Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây kim tiền thảo desmodium styracifolium (osb )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu thành phần hố học hoạt tính sinh học kim tiền thảo Desmodium styracifolium (Osb.) ĐỖ THỊ HỒI THU thu.dthcb190131@sis.hust.edu.vn Ngành Kỹ thuật hố học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Vũ Đình Hồng1 PGS TS Lê Đăng Quang2 Chữ ký GVHD Viện: Viện Kỹ thuật Hoá học, ĐHBKHN Viện Hoá học Công nghiệp Việt Nam HÀ NỘI, 04/2021 Lời cảm ơn Luận văn hồn thành Viện Hố học Cơng nghiệp Việt Nam Trong q trình nghiên cứu, nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô, nhà khoa học, bạn bè gia đình Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Vũ Đình Hồng PGS TS Lê Đăng Quang – người thầy tận tâm hướng dẫn, động viên, khích lệ tạo điều kiện thuận lợi giúp định hướng đường nghiên cứu suốt trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ phát triển khoa học công nghệ Việt Nam (NAFOSTED) tài trợ kinh phí theo mã số đề tài 106.03-2019.17 Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè ln quan tâm, động viên tơi suốt trình học tập nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn! Tóm tắt nội dung luận văn Những vấn đề mà luận văn cần tập trung thực bao gồm: đánh giá tiềm hoạt tính sinh học loài kim tiền thảo D styracifolium; thực nghiên cứu phân lập hợp chất có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trồng từ mẫu nghiên cứu; làm rõ hiệu lực tác dụng định lượng hoạt tính hợp chất phân lập Phương pháp thực hiện: thực phương pháp tách chiết định hướng hoạt tính mẫu thực vật nghiên cứu - Các phương pháp hóa học: xử lý thơ mẫu thực vật (phơi khô, xay nhỏ, ngâm chiết dung môi hữu cơ, chiết phân bố lỏng-lỏng); phân lập chất phương pháp sắc ký cột pha thường, pha đảo, sắc ký lọc gel, sắc ký điều chế , tinh chế sử dụng sắc ký lặp lại, kết tinh; - Các phương pháp phổ phân tích cấu trúc: Sử dụng phương pháp vật lý đại MS, NMR chiều (1H-NMR, 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC) để xác định cấu trúc hợp chất phân lập được; - Các phương pháp đánh giá khả bảo vệ thực vật: đánh giá hoạt tính bảo vệ thực vật mẫu phân đoạn hợp chất phân lập phương pháp thử hoạt tính in vitro in vivo: nghiên cứu in vitro sử dụng kỹ thuật poisoned food-poisoned techniques để xác định giá trị IC50 (90) phịng thí nghiệm; nghiên cứu in vivo hiệu lực tác dụng bệnh trồng chất có hoạt tính phương pháp thử nhà kính Đây nghiên cứu có hệ thống tính chất lồi kim tiền thảo D styracifolium thể hoạt tính kháng nấm gây bệnh trồng Kết nghiên cứu thu hoàn toàn phù hợp với vấn đề đặt ra: đánh giá mẫu kim tiền thảo có tiềm hoạt tính sinh học, phân lập 06 hoạt chất từ mẫu nghiên cứu hợp chất có khả ức chế nấm thử nghiệm Các liệu hoạt tính mang tính có ý nghĩa khoa học, từ xây dựng sở thành phần hoạt chất triển vọng phát triển thành thuốc BVTV thảo mộc trừ nấm gây bệnh trồng từ mẫu kim tiền thảo D styracifolium HỌC VIÊN Ký ghi rõ họ tên i Formatted: Font color: Text MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH VẼ vii DANH MỤC BẢNG BIỂU viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 1.2 Tổng quan loài thuộc chi Desmodium 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Thành phần hoá học 1.1.4 Tác dụng sinh học số loài thuộc chi Desmodium 19 Đặc điểm sinh học hoạt tính kim tiền thảo Desmodium styracifolium 24 1.2.1 Tên gọi, tên khoa học tên đồng danh 24 1.2.2 Đặc điểm sinh học 24 1.2.3 Phân bố sinh thái 25 1.2.4 Thành phần hoá học 