Nuôi cấy quang tự dưỡng cây hoa cúc cắt cành

Nuôi cấy quang tự dưỡng cây hoa cúc cắt cành bằng hệ thống túi nilon

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

  

TRẦN PHƯỚC LINH NUÔI CẤY QUANG TỰ DƯỠNG

CÂY HOA CÚC CẮT CÀNH (Chrysanthemum sp )

BẰNG HỆ THỐNG TÚI NYLON

Luận văn kỹ sư

Chuyên ngành công nghệ sinh học

Thành phố Hồ Chí Minh 2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

NUÔI CẤY QUANG TỰ DƯỠNG

CÂY HOA CÚC CẮT CÀNH (Chrysanthemum sp )

BẰNG HỆ THỐNG TÚI NYLON

Luận văn kỹ sư

Chuyên ngành công nghệ sinh học

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Thành phố Hồ Chí Minh 8/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY,HCHC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY

***000***

PHOTOAUTOTROPHIC CULTURE OF

CUT MUM (Chrysanthemum sp ) USING

NYLON – BAG SYSTEM

GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, nhu cầu về hoa trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng tăng nhanh hơn bao giờ hết Hoa tươi trở thành một loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí đặc biệt trong thị trường sản phẩm hàng hóa nông nghiệp thế giới.Trong đó, hoa Cúc là một trong những loại hoa được nhiều người ưa chuộng và phổ biến nhất

Trong xu thế hội nhập, cùng với chính sách mở cửa của nhà nước, nhiều nhà đầu tư nước ngoài như Công ty Hasfarm ở Đà Lạt không ngừng đưa vào Việt Nam những giống hoa Cúc đẹp và có giá trị kinh tế cao Chính vì vậy, hiện nay sản phẩm hoa Cúc rất đa dạng về chủng loại, phong phú về màu sắc Việc xuất hiện liên tục của những giống hoa Cúc ngoại nhập, bên cạnh các giống hoa nội địa, đã giúp mở rộng sản xuất và qua đó đáp ứng được nhu cầu thị hiếu của người tiêu dùng

Khi sản xuất được mở rộng, nhu cầu về giống cũng tăng theo, và phương pháp nhân giống cũng không ngừng cải tiến Cây hoa Cúc được nhân giống chủ yếu bằng phương pháp vô tính qua phương pháp giâm cành truyền thống Nhiều năm qua, thực tế cho thấy phương pháp này không đáp ứng kịp nhu cầu giống, mặt khác còn mang nguy cơ làm lây lan bệnh hại và làm thoái hóa giống.Vì vậy trong sản xuất số lượng lớn cây giống sạch bệnh với tốc độ nhanh, chất lượng đồng đều và đồng nhất về mặt di

truyền, phương pháp nhân giống vô tính in vitro cây hoa Cúc rất hiệu quả

Các nghiên cứu nuôi cấy mô truyền thống thường không quan tâm nhiều đến các yếu tố môi trường, và thường dựa quá nhiều vào những ứng dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh Bên cạnh đó, việc bổ sung đường, agar và vitamin vào môi trường nuôi cấy, cùng với việc sử dụng hệ thống nuôi cấy kín dẫn đến nhu cầu đòi hỏi sự vô trùng tuyệt đối Điều này làm tăng chi phí sản xuất; gây ra sự mất mát một số lượng lớn cây con do nhiễm nấm khuẩn trong quá trình nuôi cấy; cảm ứng sự biến dị về hình thái, sinh lý cây nuôi cấy; đặc biệt là hiện tượng thủy tinh thể (vitrification)

thường xuất hiện Chính vì vậy mà tỷ lệ sống của cây in vitro trong giai đoạn thuần

hóa sau ống nghiệm thấp

Nhiều nghiên cứu ở những loài thực vật khác nhau đã cho thấy phương pháp có thể giúp khắc phục những nhược điểm trên, nâng cao rõ rệt chất lượng cây giống là

phương pháp: Vi nhân giống bằng công nghệ quang tự dƣỡng Theo phương pháp

này khả năng tự quang hợp của cây được tạo điều kiện phát triển, sử dụng môi trường nhân giống chỉ bao gồm các loại muối khoáng, mà không có sự bổ sung đường hay các loại vitamin

Song song với những nghiên cứu về quang tự dưỡng, hệ thống nuôi cấy cũng không ngừng được cải tiến

Trong đó hệ thống nghiên cứu trong túi nylon rẻ tiền tỏ ra có nhiều triển vọng trong hạ giá thành sản phẩm cây con

