Phân lập và đánh giá độ nhạy với kháng sinh của vi khuẩn Flavobacterium columnare gây bệnh trên cá trắm cỏ nuôi tại miền Bắc

Bài viết Phân lập và đánh giá độ nhạy với kháng sinh của vi khuẩn Flavobacterium columnare gây bệnh trên cá trắm cỏ nuôi tại miền Bắc được nghiên cứu nhằm xác định các dấu hiệu bệnh đặc trưng, phân lập, định danh và đánh giá hiện trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Flavobacterium columnare gây bệnh trên cá trắm cỏ ở một số tỉnh miền Bắc.

Vietnam J Agri Sci 2022, Vol 20, No 6: 732-740 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(6): 732-740 www.vnua.edu.vn PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ NHẠY VỚI KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Flavobacterium columnare GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRẮM CỎ NI TẠI MIỀN BẮC Trương Đình Hồi*, Đồn Thị Nhinh, Trần Thị Trinh, Đặng Thị Hóa, Nguyễn Ngọc Tuấn, Kim Văn Vạn Khoa Thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: tdhoai@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 23.02.2022 Ngày chấp nhận đăng: 05.04.2022 TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm xác định dấu hiệu bệnh đặc trưng, phân lập, định danh đánh giá trạng kháng kháng sinh vi khuẩn Flavobacterium columnare gây bệnh cá trắm cỏ số tỉnh miền Bắc Tổng số 103 mẫu cá trắm cỏ nghi nhiễm F columnare thu từ 25 hộ nuôi thuộc 03 tỉnh (Hà Nội, Hải Dương Bắc Ninh) để phục vụ nghiên cứu Kết cho thấy cá trắm cỏ nhiễm bệnh có biểu đặc trưng tia mang xơ, bạc trắng, xơ vây, xuất đốm bạc màu da Tổng số 67 chủng vi khuẩn thuần, dạng rễ nuôi cấy thành công 25 chủng đại diện từ trại ni định danh phản ứng sinh hóa kết hợp với giám định PCR Kết cảm nhiễm 03 chủng đại diện phương pháp ngâm nồng độ × 10 CFU/ml 2h gây chết 100% cá trắm cỏ cỡ 25-30g 48-72h Kết kháng sinh đồ cho thấy tỉ lệ cao F columnare nhạy với loại kháng sinh doxycycline, amoxicillin, florfenicol oxytetracycline (92-100%); nhiên tỉ lệ kháng với sulfamethoxazole /trimethoprim erythromycin cao, 44 16% Kết nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng phục vụ chẩn đốn, phịng điều trị bệnh F columnare gây cá trắm cỏ Từ khóa: Flavobacterium columnare, cá trắm cỏ, kháng kháng sinh Isolation and Antibiotic Susceptibility of Flavobacterium columnare Infecting Grass Carp Cultured in Northern Vietnam ABSTRACT This study was conducted to identify the pathogen F columnare from diseased grass carp cultured in northern Vietnam and to examine the susceptibility of this bacterium to various common antibiotics used in aquaculture A total of 103 grass carp samples suspected to be infected with F columnare were collected and screened from 25 grass carp farms in Ha Noi, Hai Duong and Bac Ninh provinces The grass carps infected with F columnare exhibited the symptoms of decayed, white-grey gill filaments, rotten fins, and skin discoloration From 67 yellow and rhizoid isolates recovered from the collected samples, 25 representative isolates (one per farm) were identified by the phenotypic tests and PCR assays Grass carps (20-25g) challenged with F columnare at the dose of x 106 CFU/ml by immersion in 2h resulted in 100% mortality within 48-72 hpi The antibiotic test showed that high proportion of