25 1.2.5 Tác dụng sinh học kim tiền thảo 32 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 35 2.1 2.2 2.3 Đối tượng nghiên cứu phương pháp nghiên cứu 35 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 35 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 35 2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 36 Hoá chất, dụng cụ, thiết bị 44 2.2.1 Hóa chất 44 2.2.2 Dụng cụ 45 2.2.3 Thiết bị 45 Thực nghiệm 46 2.3.1 2.4 Quy trình chiết 46 2.3.2 Quy trình sàng lọc hoạt tính BVTV cao chiết phân đoạn 47 2.3.3 Quy trình phân lập hợp chất 47 Các liệu phổ chất phân lập 50 2.4.1 KD6.1 (sotolone) 50 2.4.2 KD9.3 (funebral) 50 2.4.3 KD6.3 (5,7-dihydroxy-2’,3’,4’-trimethoxyisoflavanone) 50 2.4.4 KD6.5 (homoferreirin) 50 2.4.5 KD8.8 (genistein) 51 iii 2.4.6 2.5 KD8.4 (soyasapogenol B) 51 Thử nghiệm hoạt tính sinh học hợp chất phân lập 52 2.5.1 Thử nghiệm in vitro 52 2.5.2 Thử nghiệm in vivo .52 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .53 3.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ cao chiết dichloromethane kim tiền thảo D styracifolium 53 3.1.1 Luận giải cấu trúc hợp chất KD6.1 (sotolone) 53 3.1.2 Luận giải cấu trúc hợp chất KD9.3 (funebral) .55 3.1.3 Luận giải cấu trúc hợp chất KD6.3 (5,7-dihydroxy-2’,3’,4’trimethoxyisoflavanone) 58 3.2 3.1.4 Luận giải cấu trúc hợp chất KD6.5 (homoferreirin) 60 3.1.5 Luận giải cấu trúc hợp chất KD8.8 (genistein) 63 3.1.6 Luận giải cấu trúc hợp chất KD8.4 (soyasapogenol B) 65 Kết thử hoạt tính kháng nấm gây bệnh trồng 69 3.2.1 Hoạt tính kháng nấm cao chiết .69 3.2.2 Hoạt tính kháng nấm hợp chất phân lập 72 CHƯƠNG KẾT LUẬN .76 4.1 Kết luận 76 4.2 Hướng phát triển luận văn tương lai 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC I iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Diễn giải (Chú thích) Hex DCM n-Hexane EtOAc BuOH Ethyl acetate n-Buthanol MeOH Methanol DMSO Dimethyl sulfoxide CC Column Chromatography (Sắc ký cột) Dichloromethane MS Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13) Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương tác gián tiếp H↔C) Heteronuclear Single Quantum Coherence (Phổ tương tác trực tiếp H↔C) Mass spectrometry (Phổ khối lượng) TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) TLTK Tài liệu tham khảo KH Kí hiệu BVTV Bảo vệ thực vật PDA Potato dextrose agar (môi trường thạch khoai tây) DAT Days after treatment MO Magnaporthe oryzae Phy-s Phytophthora species Phy-c Phytophthora capsici Phy-p Phytophthora palmivora SR Sclerotium rolfsii FOAH Fusarium oxysporum COK Collectotrichum orbiculare RCB Rice blast (bệnh đạo ôn lúa) RSB Rice sheath blight (bệnh khô vằn lúa) H-NMR 13 C-NMR HMBC HSQC v vi Ký hiệu Diễn giải (Chú thích) TGM Tomato gray mold (bệnh mốc xám cà chua) TLB Tomato late blight (bệnh mốc xương mai cà chua) WLR Wheat leaf rust (bệnh rỉ sắt lúa mì) BPM Barley powdery mildew (bệnh phấn trắng lúa mì) PAN Pepper anthracnose (bệnh thán thư ớt) AS Dung dịch thuốc thử Anisaldehyde-Sulfuric acid (AS) CAM Dung dịch thuốc thử Ceric Ammonium Molybdate DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cây kim tiền thảo D styracifolium 24 Hình 2.1 Mẫu thực vật kim tiền thảo D styracifolium thu hái tỉnh Bắc Giang 35 Hình 2.2 Sơ đồ tách chiết phân lập hoạt chất từ kim tiền thảo D styracifolium 35 Hình 2.3 Một số bệnh trồng gây nấm bệnh sử dụng để đánh giá khả bảo vệ trồng phương pháp thử in vivo 44 Hình 2.4 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao chiết dichloromethane