Với những lý do đã nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “nuôi cấy quang tự

dƣỡng cây hoa Cúc cắt cành (chrysanthemum sp ) bằng hệ thống túi Nylon”

1.2 Mục đích – yêu cầu 1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng thích hợp, sử dụng các bịch

nylon dân dụng, nhằm nâng cao chất lượng và hạ giá thành cây giống Cúc in vitro

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây hoa Cúc

2.1.1 Nguồn gốc cây hoa Cúc

Hoa Cúc có tên khoa học là Chrysanthemum sp (hiện nay chi Chrysanthemum còn có tên là Dendrathema) Hoa Cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản Các

nhà khảo cổ học Trung Quốc đã chứng minh rằng từ đời Khổng Tử người ta đã làm lễ thắng lợi hoa vàng (hoa Cúc) và cây hoa Cúc cũng đã đi vào các tác phẩm hội họa từ thời gian này Ở Nhật Bản, Cúc là một loài hoa quí (Quốc hoa) thường được dùng trong các buổi lễ quan trọng

2.1.2 Tình hình sản xuất và thương mại cây hoa Cúc trên thế giới và Việt Nam

Tuy cây Cúc có nguồn gốc từ lâu đời nhưng đến năm 1688 Jacob Layn người Hà Lan mới trồng phát triển mang tính thương mại ở đất nước này Đến đầu thế kỷ 18, cây hoa Cúc là cây hoa quan trọng nhất đối với Trung Quốc, Nhật Bản Ở Hà Lan, Cúc là cây quan trọng thứ hai sau hoa hồng Hàng năm kim ngạch giao lưu buôn bán hoa cúc trên thị trường thế giới ước đạt tới 1,5 tỷ USD (Đặng Văn Đông, 2003)

Bảng 2.1 Những nước xuất khẩu và nhập khẩu hoa Cúc hàng năm

Tên nước Xuất khẩu (triệu USD) Nhập khẩu (triệu USD)

Ở Việt Nam, hoa Cúc được du nhập vào từ thế kỷ 15 Đến đầu thế kỷ 19 đã hình thành các vùng chuyên canh cung cấp cho người tiêu dùng, một phần để chơi thưởng thức, một phần phục vụ việc cúng lễ và một phần dùng làm dược liệu Hiện nay hoa Cúc có mặt ở khắp mọi nơi từ vùng núi cao đến đồng bằng, từ nông thôn đến thành thị Các vùng trồng nhiều mang tính tập trung là Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh, Đà Lạt, và Hải Phòng

Riêng ở Đà Lạt là nơi lý tưởng cho việc trồng hoa Cúc quanh năm Ngoài ra điều kiện khí hậu rất thích hợp cho việc sinh trưởng, phát triển của hầu hết các giống Cúc được nhập từ nước ngoài vào Hiện nay ở Đà Lạt có trên 70 giống Cúc được trồng với mục đích cắt cành Giống hoa Cúc hiện nay chủ yếu xuất phát từ Hà Lan và được du nhập vào Đà Lạt với nhiều hình thức khác nhau Trong đó các công ty nước ngoài như Harfarm, Bonifarm góp một phần không nhỏ trong việc tạo sự đa dạng cho thị trường giống Cúc Việt Nam

Theo số liệu thống kê về tình hình sản xuất hoa tại thành phố Đà Lạt, cho thấy diện tích và sản lượng hoa Cúc là lớn nhất so với những loại hoa khác

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất hoa tại thành phố Đà Lạt

Chủng loại Diện tích (ha) Sản lƣợng (triệu cành)

(Nguồn: thông tin kinh tế-xã hội tỉnh Lâm Đồng, 2005) 2.1.3 Vị trí phân loại

- Ngành : Angiospermatophyta - Lớp : Dicotyledoneae - Bộ : Asterales - Họ : Asteraceae

- Chi :Chrysanthemum (Dendrathema)

- Loài: Có nhiều loài, nhưng phổ biến như hoa cắt cành có thể kể là: morifolium

2.1.4 Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây hoa Cúc 2.1.4.1 Đặc điểm thực vật học

 Rễ

Rễ của Cúc là loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều ngang, phân bố ở tầng đất mặt từ 5 – 20cm Số lượng rễ rất lớn nên khả năng hút nước và các chất dinh dưỡng rất mạnh

 Hoa

Hoa Cúc chủ yếu ở hai dạng:

- Dạng lưỡng tính: trong hoa có cả nhị đực và nhụy cái

- Dạng đơn tính: chỉ có nhị đực hoặc nhụy cái, đôi khi có loại vô tính (không có cả nhụy, nhị)

Màu sắc hoa Cúc rất khác nhau, hầu như có tất cả các màu của tự nhiên: trắng, vàng, đỏ, tím, hồng, xanh Trong đó trên mỗi bông hoa có thể có một màu duy nhất, hoặc có vài màu riêng biệt hoặc có thể có rất nhiều màu pha trộn, tạo nên một thế giới màu sắc vô cùng phong phú và đa dạng

Tùy theo cách sắp xếp của cánh hoa mà người ta phân ra thành nhóm hoa kép (có nhiều vòng hoa sắp xếp trên bông) và nhóm hoa đơn (chỉ có một vòng hoa trên bông) Những cánh hoa nằm ở phía ngoài có màu sắc đậm hơn Cánh hoa có nhiều hình dáng khác nhau: có dạng cong hoặc thẳng, có loại cánh ngắn hoặc cánh dài, cuốn ra ngoài hay cuốn vào trong

Đường kính của bông hoa phụ thuộc vào giống Giống hoa to có đường kính 10 – 12cm, loại trung bình 5 – 7cm và loại nhỏ từ 1 – 2cm

2.1.4.2 Sinh thái cây hoa Cúc

 Nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự sinh trưởng, phát triển, nở hoa và chất lượng của hoa Cúc Đa số các giống Cúc được trồng hiện nay đều ưa khí hậu mát mẻ, nhiệt độ dao động từ 15 – 200C Bên cạnh đó có một số giống chịu nhiệt độ cao (30 – 350C) Trong thời kỳ ra hoa cần đảm bảo nhiệt độ thích hợp (cho từng loại giống Cúc) thì hoa sẽ to và đẹp

 Ánh sáng

Ánh sáng có hai tác dụng chính đối với Cúc:

+ Ánh sáng là một yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng phát triển của cây Nó cung cấp năng lượng cho quá trình quang hợp tạo ra chất hữu cơ cho cây

+ Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân hóa mầm hoa và nở hoa của Cúc Cúc được xếp vào loại cây ngày ngắn Thời gian chiếu sáng thời kỳ phân hóa mầm hoa tốt nhất là 10 giờ chiếu sáng/ngày Thời gian chiếu sáng kéo dài thì sự sinh trưởng của cây hoa Cúc dài hơn, thân cây cao, lá to, hoa ra muộn, chất lượng hoa tăng Thời gian chiếu sáng 11 giờ/ngày cho chất lượng hoa Cúc tốt nhất

 Ẩm độ

Cúc là cây trồng cạn, không chịu được úng Đồng thời là cây có sinh khối lớn, bộ lá to, tiêu hao nước nhiều nên cũng kém chịu hạn Độ ẩm đất từ 60 – 70%, độ ẩm không khí 55 – 65% thuận lợi cho cây Cúc sinh trưởng tốt

2.1.5 Phân loại

2.1.5.1 Nhóm giống cũ

(1) Cúc đại đóa vàng: Cây cao 60-80cm, thân yếu, mềm, lá to, không đứng thẳng được tự nhiên mà phải có cọc đỡ Hoa kép to đường kính 8-10cm, cánh dài hơi cong vào trong, cánh không sít vào nhau Khả năng chịu rét kém nhưng chịu hạn tốt Thời gian sinh trưởng rất dài 150-180 ngày, hiện nay ít trồng

(2) Cúc vàng hè Đà Lạt: Cây cao 40-50cm, thân nhỏ mảnh và cong hoa to trung bình 4-5cm, cánh ngắn, mềm, màu vàng tươi Nhiều lá to màu xanh vàng, chịu nóng tốt thời gian sinh trưởng 90-120 ngày Nhược điểm là cánh hoa mềm, tuổi thọ hoa ngắn nên giống này hiện nay ít trồng

(3) Cúc chi Đà Lạt: Cây cao 40-50cm, cây bụi, thân nhỏ cong, phiến lá to mỏng, màu xanh nhạt Hoa đơn nhỏ, đường kính 2,0-2,5cm cánh màu trắng ở viền ngoài và hơi vàng ở giữa Cây chịu lạnh, thời gian sinh trưởng 120-150 ngày