F columnare isolates were susceptible to doxycycline, amoxicillin, florfenicol, and oxytetracycline (92-96%), but resistant to sulfamethoxazole/trimethoprim (44%) and trythromycin (16%) The present study provided necessary information for diagnosing and controlling F columnare in grass carp Keywords: Flavobacterium columnare, grass carp, antibiotic resistance ĐẶT VẤN ĐỀ Cá trím có mût nhąng lồi cá nāĉc ngõt có tỉm quan trõng mðt thāćng mäi, góp 732 không 10,5% sân lāČng cá tồn cỉu (FAO, 2020; Shi & cs., 2021) Sân lāČng cá trím có tồn giĉi đät khoõng 5,5 triu tỗn vo nởm 2018, chợ sau cỏ rơ phi trĊ thành lồi cá Trương Đình Hồi, Đồn Thị Nhinh, Trần Thị Trinh, Đặng Thị Hóa, Nguyễn Ngọc Tuấn, Kim Văn Vạn đāČc nuôi nhiều thă hai giĉi (Shen & cs., 2019) Täi Việt Nam, cá trím đāČc ni phù biến Ċ nhiều đða phāćng lồi cá cị thể đāČc ni Ċ vüng nāĉc tïnh nāĉc chây, ni l÷ng, ni ao, ni cá - lúa, ni hệ VAC Cá trím có d nuửi, khửng ủi húi thc ởn cũ chỗt lng dinh dāċng cao, tøc đû sinh trāĊng nhanh, thðt cá thćm ngon nên đāČc ngāĈi tiêu düng āa chuûng Tuy nhiên sĆ phát triển nhanh kèm theo mêt đû ni cao, nhiễm mơi trāĈng biến đùi khí hêu làm cho dðch bệnh cá trím có ngày phăc täp, đðc biệt bệnh vi khuèn (Gallani & cs., 2020) Bệnh Flavobacterium columnare đāČc báo cáo gây bệnh cho 36 lồi cá ni khíp giĉi, bao g÷m nhiều lồi cá ni có giá trð kinh tế cao nhā cá nheo mỹ, cá h÷i vân, cá tra cá rơ phi, đðc biệt lồi vi khuèn gây ânh hāĊng nghiêm trõng cá nāĉc ngõt ni vĉi tỵ lệ chết không 80-100% đøi vĉi cá hāćng, cá giøng 35-60% Ċ cá trāĊng thành (TĂ Thanh Dung & cs., 2012) Trong sø nhóm vi khn gây bệnh cá nāĉc ngõt F columnare đāČc coi mût nhąng loài vi khuèn gây thiệt häi lĉn cho cá nāĉc ngõt nói chung cá trím có nói riêng Täi Việt Nam, mðc dü cò mût sø nghiên cău phân lờp, nh danh vi khuốn F columnare nhng chỵ yu cá tra (Pagasianodon hyphophthalmus) Ċ Đ÷ng Bìng Sơng CĄu Long (TĂ Thanh Dung & cs., 2012), thông tin dðch bệnh vi khuèn F columnare cá trím có chāa đāČc nghiên cău chuyên sâu Nghiên cău đāČc thĆc để xác đðnh sĆ có mðt gõy bnh cỵa vi khuốn F columnare gõy bnh trờn cá trím có thưng qua phāćng pháp phân lêp v giỏm nh cỏc chỵng vi khuốn t cỏ bnh thu Ċ khu vĆc phía Bíc nëm 2021 Đ÷ng thi ỏnh giỏ hin trọng khỏng khỏng sinh cỵa vi khuốn gõy bnh cung cỗp thụng tin cho vic xây dĆng giâi pháp điều trð bệnh F columnare cá trím có PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Nghiên cău đāČc thĆc méu trím có nghi nhiễm F columnare đāČc thu tĂ đČt bùng phát bệnh täi mût sø tỵnh khu vĆc phớa Bớc Cỏc trang thit b, dng c, húa chỗt phc v cho quỏ trỡnh thu mộu, nuụi cỗy, phõn lêp đðnh danh vi khuèn, câm nhiễm khâng đðnh tác nhân gây bệnh đánh giá măc kháng kháng sinh cỵa vi khuốn sau nh danh 2.2 Phng phỏp nghiên cứu 2.2.1 Thu mẫu sàng lọc mẫu nghi nhiễm Tùng sø 103 méu cá trím có nghi nhiễm F columnare (tríng da, bäc mang) cịn søng hc mĉi chết đāČc thu tĂ đČt bùng phát bệnh Ċ 25 hû ni thủc tỵnh Hà Nûi (n = 34), Hâi Dāćng (n = 38) Bíc Ninh (n = 31) da trờn cỏc dỗu hiu bnh nh x, bọc mang, mũn võy v xuỗt hin cỏc ứm bọc màu bên cć thể (Declercq & cs., 2013a; Lu & cs., 2021) Méu sau thu đāČc vên chuyển phân tích täi Phịng thí nghiệm bìng phāćng pháp vên chuyển kín bìng týi PE cị bćm oxy hoðc vên chuyển