Đường truyền lây và mô đích tấn công của vi khuẩn Flavobacterium columnare trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định đường truyền lây của vi khuẩn Flavobacterium columnare trên cá tra giai đoạn cá hương. Phương pháp ngâm cho tỷ lệ chết cao nhất (86,6 - 100%) ở nồng độ cảm nhiễm từ 2,5 x 103 - 104 CFU/mL.

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ĐƯỜNG TRUYỀN LÂY VÀ MƠ ĐÍCH TẤN CƠNG CỦA VI KHUẨN Flavobacterium columnare TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Nguyễn Ngọc Du1*, Nguyễn Thị Tuyết Mai2, Mã Tú Lan1, Lê Thị Bích Thuỷ3, Đồn Văn Cường1 TĨM TẮT Nghiên cứu thực nhằm xác định đường truyền lây vi khuẩn Flavobacterium columnare cá tra giai đoạn cá hương Phương pháp ngâm cho tỷ lệ chết cao (86,6 - 100%) nồng độ cảm nhiễm từ 2,5 x 103 - 104 CFU/mL Phương pháp tiêm cho tỷ lệ chết từ 56,6 - 100% nồng độ cảm nhiễm 2,5 x 105 - 106 CFU/cá Ở phương pháp cho tiếp xúc cá bệnh - cá khỏe với tỷ lệ 10%, 20%, 30% tổng số nhóm cá thí nghiệm, tỷ lệ cá chết từ 11 - 45% Không ghi nhận cá chết cảm nhiễm phương pháp cho ăn Phân tích mô bệnh học thể vi khuẩn bám nhiều lớp nhớt tiết bên ngồi da vùng phần bị hoại tử Phân tích mẫu mơ thu từ cá bệnh kỹ thuật PCR cho thấy mơ đích tác động vi khuẩn F columnare cá tra xác định đuôi mang Ngồi có diện vi khuẩn mô thận với tỷ lệ cường độ nhiễm thấp hơn, nhiên không phát vi khuẩn mô gan Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn gây bệnh mơ có tương đồng phương pháp ngâm với cá bệnh tự nhiên có khác biệt phương pháp tiêm cá bệnh tự nhiên (p < 0,05) Kết cho thấy chế cơng vi khuẩn từ bên ngồi vào, gây tổn thương quan bên ngồi (đi mang), phần dễ bị tổn thương nhất, sau xâm nhiễm vào quan nội quan Từ khóa: Flavobacterium columnare, cá tra, đường truyền lây, mơ đích I ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nghề ni cá da trơn Mỹ, Flavobacterium columnare vi khuẩn phổ biến thứ hai, sau Edwardsiella ictaluri (Hawke & Thune, 1992), gây tổn thất hàng năm lên đến 30 triệu USD (Shoemaker ctv., 2011) Trong suốt hai thập kỷ gần đây, bệnh columnaris mối đe dọa lớn cho nghề nuôi cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar), cá hồi nâu (Salmo trutta), cá hồi Thái Bình Dương (Oncorhynchus mykiss) vùng Fennoscandia, Phần Lan Vi khuẩn coi tác nhân gây bệnh quan trọng nghề nuôi cá rô phi Brazil F columnare gây bệnh nhiều loài cá cảnh nhiệt đới cá molly (Poecilia sphenops), cá platie (Xiphophorus maculatus) (Decostere ctv., 1998), cá da trơn Brazil cá rô phi sông Nile (Barony ctv., 2015) Bệnh columnaris cho nguyên nhân gây tổn thất nhiều trang trại nuôi cá da trơn bang Mississippi, Mỹ vào năm 2000 Khoảng thời gian từ năm 2004 - 2007, tỷ lệ thiệt hại bệnh columnaris chiếm 18,33% (Cunningham ctv., 2012) Bệnh Flexibacterium columnaris lần đầu công bố vào năm 1922 xem Viện Nghiện cứu Nuôi trồng Thủy sản II Trường Đại học Quốc tế Tp Hồ Chí Minh Trường