(4) Cúc chi trắng Đà Lạt: Cây nhỏ, dạng thân bò, phân cành nhiều, lá nhỏ màu xanh đậm Hoa nhỏ đường kính 1-1,5cm có màu trắng, mùi thơm nhẹ Trồng đẻ ướp chè, phơi khô làm thuốc nam

(5) Cúc chi vàng Đà Lạt: Cây giống như chi trắng, hoa màu vàng mùi thơm hắc Trước kia người ta trồng để tạo thành cây hình cầu, trồng vào chậu chơi tết, hoặc để trồng trong các bồn hoa công viên

(6) Cúc gấm: Dạng cây bụi cao khoảng 30-40cm, khả năng phân cành rất mạnh do đó cũng dùng để tạo tán hình cầu trông giống mâm xôi Hoa màu vàng nhạt đường kính 1,5-2,5cm Thời gian sinh trưởng dài 120-150 ngày, khả năng chịu rét kém

(7) Cúc họa mi: Cây cao 45-50cm khả năng phân cành mạnh Hoa đơn nhỏ, đường kính hoa 3-4cm, cánh dài, chiều rộng cánh nhỏ, màu trắng nhạt Thời gian sinh trưởng dài 5-6 tháng Khả năng chịu rét kém

(8) Cúc kim tử nhung: Cây cao 55-60cm, thân cứng lá to, dài, răng cưa sâu, có màu xanh đậm Hoa màu vàng nghệ pha đỏ nâu, đường kính hoa to 8-10cm Thời gian sinh trưởng dài, chịu rét tốt

(9) Cúc tím hoa cà: Cây cao 50-60cm, thân cứng Hoa to 8-10cm, cánh xếp chồng lên nhau cuốn cong vào phần giữa, hoa màu hoa cà, chịu rét tốt Thời gian sinh trưởng dài 110-130 ngày

(10) Cúc đỏ tiết dê: Cây cao 50-60cm, thân cứng Hoa to đường kính 8-12cm, màu đỏ tiết dê cánh hẹp dài uốn cong vào phía giữa hoa

2.1.5.2 Nhóm giống mới nhập nội

(11) Cúc vàng Đài Loan: Được chọn lọc từ tập đoàn Cúc nhập nội của Đài Loan năm 1994 Cây cao 70-80cm, lá xanh đậm, phiến lá dày, thân mập thẳng, cứng Hoa kép to có nhiều tầng xếp rất chặt, đường kính hoa 10-12cm, hoa màu vàng nghệ, rất bền (10-12 ngày ) Thời gian sinh trưởng 120-150 ngày, thích hợp với vụ mùa thu đông

(12) Cúc CN 93: Được nhập nội từ Nhật Bản về Việt Nam năm 1993, nhiều năm liền được thị trường ưa chuộng Cây cao trung bình 60-70cm, cứng, mập thẳng, lá xanh to Hoa kép, màu vàng, đường kính 10-12cm, cánh dày xếp sít chặt nhau, hoa bền, thời gian cắm lọ 10-15 ngày Thời gian sinh trưởng ngắn 90-110 ngày, chịu nhiệt tốt có thể trồng nhiều thời vụ trong năm, nhưng thích hợp nhất là vụ xuân hè và hè thu (tháng 4-tháng 11)

(13) Cúc CN 97: Được nhập nội từ Nhật Bản Cây cao từ 55-65cm, cây to mập, lá xanh dày Hoa kép màu trắng sữa, cánh dày đều xếp chặt vào nhau, đường kính hoa 10-12cm, Thời gian sinh trưởng 90-110 ngày, chịu rét

(14) Cúc CN 98: Được nhập nội từ Nhật Bản.Cây cao thẳng từ 60-70cm, lá xanh đậm Hoa to, đường kính trung bình 8-10cm, màu vàng chanh Thời gian sinh trưởng 80-90 ngày, chịu nóng, là một trong những giống chủ lực của mùa hè hiện nay

(15) Cúc CN 42: Được Viện Di Truyền Nông Nghiệp nhập từ Hà Lan về năm 2001 Giống có đặc điểm cây cứng, lá xanh bóng, chiều cao trung bình 70-80cm Hoa màu trắng trong Thời gian sinh trưởng 90-95 ngày, phù hợp với thời vụ đông

(16) Cúc CN 45: Được nhập cùng giống CN 42, cây cao trung bình 70-80cm Cánh hoa bên ngoài màu trắng, cánh bên trong hơi vàng, đường kính hoa 7-10cm Thời gian sinh trưởng 90-100 ngày, thích hợp với vụ đông