länh thùng gią nhiệt Méu cá sau thu đāČc sàng lõc sć bû sĆ có mt cỵa vi khuốn Gram õm, dọng si mõnh cỏc v trớ tựn thng theo mử tõ cỵa Declercq & cs (2013a) trc nuụi cỗy, phõn lờp Cỏc dỗu hiu lõm sng v c im bnh tớch cỵa cá sau sàng lõc đāČc ghi chép để tùng hČp v nhờn din cỏc dỗu hiu c trng cỵa bnh 2.2.2 Nuụi cy v phõn lp vi khun Tỗt cõ méu sau sàng lõc sć bû đāČc sĄ dĀng để nuụi cỗy vi khuốn Mộu bnh cỏc v trớ tựn thng c ria cỗy trờn mửi trng Cytophagar (CA) Khuốn lọc vi khuốn sau nuụi cỗy cú mu vng, dọng r nh mử tõ cỵa Dong & cs (2016) v Kunttu & cs (2011) c tỏch nuụi cỗy thuổn Cỏc chỵng vi khuốn sau nuụi cỗy thuổn c lāu gią mưi trāĈng có bù sung glycerol (20%) Ċ điều kiện -80°C 2.2.3 Định danh giám định tác nhân Xác đðnh đðc điểm hình thái, sinh hóa: La chừn ngộu nhiờn 25 chỵng vi khuốn ọi din (01 chỵng/hỷ thu mộu) a vo xỏc nh mỷt sø đðc điểm hình thái, sinh hịa thưng thāĈng theo mụ tõ cỵa Bernardet & Grimont (1989) v Buller (2004) Vi khuèn thuæn đāČc quan sát 733 Phân lập đánh giá độ nhạy với kháng sinh vi khuẩn Flavobacterium columnare gây bệnh cá trắm cỏ nuôi Bc hỡnh thỏi khuốn lọc trờn ùa nuửi cỗy, hình däng vi khn qua nhủm Gram; soi tāći xác đðnh đðc tính di đûng Các phân ăng catalase, oxidase, hỗp th thuức th red congo c tin hnh theo hng dộn cỵa kớt th; th sớc tứ flexirubin bỡng dung dch KOH 20% Cỏc chỵng vi khuốn c nh danh sć bû F columnare có kết quâ kim tra tng ững vi chỵng chuốn F columnare ATCC23463 Phāćng pháp tách chiết DNA giám đðnh vi khuèn bỡng sinh hừc phõn t: Tỗt cõ 25 chỵng vi khuèn sau đðnh danh sć bû bìng hình thái, sinh hịa đāČc tách chiết DNA Q trình tách chiết sĄ dng bỷ kớt Instagen (Bio-rad, M) theo hng dộn cỵa nh sõn xuỗt DNA sau tỏch c bõo quõn iu kin -20C Cỏc chỵng vi khuốn c giỏm nh lồi F columnare sĄ dĀng primer xác đðnh sĆ có mt cỵa gen ớch ISR vi oọn mữi xuụi FCISRFL: TGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAGAGACA; m÷i ngāČc FCISRR: TAATYRCTAAAGATGTT CTTTCTACTTGTTTG, kích cċ sân phèm khoâng 450-550bp (Welker & cs., 2005) Hún dðch cho phân ăng PCR tích tùng 25µl chăa đćn vð Gotag green Master Mix (Promega, UK), 0.8µM múi primer xi ngāČc, 200ng méu DNA, 4µl nāĉc tách DNA Hún dðch đāČc đāa vào máy luån nhiệt để khuếch đäi DNA theo chu kč nhiệt nhā sau: tiền biến tính Ċ 94°C phút; 40 chu kč lðp läi vĉi biến tính Ċ 94°C 30s, gín m÷i Ċ 55°C 45s, kéo dài Ċ 72°C 60s; giai đoän kéo dài sau Ċ 72°C phỳt ứi chng dng l chỵng chuốn F columnare ATCC 23463, đøi âm hún hČp phân ăng khơng chăa DNA thay bìng PBS Sân phèm PCR đāČc phån tích máy điện di sĄ dĀng bân gel chăa 1,5% agarose nhủm bìng dung dðch RedSafe (Intron, Hàn Qùc) Hình ânh điện di bân gel đāČc chĀp bìng hệ thøng Gel imager (Bio-Rad, Mỹ) 2.2.4 Câm nhiễm, khẳng định tác nhân gây bệnh LĆa chõn đäi diện 03 chỵng sau nh danh t tợnh ó thu méu (FC-TC-HN04; FC-TCHD02; FC-TC-BN05) để tiến hành câm nhiễm 734 cá trím có theo phāćng pháp ngåm theo mơ tâ bĊi Dong & cs (2016) Cá thí nghiệm (n = 120 con, kích cċ tĂ 25-30g) đāČc ni thn mût tn trāĉc thí nghiệm Tiến hành ni tëng sinh cỏc chỵng vi khuốn bỡng mụi trng Tryptone Yeast Extract Salts (TYES) 36h SĄ dĀng phāćng pháp chang cỗy trờn ùa thọch xỏc nh mờt ỷ vi khuèn dðch gøc Bù sung möi trāĈng nuöi TYES iu chợnh mờt ỷ vi khuốn gức cỵa chỵng