ aflatoxin C Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích pic nồng độ aflatoxin 27 Nhận xét: Kết bảng 3.6 hình 3.4 cho thấy, khoảng nồng độ khảo sát đường hồi qui có dạng đường thẳng tất R2 tất đồ thị khơng nhỏ 0,99 Do chúng tơi kết luận có tương quan tuyến tính chặt chẽ đáp ứng phân tích nồng độ aflatoxin 3.3.3 Kết xác định hàm lượng aflatoxin mẫu hạt sen Chúng chọn 3/10 mẫu hạt sen có mức độ nhiễm lồi A flavus cao (30 LÔ, 44A LÔ 62 LÔ), với tỷ lệ 10-30 chủng/ mẫu chọn để phân tích độc tố aflatoxin tự nhiên (thu thập từ hiệu thuốc) Kết phân tích liệt kê bảng 3.7 Bảng 3.7 Kết định lượng aflatoxin số mẫu hạt sen thu thập từ hiệu thuốc đông dược Hàm lượng aflatoxin dược liệu (ppb = ng/g) TT mẫu TT Mẫu G2 G1 B2 B1 Toàn phần 30 LÔ - N/A 62,5 3,3 65,8 44A LÔ - N/A 51,1 13,6 64,7 62 LÔ - 3,3 14,1 2,8 20,2 Khoảng dao động - 0,0-3,3 14,1-62,5 2,8-13,6 20,2-65,8 (Ghi N/A: không phát được; -: thấp giới hạn định lượng dưới) Nhận xét: Qua kết bảng 3.7 cho thấy: Trong mẫu hạt sen phân tích độc tố, mẫu bị nhiễm aflatoxin toàn phần (B1+B2+G1+G2) dao động khoảng 20,2 – 65,8 ppb (ng/g), tất mẫu bị nhiễm vượt qui định cho phép ngành Y tế (lượng aflatoxin toàn phần vượt ng/g) Trong loại aflatoxin phân tích loại aflatoxin B1 B2 thường tạo với lượng cao aflatoxin G1 G2 Trong hàm lượng B2 tạo với hàm lượng cao tất mẫu Cả 3/3 mẫu bị nhiễm aflatoxin B1 với hàm lượng dao động từ 2,8-13,6 ppb có 3/3 mẫu bị nhiễm vượt qui định cho phép ngành Y tế (lượng aflatoxin B1 vượt ng/g) Afatoxin B2 phát mẫu, hàm lượng dao động 14,1 – 62,5 ppb, cao nhiều 3-20 lần so với hàm lượng B1 mẫu Aflatoxin G1 tạo 1/3 mẫu với hàm lượng tương đối thấp 3,3 ppb Hai mẫu lại khơng phát độc tố aflatoxin G1 mẫu Hàm lượng aflatoxin G2 thấp giới hạn 28 định lượng mẫu Điều hồn tồn lý giải chủng nấm A flavus bị nhiễm khơng có khả sinh độc tố aflatoxin G1, G2, mà sinh độc tố B1, B2 chủ yếu Thêm vào đó, tất mẫu nghiên cứu lại khơng có có mặt lồi A parasiticus, chủng nấm có khả sản xuất độc tố aflatoxin G2 Với kết cho thấy hạt sen với thành phần hố học giàu tinh bột, đường, có protid, lipid acid amin asparagin cung cấp nguồn dinh dưỡng thuận lợi cho phát triển loài A flavus tạo thành aflatoxin, có xâm nhiễm phát triển loài 29 BÀN LUẬN Hàm ẩm dược liệu Từ kết xác định hàm ẩm mẫu hạt sen nghiên cứu (bảng 3.1) số lượng chủng loài chủ yếu phân lập từ mẫu hạt sen nghiên cứu (bảng 3.2) cho thấy: Trong 10 mẫu nghiên cứu, có mẫu hạt sen có hàm ẩm đạt yêu cầu DĐVN IV, mẫu lại khơng đạt u cầu Nhưng tất mẫu thảo dược hạt sen bị nhiễm nấm, với số chủng phân lập mẫu dao động từ – 23 chủng Đồng thời, khác biệt mức độ nhiễm nấm mẫu có hàm ẩm đạt không đạt yêu cầu Dược điển khơng rõ ràng, chí có mẫu có mức độ nhiễm nấm cao lại có hàm ẩm thấp ngược lại Đặc biệt, mẫu 30 LƠ có số chủng phân lập cao với 23 mẫu mẫu đạt yêu cầu tiêu hàm ẩm so với qui định DĐVN IV (9,8%) Đây kết không logic, thường mẫu có hàm ẩm cao có tỷ lệ nhiệm nấm cao Giải thích cho kết này, theo mẫu thảo dược thu thập ngẫu nhiên để nghiên cứu, khơng có nguồn gốc, xuất xứ điều kiện