(17) Cúc CN 44: được nhập cùng giống CN 42, CN 45, cây cao 85-90cm, lá hình lông chim hẹp, hoa màu vàng đậm, đường kính 9-11cm thời gian sinh trưởng 90-95 ngày, thích hợp trồng trong vụ đông

Ngoài các giống chính trên còn có rất nhiều giống khác đang được trồng ở Hà Nội và các tỉnh phía Bắc Tên gọi của chúng được mô tả theo đặc điểm hoa, màu sắc,

nguồn gốc hoặc do các tác giả đặt tên Ví dụ như: cánh sen, vàng nhị nâu, đỏ cờ, da hồng, tím Huế, tím lồi to, tím lồi con, trắng xanh, lồi xanh, vàng Tầu, chi trắng Hà Lan, chi vàng Hà Lan, tím sen, tím xoáy, tím hè, ánh vàng, ánh bạc, đầu đỏ, đầu vàng, CN40, Cn41, HL1…Bộ giống phong phú này luôn đáp ứng thị hiếu của người chơi hoa và những người muốn sưu tập về hoa Cúc

Hình 2.1 một số loài hoa Cúc

2.1.6 Các phương pháp nhân giống cây hoa Cúc 2.1.6.1 Phương pháp nhân giống cổ điển a) Mầm giá

Mầm giá là những mầm non mọc lên từ rễ, phát sinh chung quanh gốc cây mẹ mầm giá phát sinh nhiều hay ít tùy giống, đất đai và điều kiện chăm sóc Mầm giá thường đảm bảo tính chất của cây mẹ, cho hoa to nhưng không đều

Mầm giá thường to khỏe nên khả năng sinh trưởng, phát triển mạnh, cho hoa tốt nhưng thời gian cho hoa lâu hơn so với giâm cành Trong thực tế sản xuất quy mô nhỏ, ta có thể tăng số lượng bằng cách tách mầm từ những cây Cúc có nhiều mầm chồi phát sinh quanh gốc

b) Giâm cành

Đây là biện pháp kỹ thuật đơn giản đang được sử dụng phổ biến Muốn có cành giâm tốt phải chuẩn bị vườn cây nguyên liệu (cây mẹ) Hệ số nhân Cúc theo phương pháp này đạt từ 15 – 20 lần tức là để trồng từ 15 – 20 ha cần phải có 1 ha vườn cây mẹ

2.1.6.2 Nhân giống Cúc bằng phương pháp nuôi cấy mô

Đây là phương pháp khoa học và hiện đại, phục vụ cho sản xuất với quy mô công nghiệp lớn Ưu điểm của phương pháp này là hệ số nhân giống rất cao, từ một bộ phận của cây hoa Cúc sau 1 năm có thể cho ra đời từ 40 – 60 tỷ cây (Đặng Văn Đông, 2003) Các cây này đều sạch bệnh, chất lượng tương đối đồng đều và đồng nhất về mặt di truyền

Nuôi cấy mô hoa Cúc đã được thực hiện từ cuối những năm 1960 với mục đích làm tăng nhanh tốc độ nhân giống hơn với cách giâm cành cổ điển, tạo được dòng sạch bệnh vi rút, gây giống đột biến và dự trữ giống

2.2 Phương pháp nhân giống vô tính in vitro

2.2.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần thiết

trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ sinh học Nhờ áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất Hơn nữa dựa vào kĩ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quí hiếm để phục tráng giống cây trồng

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật vô trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống

2.2.2 Lịch sử phát triển

Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann đề xướng học thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi sinh vật phức tạp đều gồm nhiều sinh vật nhỏ, các tế bào hợp thành, các tế bào phân chia mang thông tin di truyền chứa trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh và là những đơn vị độc lập từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể

Năm 1902, Haberlandt đề xướng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào, nghĩa là mỗi tế bào đều mang đầy đủ thông tin di truyền của cá thể Ông tiến hành trên cây họ hòa thảo (cây một lá mầm) một loại cây khó thực hiện và ông bị thất bại

Năm 1922, Kote (học trò Haberlandt) và Robbins (nhà khoa học người Mỹ) đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ Tuy nhiên sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm lại và ngừng hẳn, mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới

Năm 1934, White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopersicum

Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin Sau đó các chất cytokinine khác như BAP, 2 IP, Zeatin cũng được phát hiện

Năm 1957, SKoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về tỷ lệ giữa kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá

Từ năm 1954, đến năm1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh

Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược

Năm 1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá

2.2.3 Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô ở Việt Nam

Sau ngày đất nước hoàn toàn giải phóng, chính phủ ta đã đầu tư về tài chính và con người nhằm phát triển các ngành khoa học nói chung và ngành sinh học nói riêng, trong đó có nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật được xây dựng tại Viện Công Nghệ Sinh Học (Viện Khoa Học Việt Nam), Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp Hồ Chí Minh, Phân Viện Sinh Học tại Đà Lạt, Viện Khoa Học Nông Ngiệp, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Đại Học Nông Nghiệp I, Viện Lâm Nghiệp, Ở một số tỉnh, thành phố cũng bắt đầu xây dựng phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nhiệm vụ của các phòng thí nghiệm này là xây dựng và phát triển các phương pháp nghiên cứu, đồng thời tổ chức những hướng nghiên cứu ứng dụng phù hợp với điều kiện trang thiết bị ở Việt Nam và đã thu được những kết quả quan trọng như: vi nhân giống dứa, khoai tây, hoa hồng, cúc, cẩm chướng (Viện Công Nghệ Sinh Học), nhân giống chuối, hoa lan (Phân Viện Sinh Học tại Đà Lạt, Đại Học Nông Nghiệp I), nhân giống bạch đàn (Viện lâm Nghiệp) … Đặc biệt là các kết quả nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá, nuôi cấy tế bào trần của thuốc lá và khoai tây ở Viện Sinh Học và Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp Hồ Chí Minh Bằng Việc ứng dụng kỹ thuật lai hữu tính và nuôi cấy túi phấn trên cây lúa, các tác giả Đoàn Thị Ái Thuyên, Phan Xuân Thanh, Lê Đình Hùng đã tạo được 15 dòng lúa đơn bội kép Trong đó có một số dòng kết hợp được nhiều tính trạng mong muốn như: chín sớm, năng suất cao, kháng rầy nâu, chịu phèn, chịu mặn,…Các dòng lúa này đều được trồng ở xã Thanh Lộc (ngoại thành phố Hồ Chí Minh) và được theo dõi nhân lên ở một số địa phương khác phục vụ cho công tác nhân giống trên diện rộng

2.2.4 Ứng dụng của lĩnh vực nuôi cấy mô

Trước kia, người ta dùng phương pháp nuôi cấy mô tế bào để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền, và tác dụng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy

Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô thực vật đã hướng về những ứng dụng thực tiễn Các nhà thực vật học đã áp dụng phương pháp này với mục đích sau:

 Tạo một quần thể cây trồng lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn, với diện tích thí nghiệm nhỏ, có điều kiện hóa lý kiểm soát

 Tạo được nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện được

 Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh

 Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học  Bảo quản nguồn gen quý

2.3 Phương pháp nuôi cấy mô truyền thống

2.3.1 Các nhân tố môi trường in vitro

2.3.1.1 Nhân tố môi trường trên không

Nhân tố môi trường trên không gồm những nhân tố sau:

- Nhiệt độ: cao, thấp, trung bình, khác nhau giữa giai đoạn tối và giai đoạn sáng và thay đổi trong suốt thời gian nuôi cấy

- Ánh sáng: quang phổ, thời gian chiếu sáng/tối, PPF và hướng chiếu sáng - Không khí: CO2, O2, ethylene, hơi nước và các khí khác

2.3.1.2 Nhân tố môi trường vùng rễ

 Nhân tố vật lý

Nhân tố vật lý bao gồm những nhân tố sau: nhiệt độ, nước, thế thẩm thấu, khả năng khuyết tán của chất khí và chất lỏng, độ rắn, dày hay tính chắc của môi trường, chất liệu làm giá thể và thể tích vùng rễ

 Nhân tố hóa học

Nhân tố hóa học gồm những nhân tố sau:

- Chất khoáng: nồng độ, tỷ lệ hiện diện và mất đi, tỷ lệ tương đối và tính tan của các ion

- Các thành phần hữu cơ: đường, chất điều hòa tăng trưởng, chất tạo gel, vitamin và những chất khác

Những nhân tố môi trường trên khoảng không và môi trường vùng rễ là môi

trường in vitro trên và dưới mặt thạch Cơ chế của sự thay đổi môi trường in vitro giống như sự thay đổi môi trường trong vườn ươm cây Nên môi trường in vitro là môi

trường của vườn ươm cây thu nhỏ (Read, 1990)