v mc ững u khoõng ì 108 CFU/ml ứi vi mỳi chỵng vi khuốn, pha loóng 50ml dch khuốn gức vo nc sọch ỵ lớt ngõm câm nhiễm, vĉi mût măc mêt đû vi khuèn gây nhiễm × 106 CFU/ml SĄ dĀng 15 cá/lơ ngâm, lðp läi læn thĈi gian ngâm câm nhiễm 2h Cá sau câm nhiễm đāČc chuyển nuôi bể 120l theo dõi ngày Lö đøi thao tác tāćng tĆ vĉi dðch ngâm khơng chăa vi khn Cá chết hc có biểu bệnh sau câm nhiễm đāČc thu để quan sát triệu chăng, bệnh tích, nhủm gram, soi tāći quan sát sĆ xuỗt hin cỵa vi khuốn mụ bo Mỷt sứ mộu cỏ c nuụi cỗy, phõn lờp lọi vi khuốn đāČc giám đðnh nhanh bìng PCR để khỵng đðnh tác nhân gây bệnh 2.2.5 Đánh giá mức độ nhạy/kháng ca vi khun vi khỏng sinh Mc ỷ khỏng/nhọy cỵa vi khuèn F columnare đøi vĉi kháng sinh đāČc đánh giá sĄ dĀng phāćng pháp đïa kháng sinh khuếch tán cho nhóm vi khuèn di đûng trāČt, đāČc hāĉng dén tài liệu Clinical Laboratory Standards Institute VET04 (2020) ThĄ nghim c thc hin trờn 25 chỵng vi khuốn F columnare sau đðnh danh đøi vĉi loäi kháng sinh đāČc phép sĄ dĀng NTTS bao g÷m: amoxicillin (AX, 10 µg); erythromycin (ER, 15 µg); sulfamethoxazole/trimethoprim (SMX/TMP - 23,75/1,25µg); doxycycline (DX - 30µg), oxytetracycline (OTC - 30µg); florfenicol (FL - 30àg) Cỏc chỵng vi khuốn c nuụi cỗy thuổn mưi trāĈng lóng Mueller Hinton Broth (MHB) pha lỗng (4 g/l) sau 36h 28C Dch nuụi cỗy c điều chỵnh măc 0,5 theo Trương Đình Hồi, Đồn Thị Nhinh, Trần Thị Trinh, Đặng Thị Hóa, Nguyễn Ngọc Tuấn, Kim Văn Vạn thang chuèn McFarland để đät mêt đû vi khn không × 108 CFU/ml đāČc tiếp tĀc pha lỗng theo tỵ lệ 1:100 bìng mưi trāĈng MHB (pha lỗng) Chang 50µl dðch khn sau pha loãng lên đïa thäch Mueller-Hinton pha loãng (4 g/l MHB + 17 g/l agar) Tin hnh t cỏc tỗm khỏng sinh lờn ùa thọch sau chang cỗy v ỵ Ċ 28°C Kích thāĉc vịng vơ khn đāČc đo sau 48h, tớnh nhọy/khỏng cỵa khỏng sinh ứi vi vi khuốn đāČc phân chia thành măc nhäy, nhäy vĂa kháng theo CLSI (20016) CLSI VET4 (2020) 2.2.6 Xử lý số liệu Sø liệu tỵ lệ cá chết tích lÿy q trình câm nhiễm, măc đû kháng/nhäy cỵa vi khuốn vi tng loọi khỏng sinh c tựng hČp phân tích bìng phỉn mềm Excel 2013 Ghi chú: Cá trắm cỏ có dấu hiệu xơ, bạc mang nặng (A); xơ, mòn vây (B); bạc màu, tuột vây xuất vi khuẩn Gram âm, dạng sợi mânh vùng tổn thương nhuộm tươi mẫu da (D) mang (E) Hình Triệu chứng lâm sàng cá trắm cỏ nhiễm F columnare Ghi chú: A, B: Hình thái vi khuẩn F columnare phát trên cytophagar sau 48h ni cấy; C: Hình dạng vi khuẩn sau ni cấy Hình Hình thái khuẩn lạc hình dạng vi khuẩn nghi F columnare phân lập từ cá trắm cỏ nhiễm bệnh 735 Phân lập đánh giá độ nhạy với kháng sinh vi khuẩn Flavobacterium columnare gây bệnh cá trắm cỏ nuôi miền Bắc KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quâ thu, sàng lọc mẫu cá nhiễm bệnh Trong nghiên cău này, tùng sø 103 méu cá trím có nghi nhiễm F columnare đāČc thu sàng lõc tĂ 25 hû ni Ċ tỵnh Hà Nûi, Bíc Ninh v Hõi Dng Cỏ nghi nhim bnh cú cỏc dỗu hiu lồm sng c trng nh xuỗt hin ứm bọc mu, mỗt võy trờn c th, x, bọc võy, tia mang xć tríng Cá nhiễm bệnh khơng thể bệnh tích bên nûi quan Các vùng tùn thng trờn da, mang cỏ nhim bnh cú s xuỗt hin cỵa vi khuốn gram õm (-) dọng si mõnh, tờp trung thnh cm ln hoc xuỗt hin rõi rỏc mơ bào (Hình 1) F columnare đāČc ghi nhên bệnh thāĈng gðp, gây thiệt häi