kim tiền thảo 50 Hình 3.1 Phổ ESI-HRMS hợp chất KD6.1 54 Hình 3.2 Phổ ESI-HRMS hợp chất KD9.3 55 Hình 3.3 Phổ MS hợp chất KD6.3 58 Hình 3.4 Phổ ESI-HRMS hợp chất KD6.5 61 Hình 3.5 Phổ ESI-HRMS hợp chất KD8.4 65 Hình 3.6 Sự phát triển mycelial nấm Phytophthora spp ức chế cao chiết kim tiền thảo D styracifolium 1000 µg/mL 69 Hình 3.7 Sự phát triển mycelial chủng nấm Phytophthora ức chế KD8.8 sau ngày nuôi cấy 74 Hình 3.8 Hiệu kiểm sốt in vivo hợp chất KD8.8 bệnh đạo ôn (RCB) (A) hình ảnh lúa thử nghiệm với hợp chất KD8.8 (B) 75 vii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Danh sách loài thực vật thuộc chi Desmodium Việt Nam Bảng 1.2 Các hợp chất flavonoids phân lập nhận dạng từ chi Desmodium Bảng 1.3 Các hợp chất alkaloids phân lập nhận dạng từ chi Desmodium 14 Bảng 1.4 Các hợp chất steroids phân lập nhận dạng từ chi Desmodium15 Bảng 1.5 Các hợp chất terpenoids phân lập nhận dạng từ chi Desmodium 17 Bảng 1.6 Một số hợp chất khác phân lập nhận dạng từ chi Desmodium 18 Bảng 1.7 Tác dụng loài thuộc chi Desmodium sử dụng Y học dân gian 20 Bảng 1.8 Các hợp chất phân lập từ kim tiền thảo D styracifolium 26 Bảng 1.9 Một số thuốc từ kim tiền thảo theo king nghiệm dân gian 32 Bảng 2.1 Kết chiết cao chiết phân đoạn từ cao tổng MeOH kim tiền thảo 47 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ hợp chất KD6.1 54 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ hợp chất KD9.3 57 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ hợp chất KD6.3 59 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ hợp chất KD6.5 62 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ hợp chất KD8.8 64 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ hợp chất KD8.4 66 Bảng 3.7 Hiệu lực ức chế cao chiết kim tiền thảo 1000 µg/mL điều kiện in vitro 71 Bảng 3.8 Hoạt tính kháng nấm hợp chất phân lập thử nghiệm in vitro 73 Bảng 3.9 Hiệu kiểm soát bệnh hợp chất KD8.8 điều kiện thử nghiệm in vivo 74 viii MỞ ĐẦU Cây trồng bị công nhiều tác nhân vi sinh vật xuất môi trường Bệnh gây vi khuẩn nấm bệnh dẫn đến mùa giảm sản lượng lương thực tồn giới Để kiểm sốt dịch bệnh trồng, nông dân thường sử dụng loại thuốc trừ sâu truyền thống có nguồn gốc tổng hợp hóa học Tuy nhiên sử dụng không cách liều lượng liên tục dẫn tới vấn đề tồn dư độc chất thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) thực phẩm, gây nhờn thuốc côn trùng nấm bệnh gây hại môi trường Các nhà nghiên cứu gần tập trung vào sử dụng nguồn vi sinh vật thực vật giải pháp BVTV thân thiện môi trường Các cao chiết thực vật đánh giá có nhiều lợi thuốc BVTV tổng hợp hóa học chúng dễ phân hủy, không gây ô nhiễm môi trường, tồn dư lượng khơng gây độc trồng Tuy nhiên cịn chưa có nhiều sản phẩm thảo mộc thương mại hóa sử dụng BVTV Ở Việt Nam gần có 49 hoạt chất từ thảo mộc đăng ký sử dụng [1] Các sản phẩm nguồn gốc thảo mộc cho có ảnh hưởng sâu rộng hiệu nghiên cứu nơng dược Thảo mộc có khả sản sinh nhiều hợp chất thứ cấp có giá trị sinh học terpenoids, alkaloids, polyacetylenes, flavonoids, steroids, acid béo với saponins Các nguyên liệu từ thảo mộc sử dụng trực tiếp (cao chiết, bột nghiền) hoạt chất đầu (để tổng hợp dẫn xuất) nghiên cứu phát triển loại nơng dược [1, 6-13] Việt Nam có khoảng 20000 loài thực vật, nguồn tài nguyên thiên nhiên vơ q giá sản sinh nguồn hoạt chất tự nhiên để nghiên cứu phát triển thành thuốc thảo mộc Trong vô số lồi thực vật Việt Nam, có nhiều lồi thuộc họ cánh bướm (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, dùng để bào