Trung cấp Kỹ thuật Nơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh * Email: ngocduaqua@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 61 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II mối đe dọa nghiêm trọng cá tự nhiên cá nuôi Năm 1944, Ordal Rucker lần phân lập vi khuẩn từ ổ dịch cá hồi đỏ (Onchorhynchus nerka) tự nhiên Đến năm 1996, vi khuẩn đổi tên thành Flavobacterium columnare sử dụng Vi khuẩn F columnare tìm thấy chủ yếu loại cá nước Đối với trường hợp cấp tính, bệnh Flavobacterium có khả gây chết lên đến 70%, đến 100% (Suomalainen ctv., 2005) Những cá sống sót tăng trưởng kém, vây bị ăn mòn hoại tử, khung xương bị biến dạng sau thời gian dài nhiễm bệnh (Austin & Austin, 1999) Các chủng vi khuẩn có độc lực khác có liên quan với khả bám dính vào mang cá yếu tố mơi trường có ảnh hưởng đến khả bám dính (Decostere, 2002) Đây bước quan trọng trình phát sinh bệnh (Decostere ctv., 1999) Cá nheo Mỹ tháng tuổi gây nhiễm thực nghiệm với chủng F columnare 94-081 Matt gây chết từ 87% đến 100%, cá tháng tuổi tỷ lệ chết lên đến 60% vòng ngày Đối với chủng 14394 C56-1 mang độc lực thấp, có khả gây chết cá với tỷ lệ thấp (dưới 40%) Cá bị tuột nhớt, có dấu hiệu lở tróc da không Dấu hiệu tuột nhớt cao, tỷ lệ cá chết tăng (Soto ctv., 2008) Ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), liều gây chết 50% (LD50) cá giống từ khoảng x 105 - 1,6 x 106 CFU/mL (Tien ctv., 2012) phương pháp ngâm Thí nghiệm gây chết 100% nồng độ x 105 - x 107 CFU/mL cá rô phi (Dong ctv., 2016) Trên cá nhiệt đới nuôi Brazil, F columnare phân lập cá có vùng da bị màu, tạo đốm màu trắng xám số phần thể đầu, miệng, mang, vây thân, bao quanh vùng đỏ nhẹ da bị tróc, bị ăn mịn, da bị lở loét (Pilarski 62 ctv., 2008) Ở Canada, bệnh F columnare ghi nhận cá hồi trắng (Coregonus clupeaformis) với biểu bệnh tích như: vùng nhạt màu thể từ từ bị tróc da lở loét, sợi mang bị hoại tử Mẫu soi tươi vùng hoại tử da mang có nhiều vi khuẩn hình sợi chuyển động trượt (Scott & Bollinger, 2014) F columnare diện nhiều da vây cá koi bệnh cảm nhiễm thực nghiệm, không thường xuyên thấy mang, phân lập quan khác gan, thận, lách (Tripathi ctv., 2005) Tuy nhiên, tự nhiên, biểu hoại tử mang dấu hiệu thường thấy dịch bệnh columnaris xảy ra, làm cho cá chết trước xuất dấu hiệu lở loét da (Decostere ctv., 2002) Vi khuẩn F columnare chủ yếu quan sát lớp biểu bì, vùng bong tróc lở lt cá nheo (Ictalurus punctatus) cá ngựa vằn (Danio rerio) (Bullard ctv., 2011) Ngồi ra, vi khuẩn cịn thấy nhiều mang phần gốc lồi cá nước cá chép (Cyprinus carpio), cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) (Declercq ctv., 2015), cá mang xanh (Lepomis macrochirus) (Bullard ctv., 2013) Phân tích diện F columnare kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) mơ cá có biểu mang nhợt nhạt, mịn, da màu, tuột nhớt, cá thăng bằng… số lồi cá nước ni vùng Mymensingh (Bangladesh), West