lĉn vĉi nghề ni cá trím có Ċ nhiều nāĉc giĉi, nhiên täi täi Việt Nam chāa cò nghiên cău, báo cáo thăc tác nhân gây bnh ny trờn cỏ trớm cú Dỗu hiu bnh ghi nhên đāČc cá trím có nhiễm F columnare nghiờn cu hon ton tng ững vi mụ tõ cỵa Lu & cs (2021) Dỗu hiu tia mang x, bọc mu xuỗt hin cỏc vựng trớng bọc v mỗt mu trờn c th l cỏc dỗu hiu bnh c trng nhỗt cỵa cỏ nhim F columnare (Declercq & cs., 2013a) Các vùng tùn thāćng mang làm giâm khâ nëng hụ hỗp cỵa cỏ, gõy suy giõm chc nởng sinh l cỵa c th v cú th gõy cht vùng tùn thāćng lan rûng Ngoài ra, mang da đòng vai trò quan trõng đøi vĉi khâ nëng dch cỵa cỏ Khi cỏc c quan ny b tựn thng, khõ nởng dch cỵa cỏ suy giõm (Koppang & cs., 2015), dén đến cá dễ nhiễm loäi tác nhân gây bệnh khác hoðc chøng chðu vĉi điều kiện möi trāĈng nuöi Các báo cáo trāĉc ũ cng ghi nhờn vi khuốn F columnare ớt tỗn công nhiễm vào cć quan nûi täng (Declercq & cs., 2013a) vỡ vờy khụng xuỗt hin dỗu hiu bệnh đðc trāng Ċ cć quan 3.2 Kết quâ phân lập định danh tác nhân gây bệnh Quỏ trỡnh nuụi cỗy phõn lờp ó thu c 67 chỵng vi khuốn thuổn mu vng, dọng r c trng, phỏt trin sau 36-48h nuụi cỗy trờn mụi trng Cytophagar Kết quâ đánh giá đðc điểm hình thái, đðc tớnh sinh húa cỵa 25 chỵng vi khuốn ọi din (1 chỵng/hỷ) cho thỗy 25/25 chỵng u cũ cỏc c im v hỡnh thỏi, sinh húa ững nhỗt v tng ững vi kt quõ thu c trờn chỵng chuốn F columare ATCC 23463 (Bâng 1) Mût sø đðc điểm đðc trng cỵa cỏc chỵng vi khuốn ghi nhờn c nh: khöng phát triển möi trāĈng giàu dinh dāċng TSA; mưi trāĈng Cytophagar, khn läc vi khn có däng rễ đðc trāng, màu vàng, l÷i, bám sâu bề mðt thäch, đät kích thāĉc không 0,5-3mm sau 36-48h ni cỗy Vi khuốn Gram õm, dọng si mõnh, kớch c khoõng 0,5-1,0 ì 4-10àm (Hỡnh 2), tỗt cõ cỏc chỵng có khâ nëng di đûng trāČt, phân ăng dāćng tính vĉi thùc thĄ catalase, oxidase, flexirubin Red congo Bâng Kết quâ thử số đặc tính hình thái, sinh hố chủng vi khuẩn nghi F columnare phân lập từ cá trắm cỏ nhiễm bệnh Chủng phân lập từ cá trắm cỏ nhiễm bệnh (n = 25) Chủng chuẩn F columnare ATCC 23463 Gram - - Phát triển TSA - - Đặc tính sinh thái, sinh hóa Hình thái khuẩn lạc Cytophagar Rễ Rễ Sợi mảnh Sợi mảnh Di động trượt + + Oxidase + + Catalase + + Flexirubin + + Red congo + + Hình thái vi khuẩn Ghi chú: (+): Phân ứng dương tính; (-): Phân ứng âm tính 736 Trương Đình Hồi, Đồn Thị Nhinh, Trần Thị Trinh, Đặng Thị Hóa, Nguyễn Ngọc Tuấn, Kim Văn Vạn Ghi chú: M: Marker Giếng 1-6 tương ứng chủng đại diện phân lập cá trắm cỏ nhiễm bệnh thu từ Hà Nội, Bắc Ninh Hâi Dương (2 chủng/tỉnh); N: Đối chứng âm; P: Đối chứng dương (chủng F columnare ATCC23463) Hình Kết quâ giám định đại diện cho chủng F columnare từ cá trắm cỏ PCR Theo Kunttu & cs (2011) Dong & cs (2015), vi khn F columnare có nhiều däng hình thái khuèn läc khác nhā däng rễ cây, màu vàng; däng rìa l÷i lõm nhẹ däng rìa trịn nhïn, vĉi khn läc däng rễ chỵ thð cho khõ nởng di ỷng trt cỵa vi khuốn (Chang & cs., 1984) Tính di đûng trāČt cÿng quan sát đāČc tỗt cõ cỏc chỵng vi khuốn dọng r thu c nghiờn cu ny Quan trừng hn, cỏc chỵng có hình thái khn läc khác có măc ỷ ỷc lc khỏc nhau, ũ chợ cú chỵng däng rễ có măc đû đûc lĆc cao vĉi loi thỵy sõn (Dong & cs., 2015; Kunttu & cs., 2011) Nh vờy, cỏc chỵng vi khuốn dọng r phõn lêp đāČc tĂ cá trím