chế thuốc chữa nhiều bệnh kim tiền thảo, có tên khoa học Desmodium styracifolium, hay gọi với tên khác như: vảy rồng, mắt trâu, đồng tiên lông Đây loại dược liệu mọc nhiều Đông Nam Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Việt Nam, Nhật Bản… Ở Việt Nam, kim tiền thảo phân bố rộng rãi vùng đồi núi, thường gặp chỗ sáng, đất cát pha, vùng trung du Hà Tây, Lạng Sơn, Ninh Bình, Hải Phịng… Từ kinh nghiệm dân gian kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học kim tiền thảo giới, cho thấy loại có nhiều tác dụng như: chữa bệnh sỏi niệu đạo, sỏi bàng quang, sỏi túi mật, chữa nhiễm khuẩn đường niệu, viêm thận phù thũng, viêm gan vàng da… Những liệu khoa học đưa minh chứng bước đầu cho thấy kim tiền thảo D styracifolium lồi thực vật có giá trị cần khai thác sử dụng cho lĩnh vực dược học Tuy nhiên nay, có cơng bố hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh trồng thành phần hợp chất có hoạt tính kim tiền thảo D styracifolium Những cơng bố có chưa thực nghiên cứu hoàn chỉnh, nghiên cứu sơ hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh người thử nghiệm sơ ban đầu dựa kinh nghiệm dân gian Các khả ứng dụng vào ức chế vi sinh vật côn trùng gây hại nơng nghiệp cịn chưa đề cập tới cách Trên sở đó, đề tài luận văn “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học kim tiền thảo Desmodium styracifolium (Osb.)” định hướng tiến hành phân lập hoạt chất từ kim tiền thào D styracifolium phương pháp tách chiết định hướng hoạt tính sinh học sử dụng chủng nấm gây bệnh đối tượng thử nghiệm hoạt tính Đây nNghiên cứu hồn chỉnh, cómang tính hệ thống để hợp chất hoá học kim tiền thảo D styracifolium thu hái tỉnh Bắc Giang có hoạt tính mạnh vi sinh vật gây bệnh trồng phân tích qua sàng lọc in vitro in vivo Các chất có hoạt tính sử dụng nguyên liệu mang hoạt tính để tạo thành thuốc BVTV thảo mộc sau nghiên cứu Nội dung luận văn bao gồm: • Phân lập định hướng hoạt tính sinh học hợp chất từ phần mặt đất loài kim tiền thảo D styracifolium; • Xác định cấu trúc hố học hợp chất phân lập; • Đánh giá hoạt tính kháng nấm gây bệnh trồng hợp chất phân lập Phụ lục 5.4c Phổ HMBC giãn hợp chất KD8.8 XXXIV Phụ lục 6: Các phổ hợp chất KD8.4 (soyasapogenol B) Phụ lục 6.1a Phổ 1H-NMR hợp chất KD8.4 XXXV Phụ lục 6.1b Phổ 1H-NMR giãn hợp chất KD8.4 XXXVI Phụ lục 6.1c Phổ 1H-NMR giãn hợp chất KD8.4 XXXVII Phụ lục 6.2a Phổ 13C-NMR hợp chất KD8.4 XXXVIII Phụ lục 6.2b Phổ 13C-NMR giãn hợp chất KD8.4 XXXIX Phụ lục 6.2c Phổ 13C-NMR giãn hợp chất KD8.4 XL Phụ lục 6.3a Phổ HSQC hợp chất KD8.4 XLI Phụ lục 6.3b Phổ HSQC giãn hợp chất KD8.4 XLII Phụ lục 6.3c Phổ HSQC giãn hợp chất KD8.4 XLIII Phụ lục 6.4a Phổ HMBC hợp chất KD8.4 XLIV Phụ lục 6.4b Phổ HMBC giãn hợp chất KD8.4 XLV Phụ lục 6.4c Phổ HMBC giãn hợp chất KD8.4 XLVI Phụ lục 6.4d Phổ HMBC giãn hợp chất KD8.4 XLVII Phụ lục 6.4 Phổ HMBC giãn hợp chất KD8.4 XLVIII ... trúc – hoạt tính hoạt chất Điều định hướng cho đề tài nghiên cứu thành phần hố học hoạt tính sinh học kim tiền thảo D styracifolium 23 1.2 Đặc điểm sinh học hoạt tính kim tiền thảo Desmodium styracifolium. .. thành phần hố học hoạt tính sinh học kim tiền thảo cịn Nghiên cứu thành phần hoạt chất tác dụng sinh học lồi góp phần làm sáng tỏ thêm thành phần hoá học ứng dụng sinh học, định hướng cho nghiên cứu. .. dụng vào ức chế vi sinh vật côn trùng gây hại nơng nghiệp cịn chưa đề cập tới cách Trên sở đó, đề tài luận văn ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học kim tiền thảo Desmodium styracifolium