thu hái, chế biến, làm khơ bảo quản trước Các mẫu thảo dược bị nhiễm nấm (ở ngồi đồng ruộng, trang trại, q trình thu hoạch, chuyển, chế biến bảo quản) trước bán hiệu thuốc đông dược Do vậy, để đánh giá ảnh hưởng hàm ẩm tới mức độ nhiễm nấm, thảo dược cần phải giám sát q trình ni trồng, thu hái, chế biến (đặc biệt q trình làm khơ) vận chuyển phân phối đến tận tay người tiêu dùng Mức độ nhiễm loài thuộc chi Aspergillus Từ kết phân lập, phân loại nấm từ 10 mẫu hạt sen nghiên cứu trình bày bảng 3.2 cho thấy: Các vị thuốc hạt sen bị nhiễm đa dạng loài thuộc chi Aspergillus Điều chứng tỏ mẫu dược liệu có khả bị nhiễm đồng thời nhiều loại độc tố khác nhau, từ gây cho người sử dụng nhiều bệnh tật khác như: ung thư, bệnh hội, bệnh thận, Loài A flavus phân lập vị trí thứ (với tỷ lệ chủng 59,3%), hai lồi nấm có khả sinh độc tố aflatoxin [22], [36], [39] Điều cho thấy mẫu vị thuốc hạt sen nghiên cứu có khả bị nhiễm độc tố gây ung thư cần lưu ý 30 trình thu hoạch, chế biến bảo quản, sử dụng Kết phù hợp với kết nghiên cứu Trần Trịnh Công cộng [6], [8] (với tỉ lệ chủng 71,32 % , 20/70 mẫu hạt sen nghiên cứu), kết Nguyễn Thị Sinh [12], Nguyễn Hữu Tuấn [15], Mai Thị Ánh [1] nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc aflatoxin mẫu hạt sen dùng để điều chế sản phẩm Xếp thứ số chủng phân lập mẫu hạt sen nghiên cứu loài A tamarii, lồi có khả sinh độc tố acid cyclopiazonic, fumigaclavin [39] Lồi A fumigatus xếp vị trí thứ với 8,8% số chủng phân lập Bên cạnh khả gây bệnh nấm hội phổ biến người Thêm vào đó, lồi có khả sinh độc tố gliotoxin, verrucologen, fumitremorgin A&B, fumitoxin [39], nên cần lưu ý để kiểm sốt Lồi A niger phân lập chủng xếp vị trí thứ (với tỷ lệ chủng phân lập tỷ lệ mẫu có mặt lồi 6,2 50%), cho thấy mẫu vị thuốc có khả bị nhiễm độc tố ochratoxin A, lồi có khả sinh độc tố gây hại thận [22] Các loài A aculeatus A ustus có tỷ lệ chủng phân lập mức 3,5% 5,3%, cho thấy khả bị nhiễm độc tố loài hạt sen austamide, austdiol, austin, austocystin [39] Mức độ nhiễm aflatoxin Với kết phân tích độc tố aflatoxin từ 10 mẫu hạt sen trình bày bảng 3.7 cho thấy: Cả mẫu hạt sen phân tích độc tố mẫu có tỷ lệ nhiễm A.flavus nhiều tất 10 mẫu Kết phân tích cho thấy mẫu dược liệu bị nhiễm aflatoxin toàn phần (dao động từ 20,2 – 65,8 ppb), vượt ngưỡng qui định cho phép ngành Y tế gấp – 17 lần Đồng thời mẫu nhiễm aflatxoin B1 với hàm lượng dao động từ 2,8 – 13,6, vượt ngưỡng qui định ngày Y tế từ 1,4 – lần [2], [3] Điều cho thấy mối nguy mắc bệnh ung thư bệnh khác người vơ tình sử dụng mẫu dược liệu Đây thực trạng nhiễm độc tố aflatoxin đáng báo động vị thuốc hạt sen, cần lưu ý bảo quản sử dụng cách cẩn thận dược liệu Ngồi ra, mẫu có nhiễm hàm lượng aflatoxin B cao (dao động từ 14,1 – 62,5 ppb) Sự có mặt hai độc tố lại G1, G2 mẫu dược liệu 31 thấp (chỉ có mặt 1/3 mẫu với hàm lượng 3,3 ppb) chí không đo thấp giới hạn định lượng máy Nồng độ G1, G2 hoàn toàn phù hợp A flavus hầu hết sinh B1,B2 không sinh G1, G2 Những kết hoàn toàn phù hợp với kết nghiên cứu số tác giả ngồi nước Trần Trịnh Cơng cộng