Bengal (Ấn Độ), Lembuchera, Tripura (Ấn Độ) cho thấy F columnare chủ yếu tìm mang cơ, số trường hợp có thận lách (Patra ctv., 2016) F columnare lây truyền thông qua môi trường nước bùn đất ao nuôi Bệnh columnaris xảy khắp nơi vi khuẩn xâm nhiễm vào tất loài cá nước số loài lưỡng cư Cá hồi giống, cá da trơn giống nuôi trại sản xuất thường dễ bị bệnh columnaris ni với mật độ cao, TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II yếu tố môi trường điều kiện quan trọng gây phát sinh dịch bệnh Khi kết hợp với yếu tố gây sốc nhiệt độ tăng, mật độ tăng, xây xát vận chuyển…, F columnare cơng gây bệnh cho cá Các nghiên cứu cho thấy F columnare lây truyền trực tiếp từ cá sang cá thơng qua mơi trường nước q trình phát bệnh có liên quan đến điều kiện gây sốc chất lượng nước kém, di chuyển cá q trình thả giống hay thu hoạch F columnare tạo thành dạng kén (microcyst) tồn nhiều năm nguồn lây nhiễm tự nhiên Vi khuẩn có khả sống sót hàng tháng nước hồ vơ trùng sống mơ cá chết Hơn nữa, F columnare di chuyển hiệu từ cá chết sang cá sống, chí cịn nhanh từ cá sống sang cá sống Khả làm gia tăng phát sinh bệnh tiềm ẩn thay đổi môi trường sống cá Thời gian ủ bệnh F columnare thay đổi tùy theo độc lực chủng điều kiện mơi trường Chủng có độc lực cao gây dịch bệnh cấp tính vịng 24 giờ, chủng có độc lực thấp cần nhiều thời gian hơn, từ 48 vài tuần (Warren, 1981) Nghiên cứu thực cá tra tháng tuổi giai đoạn mẫn cảm cá tra tác nhân gây bệnh trắng đuôi, thối đuôi Việc xác định đường truyền lây vi khuẩn vào thể vật chủ nhằm hạn chế khả lây truyền mầm bệnh, đồng thời liệu phân tích mơ đích bị xâm nhiễm tác nhân gây bệnh giúp tăng cường khả chẩn đoán phát mầm bệnh vật chủ II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Cá thí nghiệm Cá tra khoảng 40 ngày tuổi, trọng lượng trung bình 0,8 - 1g, sử dụng cho thí nghiệm cảm nhiễm Sử dụng cá biểu bên khỏe mạnh, ni tuần trước thí nghiệm bể composite Cá kiểm tra không nhiễm mầm bệnh F columnare cách phết lam từ nhớt da bên để kiểm tra vi khuẩn cấy nhớt cá môi trường TYES (Trypton Yeast Extract Salts) Đồng thời, mầm bệnh quan trọng khác (Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri) tác nhân gây bệnh phổ biến cá tra kiểm tra cách cấy mẫu thận môi trường thạch máu 2.1.2 Chuẩn bị vi khuẩn cảm nhiễm Chủng vi khuẩn F columnare AG.07.19_8 phân lập từ mẫu cá bệnh trắng đuôi, thối đuôi thu An Giang lưu giữ chủng nhiệt độ -80ºC Vi khuẩn cấy đĩa môi trường TYES ủ 30ºC 48 Khuẩn lạc đơn cấy chuyển sang nuôi môi trường TYES lỏng 30ºC vòng 24 để huyền dịch vi khuẩn gốc đạt khoảng 108CFU/mL Vi khuẩn pha loãng thành nồng độ 2,5 x 106, x 106, 107 CFU/mL sẵn sàng cho cảm nhiễm 2.2 Cảm nhiễm xác định đường truyền lây Thực thăm dò đường truyền lây: ngâm nước, tiêm, cho ăn, tiếp xúc cá bệnh- khỏe Mỗi đường truyền lây thực nồng độ lặp lại lần Thí nghiệm bố trí bể nhựa, bể chứa 20 Ở nghiệm thức ngâm, cá ngâm bể lít