- Độ ẩm cao

- Nhiệt độ không khí ổn định - Nồng độ CO2 thấp khi có

ánh sáng và cao trong tối - Nồng độ C2H4 cao

- Mức độ hô hấp thấp - Mức độ quang hợp thấp - Mức độ hô hấp trong tối cao - Điện tử trong quang hợp thấp - Năng lượng chiếu sáng thấp - Không có sự cân bằng CO2

Môi trường vùng rễ

- Nồng độ đường cao - Nồng độ muối cao

- Hàm lượng O2 hòa tan thấp - Hàm lượng phenol, độc tố cao - Mật độ vi sinh vật thấp - Hàm lượng chất sinh trưởng

cao

- Mức độ hấp thu nước thấp - Mức độ hấp thu ion thấp - Mức độ hấp thu đường thấp - Mức độ vận chuyển các

chất thành phần môi trường thấp

(Theo Trần Văn Minh, 2003)

Điều được ghi nhận ở đặc tính môi trường in vitro là: hàm lượng dinh dưỡng và

năng lượng thấp hơn môi trường bán kính, có nhiệt độ và ẩm độ ổn định, có sự thay đổi về hàm lượng CO2, nồng độ đường cao và không có vi sinh vật gây hại Những đặc tính này ít thấy trong tự nhiên, nông nghiệp và lâm nghiệp

2.3.3 Những vấn đề trong kiểm soát môi trường in vitro

Cây sống ở môi trường in vitro có sự khác biệt rất lớn so với cây sống ngoài môi trường tự nhiên Môi trường in vitro truyền thống đã được Kozai và cộng sự

(1992) mô tả như sau: độ ẩm tương đối cao, nhiệt độ ổn định, sự chênh lệch lớn của nồng độ CO2 giữa thời gian tối và thời gian sáng, sự hiện diện của đường, muối và chất điều hòa tăng trưởng trong môi trường ở nồng độ cao, sự tích lũy khí ethylene và

những chất độc khác, không có sự hiện diện của vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy Những điều kiện trên thường ngăn sự thoát hơi nước, sự quang hợp, sự hấp thu nước, chất khoáng, CO2 và thúc đẩy sự hô hấp trong tối Kết quả dẫn đến sự sinh trưởng nghèo nàn của mẫu cấy

Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng nuôi cấy mô theo phương pháp truyền thống (bình nuôi cấy được đậy nắp kín cùng với việc sử dụng đường, vitamin, và các chất điều hòa sinh trưởng) có ảnh hưởng không tốt đến sự sinh trưởng và phát

triển của cây cấy mô trong giai đoạn in vitro cũng như ngoài vườn ươm Điển hình như cây con in vitro sinh trưởng chậm, xuất hiện biến dị hình thái và chất lượng, mẫn cảm

với stress ở giai đoạn thuần hóa sau ống nghiệm

Trong nuôi cấy mô truyền thống thì đường được xem như nguồn carbon duy

nhất cho sự phát triển của cây con in vitro Đường hiện diện trong môi trường nuôi cấy

có ảnh hưởng không tốt đến tốc độ quang hợp của cây Các nghiên cứu sinh hóa đã chứng minh rằng đường kìm hãm hoạt động của enzyme rubisco Sự kém hoạt động

của rubisco cũng có nghĩa là cường độ quang hợp của cây in vitro thấp (Hdider và

Desjarding, 1994) Ngoài ra việc sử dụng đường trong môi trường của cây invtro rất hạn chế Theo kết quả nghiên cứu của Kozai và Iwanami (1988) thì lượng đường được cây hấp thụ chỉ ở vào khoảng 2 – 8% lượng đường có trong môi trường, điều này gây sự lãng phí trong sản xuất Sự có mặt của đường ở nồng độ cao là nguyên nhân của sự gia tăng áp suất thẩm thấu của môi trường, làm trở ngại quá trình hấp thu nước và muối khoáng của rễ

Đường và vitamin còn là chất hữu cơ thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật Các nghiên cứu và trong thực tế đã chứng minh rằng sự hiện diện của đường và vitamin trong môi trường nuôi cấy làm tỷ lệ nhiễm nấm và khuẩn cao, dẫn đến chi phí sản xuất và giá thành sản phẩm tăng