sự, Mei -Yin Chien cộng [6], [34] phân lập nghiên cứu khả sinh độc tố số nấm mốc cấc vị thuốc đông dược Việt Nam 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Từ kết phân tích nấm aflatoxin 10 mẫu hạt sen thu thập từ hiệu thuốc đông dược địa bàn Hà Nội, rút số kết luận sau: Mười mẫu vị thuốc hạt sen nghiên cứu, có hàm ẩm dao động từ 8,6 – 12,7% bị nhiễm nấm mốc với số chủng phân lập dao động từ – 23 chủng/mẫu Từ 10 mẫu hạt sen nghiên cứu phân lập thu 113 chủng nấm thuộc lồi chi Aspergillus Fr.: Fr trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8 Tần suất xuất mật độ loài thuộc chi Aspergillus Fr.: Fr 10 mẫu hạt sen nghiên cứu Loài A flavus A tamarii A fumigatus A niger A aculeatus A ustus FQ (%) 70 90 60 50 40 50 RD (%) 59.3 16.8 8.8 6.2 3.5 5.3 Về mức độ nhiễm aflatoxin tự nhiên, tiến hành phân tích mẫu hạt sen có mức độ nhiễm nấm A flavus nhiều ba mẫu hàm lượng aflatoxin toàn phần, aflatoxin B1, B2 dao động khoảng là: 20,2 – 65,8 ppb; 2,8 – 13,6 ppb 14,1 – 62,5 ppb Aflatoxin G1 tạo mẫu nghiên cứu 62 LÔ với hàm lượng 3,3 ppb Hàm lượng aflatoxin G2 thấp giới hạn định lượng mẫu nên định lượng Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc độc tố aflatoxin vị thuốc hạt sen việc tăng số lượng mẫu, phạm vi địa lý lấy mẫu nghiên cứu cách đầy đủ tất giai đoạn - Cần mở rộng phạm vi nghiên cứu vị thuốc đông dược khác, để có đánh giá đầy đủ tồn diện mức độ nhiễm nấm mốc, độc tố nấm mốc - Cần triển khai nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng tới hình thành độc tố nấm mốc, đặc biệt aflatoxin dược liệu, để từ đề xuất biện pháp phòng tránh cách cụ thể, có hiệu hơn, góp phần đảm bảo an tồn hiệu điều trị thuốc đơng dược nói chung dược liệu hạt sen nói riêng 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Mai Thị Ánh (2008), Nghiên cứu khả sinh độc tố Aflatoxin loài Aspegillus flavus chất hạt sen điều kiện phòng thí nghiệm, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Bộ Y tế (2011), Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia giới hạn ô nhiễm độc tố vi nấm thực phẩm, pp 1-2 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam 4, Nhà xuất y học, pp 231-388 Bộ Y Tế (2008), Vi sinh vật học, Nhà xuất giáo dục, pp 260-291 Trần Trịnh Công (2003), Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc khả sinh aflatoxin nhóm Aspergillus flavus số vị thuốc đông dược lưu hành địa bàn Hà Nội, Luận văn Thạc sỹ Dược học, Đại học Dược Hà Nội Trần Trịnh Công cộng (2008), Phân lập nghiên cứu khả sinh độc tố số nấm mốc số vị thuốc đông dược Việt Nam, Đề tài NCKH cấp Bộ Y tế, Hà Nội Trần Trịnh Công cộng (2005), "Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc aflatoxin hạt sen số địa điểm thuộc tỉnh Hà Nội, Hà Tây Bắc Ninh", Tạp chí Y học thực hành Trần Trịnh Công cộng (2003), "Nghiên cứu mức độ nhiễm loài Aspergillus flavus aflatoxin hạt sen số địa điểm Hà Nội", Tạp chí Dược học Võ Thị Kiên Hảo (2008), Hoàn thiện quy trình lạnh đơng trữ đơng hạt sen bóc vỏ, Luận văn tốt nghiệp kỹ sư, Trường Đại học Cần Thơ, pp 10-19 10 Nguyễn Thị Lý (2008), Nghiên