nước có chứa vi khuẩn nồng độ 2,5 x 103, x 103, 104 CFU/mL vòng (1 mL vi khuẩn nồng độ 2,5 x 106, x 106, 107 CFU/mL pha lỗng lít nước), sau nâng mức nước lên lít cho bể Ở nghiệm thức tiêm, cá tiêm vào nồng độ 2,5 x 105, x 105, 106 CFU/cá Vi khuẩn sử dụng trộn vào thức ăn nghiệm thức cho ăn, mL dung dịch vi khuẩn 2,5 x 106, x 106, 107 CFU/mL trộn với thức ăn chia thành phần tương đương cho bể nghiệm thức (mục đích để cá TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 63 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II bể cho ăn với mL vi khuẩn trộn thức ăn, tương đương với lượng vi khuẩn đưa vào bể nghiệm thức ngâm) Ở nghiệm thức cho cá bệnh tiếp xúc cá khỏe, chọn cá lờ đờ, có biểu bệnh trắng đi, thối cho vào bể cá khỏe với tỷ lệ 10%, 20%, 30% tổng số cá thí nghiệm bể Những cá bệnh (đã chết) vớt khỏi bể sau 24 cho tiếp xúc tiếp tục theo dõi Trong thời gian cảm nhiễm không cho ăn lô ngâm tiêm Theo dõi ghi nhận cá có biểu bệnh trắng đi, thối đi, cá chết vòng tuần Một số cá lờ đờ vừa chết lấy mẫu để kiểm tra vi khuẩn F columnare Nồng độ tỷ lệ gây nhiễm thể Bảng Bảng 1: Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm Đường truyền lây Nồng độ cảm nhiễm Ngâm (CFU/mL) Tiêm (CFU/cá) 104 x 103 2,5 x 103 2.3 Phân tích mơ bệnh học cá bệnh trắng đuôi thối đuôi Cá bệnh (tự nhiên sau cảm nhiễm) có biểu trắng đuôi thối đuôi thu nguyên cố định dung dịch formol 10% Mẫu mô (đuôi, mang, thận) đúc parafin để cắt lát, sau xử lý loại parafin cồn tiến hành nhuộm Wright – Giemsa, Hematoxylin Eosin (H&E) nhuộm Gram Quan sát diện vi khuẩn mô kính hiển vi quang học 2.4 Phương pháp kiểm tra mơ đích cá bệnh tự nhiên sau cảm nhiễm Cá bệnh (tự nhiên sau cảm nhiễm) thu nguyên cố định cồn 90% để kiểm tra phương pháp PCR Mẫu mô (đuôi, mang, gan, thận) tách panh kéo đốt khử trùng sau lần tách mô DNA tinh Wizard genomic DNApurification kit (Promega, USA) theo hướng dẫn nhà sản xuất Đoạn gene đặc hiệu loài khuyếch đại máy PCR (Biorad, USA) hỗn hợp GoTag (Promega, USA) sử dụng hai mồi ColF 5’CAGTGGTGAAATCTGGT3’ ColR 5’GCTCCTACTTGCGTAGT3’ để 64 106 x 105 2,5 x 105 Tiếp xúc cá Cho ăn (CFU/ bệnh: khỏe bể thí nghiệm) 3:7 (30%) 107 2:8 (20%) x 106 1:9 (10%) 2,5 x 106 định danh F columnare Một hỗn hợp 25 μL dung dịch cho phản ứng PCR chứa 1X green Gotag reaction buffer, bao gồm 1,5 mM MgCl2, 10 nmole cho 200 μM dNTPs, 10 pmole cho mồi, Taq DNA polymerase 100 ng DNA mẫu Chu trình PCR gồm có giai đoạn khởi đầu: 94ºC phút (1 chu kỳ); nhân PCR (30 chu kỳ) gồm có bước biến tính: 94ºC 30 giây – bước gắn mồi: 54 ºC phút – bước kéo dài: 72ºC phút; giai đoạn kết thúc kéo dài 72ºC phút (1 chu kỳ) Dung dịch sau PCR điện di gel agarose 1,5%, cho sản phẩm có kích thước 675 bp (Darwish ctv., 2004) Phân tích thống kê Kết phân tích thống kê sử dụng phần mềm SPSS 13.0 for Windows, phân tích ANOVA yếu tố khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95% (giá trị p