có chỵng ỷc lc, cú khõ nởng gồy bnh trờn cỏ Quỏ trỡnh giỏm nh bỡng PCR ứi vi 25 chỵng đäi diện sau thĄ sinh hóa cho kết quâ 25/25 chỵng dng tớnh vi oọn mữi c hiu cho loi F columnare, kích cċ độn m÷i không 550bp, trùng vĉi v trớ xuỗt hin vọch cỵa chỵng ứi chng dng F columnare ATCC23463 (Hình 3) Kết hČp kết quâ đánh giá hình thái, sinh hịa giám đðnh bìng PCR khợng nh 25 chỵng vi khuốn thuổn la chừn đäi diện F columnare 3.3 Kết quâ câm nhiễm khẳng định tác nhân gây bệnh Để khỵng đðnh cỏc chỵng F columnare phõn lờp c l tỏc nhõn gõy bnh theo quy tớc Kochs, 03 chỵng ọi din cho tỵnh thu méu đāČc sĄ dĀng để câm nhiễm cá trím có Kết q ngâm câm nhim ì 106 CFU/ml 2h cho thỗy 100% cá câm nhiễm Ċ lơ thí nghiệm chết sau 72h nhiễm bệnh Trong đị, khưng có cá chết Ċ lö đøi (Bâng 2) Cá chết quỏ trỡnh cõm nhim xuỗt hin cỏc triu chng tng đ÷ng vĉi cá nhiễm bệnh ngồi tĆ nhiên nhā bći lĈ đĈ, ngáp bề mðt thiếu khí Kiểm tra lõm sng cho thỗy mc dỹ c im bọc da chāa thể rơ nhā cá míc bệnh tĆ nhiên, điều n÷ng đû gây nhiễm cao v cỏ cht cỗp tớnh, nhiờn nhng cỏ chết tĂ 48-72h có biểu tríng mang vi khuốn tỗn cụng lm tớc tuổn hon mang, tia mang có nhąng vùng hội tĄ bäc màu (Hình 4A) Méu nhủm gram, soi tāći vð trí tùn thng u cú s hin din dy c cỵa vi khuèn gây bệnh däng sČi mânh, gram âm (Hình 4B) Khuốn lọc sau nuụi cỗy cú hỡnh thỏi tng ững vi chỵng vi khuốn a vo cõm nhim Ba chỵng phân lêp läi tĂ cá câm nhiễm đāČc giám đðnh läi bìng PCR cho kết q dāćng tính vĉi gen xác đðnh loài F columnare Nhā vêy, kết quâ câm nhiễm mût lỉn nąa khỵng đðnh vi khn F columnare tác nhân gây bệnh cá trím có nhiễm bệnh thu tĂ tĆ nhiên Ngoài ra, theo Kuo & cs (1981) vi khuèn sinh sân nhanh phát tán xung quanh möi trāĈng nāĉc, chúng tit chỗt ỷc v lm hoọi t gức mang, lm cỏ thiu khớ gõy cht nhanh Cỏc chỵng ỷc lc cao cú th gõy cht cỗp tớnh cho cỏ 24h TĂ kết quâ câm nhiễm nghiên cău cho thỗy cỏc chỵng F columnare phõn lờp c vùng ni cá trím có Ċ Việt Nam nhng chỵng cũ ỷc lc cao 737 Phõn lp v đánh giá độ nhạy với kháng sinh vi khuẩn Flavobacterium columnare gây bệnh cá trắm cỏ nuôi miền Bắc Bâng Kết quâ theo dõi tỉ lệ cá chết sau câm nhiễm Tỉ lệ chết tích lũy (%) Chủng vi khuẩn 24h 48h 72h FC-TC-HD02 36,7 ± 4,7 73,3 ± 18,8 100 ± FC-TC-HN03 40,0 ± 9,4 76,7 ± 14,1 100 ± FC-TC-BN05 43,3 ± 14,1 73,3 ± 9,4 100 ± 0 0 Đối chứng Ghi chú: A: Cá câm nhiễm có dấu đốm bạc màu da, mòn vây dễ bong vẩy; B: Bạc hoại tử mang; C: Vi khuẩn tập trung thành đám lớn vùng tổn thương Hình Cá trắm cỏ nhiễm bệnh trình câm nhiễm Bâng Kết quâ thử kháng sinh đồ 25 chủng F columnare phân lập từ cá trắm cỏ Tên kháng sinh Doxycycline Kí hiệu Nhạy Nhạy trung bình Kháng n (%) DX 23 (92,0) (8,0) (0,0) SMX/TMP 14 (56,0) (0,0) 11 (44,0) Amoxicillin AX 23 (92,0) (4,0) (4,0) Erythromycin ER 18 (72,0) (12,0) (16,0) Florfenicol FL 23 (92,0) (0,0) (8,0) OTC 24 (96,0) (4,0) (0,0) Sulfamethoxazole /Trimethoprim Oxytetracycline 3.4 Mức độ kháng kháng sinh vi khuẩn F columnare gây bệnh cá trắm cỏ Kháng sinh thāĈng đāČc sĄ dĀng để điều trð cỏc bnh nhim khuốn nuụi trững thỵy sõn Vic sĄ dĀng kháng sinh khöng đýng cách, 738 läm dĀng kháng sinh dễ dén đến tāČng kháng thuøc, giâm hiệu quâ điều trð bệnh Trong nghiên cău, măc kháng/nhäy cỵa 25 chỵng vi khuốn F columnare phõn lờp t cá trím