cứu tính đa dạng lồi chi Aspergillus aflatoxin vị thuốc ý dĩ, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội 11 Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội, pp 339-347 12 Nguyễn Thị Sinh (1984), Góp phần nghiên cứu hệ vi nấm đặc trưng dược liệu kho, Luận án PTS Dược học, Đại học Dược Hà Nội, pp 92-99 13 Nguyễn Thị Hồi Thu (2010), Nghiên cứu tính đa dạng loài chi Aspergillus aflatoxin vị thuốc hạt cau cát sâm lưu hành hiệu thuốc đơng dược thuộc địa bàn Hà Nội, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội 14 Võ Thị Thanh Trang (2009), Bước đầu xây dựng phương pháp phát Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin ngũ cốc phương pháp phát quang, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh, pp 20-35 15 Nguyễn Hữu Tuấn (1992), Thăm dò có mặt Aspergillus flavus Link ex Fries khả tạo thành aflatoxin vị thuốc nam bắc có nguồn gốc thực vật, Khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học, Đại học Dược Hà Nội, pp 28-32 16 Nguyễn Thị Cẩm Vi (2018), "AFLATOXIN – Hiểm họa từ nông sản nhiễm mốc", Khoa Khoa học Ứng dụng Kỹ thuật hóa học Công nghệ sinh học, Đại học Tôn Đức Thắng, pp 23-35 Tiếng Anh 17 Aziz N H et al (1998), "Contamination of some common medicinal plant samples and spices by fungi and their mycotoxins", Bot Bull Acad Sin., 39, pp 279-285 18 Ashiq S et al (2014), "Natrural occurrence of mycotoxins in medicinal plants: A review", Fungal genetics and biology 66, pp 1-10 19 Barnett H L and Hunter B (1972), Illustrated Genera of Imperfect Fungi, Burgess Publishing Company, Third Edition, pp 35-90 20 Betina V (1984), Mycotoxins: Production, Isolation, Separation and Purification, Elsevier, Amsterdam-Oxford-New York-Tokyo., pp 3-59; 90-125 21 Cong T T (2007), "Studies on mycoflora and aflatoxins in lotus seeds in Vietnam", The fifth Indochina conference on pharmaceutical science, Banglok, Thailand 22 Didwania N and Joshi M (2013), "Mycotoxins: A critical review on occurrence and significance", Int Pharm Pharm Sci., 5(3), pp 1014-1019 23 Dohnal V Wu Q , Kuca K (2014), "Metabolism of aflatoxins: key enzymes and interindividual as well as interspecies differences", Arch Toxicol, 88(9), pp 1635– 1644 24 Donia Abou (2008), "Microbiological quality and aflatoxinogenesis of Egyptian spices and medicinal plants", Global veterinaria, 2(4), pp 175-181 25 Elizabeth L.H Moris A G., Frank C.R (1973), Laboratory Identification of Pathogenic Fungi Simplified, Springfield-Illinois-USA, pp 138-145 26 Gautam A K et al.(2016), "Mycotoxins: the silent killers inside herbal drugs A critical review of the literature", Bio bulletin, 2(1), pp 26-39 27 Gautam A K and Bhadauria R (2009), "Mycoflora and mycotoxins in some important stored crude and powered herbal drugs", Biological forum - An international Journal, 1(1), pp 1-7 28 Gonzalez H H L et al (1999), "Relationship between Fusarium and Alternaria alternate contamination and deoxynivalenol occurrence on Argentinian durum", Mycopathologia, 144, pp 97-102 29 James G.C Natalie S (1996), A Laboratory Manual, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., pp 199-213 30 Khati P (2014), "Mycoflora and aflatoxin assessment of crude herbal drugs during storage in Haridwar, Uttarakhand, India", Indian Phytopath, 67(4), pp 407-411 31 Kumar P., Mahato D K., et al (2016), "Aflatoxins: A Global Concern for Food Safety, Human Health and Their Management", Front Microbiol, 7, pp 2170 32 Mahajan S et al (2014), "Isolation and identification of fungal contamination in stored medicinal plants", American journal of pharmacology and pharmacotherapeutics, 1(2), pp 052-058 33 Matei S et al (2015), "Medicinal plants used for tea, mycological and mycotoxilogical potential", Bulletin UASVM veterinary medicine, 72(2), pp 352356 34 Mei -Yin Chien, Chih - Min Yang, Chih - Min Huang, Chao - Hsiang Chen (2017), "Investigation of Aflatoxin contamination in herbal materia medica in a Taiwan pharmaceutical factory", Science Direct, pp 1154-1159 35 Njumbe Ediage E, Diana Di Mavungu J, et al (2013), "Multimycotoxin analysis in urines to assess infant exposure: a case study in Cameroon", Environ Int., pp 5059 36 Pitt J.I and Hocking A.D (2009), “Fungi and Food Spoilage”, Academic Press, pp 35 - 110 37 Raper K.B and Fennell D.I (1965), "Genus Aspergillus", pp 58-91 38 Rizzo I et al (2004), "Assessment of toxigenic fungi on Argentinean medicinal herbs", Microbiological Research, 159, pp 113-120 39 Samson R A et al (1995), Introduction to food-borne fungi, Fourth edition, CBS press, pp 3-221 40 Santos L et al (2013), "Mycotoxin in medical/aromatic herbs – a review", Boletín Latinoamericano y del Caribe de plants medicales y aromáticas, 12(2), pp 119-142 41 Sharma et al (2013), "Investigation on the mycoflora and mycotoxin contamination of dried medicinal leaves of Azadirachta indica A Juss., and Justicia adhatoda Linn., from Jammu and Kashmir state (India)", International Journal of advanced research, 1(4), pp 131-138 42 Sharma S et al (2016), "Natural occurrence of diverse fungal species and their toxin in dried fruits of Emblica officinalis, Terminalia chebula and T bellerica – constituents of triphala, an important Ayurvedic preparation of India", IOSR journal of pharmacy and biological sciences, 11(1), pp 06-13 43 Tosun H et al (2016), "Occurrence of aflatoxins (B1, B2, G1, G2) in herbal tea consumed in Turkey", Journal of consumer protection and food safety, pp 1-5 ... HÀ NỘI HỒ THỊ XUÂN QUỲNH MÃ SINH VIÊN: 1401513 NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG LOÀI CỦA CHI ASPERGILLUS FR. : FR VÀ AFLATOXIN TRÊN HẠT SEN (SEMEN NELUMBINIS NUCIFERAE) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người... chi Aspergillus Fr. : Fr aflatoxin hạt sen (Semen Nelumbinis nuciferae) thực với mục tiêu sau: Xác định mức độ nhiễm loài thuộc chi Aspergillus hạt sen Phân tích aflatoxin nhiễm mẫu hạt sen nghiên. .. aflatoxin 17 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Hàm ẩm mẫu hạt sen nghiên cứu 20 3.2 Mức độ nhiễm loài chi Aspergillus Fr. : Fr hạt sen 20 3.3 Mức độ nhiễm aflatoxin