có nhiễm bệnh đāČc đánh giá đøi vĉi loäi kháng sinh đāČc phép sĄ dĀng NTTS Kết Trương Đình Hồi, Đồn Thị Nhinh, Trần Thị Trinh, Đặng Thị Hóa, Nguyễn Ngọc Tuấn, Kim Văn Vạn quõ th nghim cho thỗy cỏc chỵng vi khuốn F columnare phân lêp đāČc có măc nhäy cao vĉi lội kháng sinh thĄ nghiệm, tỵ lệ nhäy t 56-96% (Bõng 3) Khụng cú chỵng vi khuốn F columnare no khỏng vi doxycycline, oxytetracycline; tợ l chỵng nhọy vĉi hai loäi kháng sinh tāćng ăng Ċ măc 92% v 96% Trờn 90% sứ chỵng th hin mc nhäy cao vĉi florfenicol amoxicillin, tỵ lệ chỵng khỏng vi erythromycin v sulfamethoxazole/ trimethoprim cao hn cỏc kháng sinh khác, tāćng ăng Ċ măc 16,0% 44,0% Mc nhọy cao cỵa vi khuốn F columnare vi hổu hết loäi kháng sinh sĄ dĀng NTTS ghi nhên đāČc nghiên cău tāćng đ÷ng vĉi kết quâ đāČc Tohmee & Deemagarn (2013) Declercq & cs (2013b) báo cáo F columnare phân lêp đāČc tĂ cá rơ phi nhiều lồi cá nāĉc ngõt khác Trong sø loäi kháng sinh sĄ dĀng nghiên cău, hún hČp kháng sinh sulfamethoxazole /trimethoprim (SMX/TMP) có mc khỏng cao nhỗt (44% sứ chỵng), mc khỏng cỵa loọi khỏng sinh cũn lọi mc t 0-16% Tợ l nhọy cỵa F columnare phõn lờp tĂ cá trím có đøi vĉi SMX/TMP nghiên cău (56%) cao hn so vi mc nhọy cỵa F columnare phõn lờp t cỏ tra (30%) cụng bứ cỵa tác giâ TĂ Thanh Dung & cs (2012) Tuy nhiên so vĉi loäi kháng sinh khác sĄ dĀng nghiờn cu, mc khỏng cỵa SMX/TMP cao cú th dộn đến giâm hiệu quâ sĄ dĀng kháng sinh trình điều trð KẾT LUẬN F columnare tác nhân gây bệnh xć, bäc mang, xć våy v bọc mu da trờn cỏ trớm cú Cỏc chỵng vi khuèn phân lêp đāČc có khuèn läc däng r, di ỷng trt, l cỏc chỵng cú ỷc lc cao trờn ỷng vờt thỵy sõn v c chng minh bìng câm nhiễm thĆc nghiệm Vi khuèn F columnare gây bệnh cá trím có có tỵ lệ nhäy cao vĉi loäi kháng sinh oxytetracycline, amoxicillin, florfenicol, doxycycline, tợ l chỵng khỏng vi erythromycin, sulfamethoxazole/ trimethoprim măc cao LỜI CẢM ƠN Nhóm tác giâ xin chân thnh cõm n s hỳ tr cỵa cỏc hỷ nuụi cá trím có täi tỵnh phøi hČp thĆc hiện, täo điều kiện thu méu để hoàn thành nghiên cău Nghiên cău đāČc thĆc dāĉi sĆ tài tr cỵa d ỏn Vit- Bợ vi mó sứ tài T2021-14-23VB TÀI LIỆU THAM KHẢO Bernardet J.F & Grimont P.A (1989) Deoxyribonucleic acid relatedness and phenotypic characterization of Flexibacter columnaris sp nov., nom rev., Flexibacter psychrophilus sp nov., nom rev., and Flexibacter maritimus Wakabayashi, Hikida, and Masumura 1986 International journal of systematic and evolutionary microbiology 39(3): 346-354 Buller N.B (2004) Bacteria from fish and other aquatic animals: a practical identification manual Cabi Chang L., Pate J.L & Betzig R (1984) Isolation and characterization of nonspreading mutants of the gliding bacterium Cytophaga johnsonae Journal of bacteriology 159: 26-35 CLSI (2016) Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria 3rd ed CLSI guideline M45 Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI (2020) Performance Standards for Antimicrobial Testing of Bacteria Isolated from Aquatic Animals 3rd ed CLSI supplement VET04 Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute Declercq A.M., Haesebrouck F., Van den Broeck W., Bossier P & Decostere A (2013a) Columnaris disease in fish: a review with emphasis on bacterium-host interactions Veterinary research 44: 1-17 Declercq A., Boyen F., Van Den Broeck W., Bossier P., Karsi A., Haesebrouck F & Decostere A (2013b) Antimicrobial susceptibility pattern of Flavobacterium columnare isolates collected worldwide from 17 fish species Journal of fish diseases 36: 45-55 Dong H., LaFrentz B., Pirarat N & Rodkhum C (2015) Phenotypic characterization and genetic diversity of Flavobacterium columnare isolated from red tilapia, Oreochromis sp., in Thailand Journal of fish diseases 38: 901-913 Dong H., Senapin S., LaFrentz B & Rodkhum C (2016) Virulence assay of rhizoid and non‐rhizoid 739 Phân lập đánh giá độ nhạy với kháng sinh vi khuẩn Flavobacterium columnare gây bệnh cá trắm cỏ nuôi miền Bắc morphotypes of Flavobacterium columnare in red tilapia, Oreochromis sp., fry Journal of fish diseases 39: 649-655 FAO (2020) The State of World Fisheries and Aquaculture: Sustainability in action Rome,Itali p 2020 https://doi.org/10.4060/ca9229en Koppang E.O., Kvellestad A & Fischer U (2015) Fish mucosal immunity: gill Mucosal health in aquaculture Elsevier pp 93-133 Kunttu H., Jokinen E., Valtonen E & Sundberg L.R (2011) Virulent and nonvirulent Flavobacterium columnare colony morphologies: characterization of chondroitin AC lyase activity and adhesion to polystyrene Journal of Applied Microbiology 111: 1319-1326 Kuo S.C., Chung H.Y & Kou G.H (1981) Studies on artificial infection of the gliding bacteria in cultured fishes Fish Pathology 15: 309-314 Lu Z., Gao R., Duan Y., Han R., Guo W., Dan X & Li Y (2021) Isolation and genetic characterization of Flavobacterium columnare from grass carp, Ctenopharyngodon idellus, in China Aquaculture 541: 736762 740 Shen Y., Wang L., Fu J., Xu X., Yue G.H & Li J (2019) Population structure, demographic history and local adaptation of the grass carp BMC genomics 20(1): 1-16 Shi F., Lu Z., Yang M., Li F., Zhan F., Zhao L., Li Y., Li Q., Li J & Li J (2021) Astragalus polysaccharides mediate the immune response and intestinal microbiota in grass carp (Ctenopharyngodon idellus) Aquaculture 534: 736205 Tohmee N & Deemagarn T (2013) Flavobacterium columnare isolated from brains of pond culture Nile tilapia in Thailand 38th ICVS Conference, Bankok, Thailand Từ Thanh Dung, Nguyễn Anh Tuấn & Nguyễn Thị Tiên (2012) Nghiên cứu tác nhân gây bệnh trắng đuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giải pháp điều trị Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 22c: 136-145 Welker T.L., Shoemaker C.A., Arias C.R & Klesius P.H (2005) Transmission and detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus Diseases of aquatic organisms 63:129-138  ... dạng vi khuẩn sau ni cấy Hình Hình thái khuẩn lạc hình dạng vi khuẩn nghi F columnare phân lập từ cá trắm cỏ nhiễm bệnh 735 Phân lập đánh giá độ nhạy với kháng sinh vi khuẩn Flavobacterium columnare. .. 737 Phân lập đánh giá độ nhạy với kháng sinh vi khuẩn Flavobacterium columnare gây bệnh cá trắm cỏ nuôi miền Bắc Bâng Kết quâ theo dõi tỉ lệ cá chết sau câm nhiễm Tỉ lệ chết tích lũy (%) Chủng vi. .. rhizoid and non‐rhizoid 739 Phân lập đánh giá độ nhạy với kháng sinh vi khuẩn Flavobacterium columnare gây bệnh cá trắm cỏ nuôi miền Bắc morphotypes of Flavobacterium columnare in red tilapia,