Ngoài ra việc sử dụng các loại hộp kín, các bình tam giác đậy bằng nút cao su hay giấy bạc đã làm cho độ ẩm trong bình nuôi cấy thường cao hơn 95% (Fujiwara và Kozai, 1995) Độ ẩm cao làm cho tốc độ thoát hơi nước của các khí khổng kém Độ ẩm cao làm giảm tích lũy chất khô và gây nên mất trật tự về sinh lý và cấu trúc hình thái (hiện tượng thủy tinh thể) Các cây này sẽ bị mất nước nhanh chóng khi đưa ra khỏi ống nghiệm, kết quả là tỷ lệ cây chết cao trong giai đoạn thuần hóa sau ống nghiệm

Trong khi đó cây nuôi cấy in vitro trong điều kiện ẩm độ thấp giảm được sự mất nước

quá độ từ lá và chống lại stress do mất nước khi chuyển trực tiếp từ ống nghiệm ra vườn ươm hay đồng ruộng (Tanaka và các cộng sự, 1992)

Sự kém thông thoáng của hộp nuôi cấy còn ảnh hưởng đến thành phần không khí trong hộp Ngay sau khi bật đèn, nồng độ CO2 trong ống nghiệm giảm xuống rất nhanh do hoạt động quang hợp của cây cấy mô Vì vậy trong suốt thời gian chiếu sáng, cây trong ống nghiệm ở trạng thái đói CO2 trầm trọng, nên chúng phải sử dụng đường của môi trường (Nguyễn Văn Uyển, 1996) Cùng với sự giảm nồng độ CO2 là sự gia tăng tích tụ khí ethylen (C2H4) Ethylen được biết đến như là một chất điều hòa tăng trưởng thực vật Tuy nhiên ở nồng độ cao ethylen là một chất độc đối với cây Nồng độ ethylen trong hộp nuôi cấy tăng dần theo thời gian đến nồng độ 2 μmol mol-1 từ 21 đến 60 ngày sau khi cấy (Nguyễn và Kozai, 1998) Nồng độ ethylen thường tăng cao trong các hộp nuôi cấy kém thông thoáng (De Proft và các cộng sự, 1985)

Thông thường ánh sáng được sử dụng trong phòng nuôi cấy mô chỉ ở vào khoảng 30 – 50 μmol m-2

s-1 Cường độ ánh sáng này thấp hơn nhiều so với điều kiện tự nhiên Việc sử dụng cường độ ánh sáng thấp đã làm giảm khả năng quang hợp, dẫn đến việc cây không sử dụng có hiệu quả nguồn carbon từ CO2 mà phải tăng cường dị dưỡng bằng cách hấp thu carbon từ đường trong môi trường nuôi cấy

Trong nuôi cấy mô truyền thống, agar được sử dụng rất phổ biến như là một giá thể để cố định mẫu cấy Hệ rễ có thể phát triển được trong môi trường agar, tuy nhiên chúng rất mỏng manh, dễ gãy và hư hại khi chuyển ra bầu đất (Roberts và Smith, 1990; Robert và các cộng sự, 1994) Sự phát triển kém của hệ rễ một phần bởi sự kém thông thoáng và sự kém oxygen hòa tan trong môi trường thạch (Fujiwara và Kozai, 1995) Các nghiên cứu đã chứng minh việc thay thế agar trong môi trường nuôi cấy bằng các giá thể xốp như vermiculite, perlite, Florialite đã tạo điều kiện thông thoáng hơn cho sự phát triển hệ rễ (Kozai và các cộng sự, 1996; Nguyễn và Kozai, 1998; Nguyễn và các cộng sự, 1999)

Vì vậy mặc dù ứng dụng của vi nhân giống trong các lĩnh vực làm vườn, nông nghiệp, lâm nghiệp đang rộng khắp thế giới, nhưng tính chất thương mại hóa của nó vẫn còn hạn chế bởi chi phí sản xuất cao và lợi nhuận thấp (Niu và Kozai, 1998)

2.4 Giới thiệu về các hệ thống nuôi cấy trên thế giới

Hệ thống nuôi cấy được cải tiến không ngừng để thuận tiện cho việc sử dụng và nâng cao chất lượng của cây cấy mô

Năm 1897, lần đầu tiên Loed đã sử dụng hệ thống nuôi cấy bằng ống nghiệm

Tuy nhiên hệ thống nuôi cấy này có rất nhiều nhược điểm

Kỹ thuật nuôi cấy trong bình tam giác đã được Carrel phát triển vào năm 1923 Sau thành công này, nhiều hệ thống nuôi cấy đã được thử nghiệm như: bình ống, Erlenmeyer, bình Roux hay đĩa petri (Willmer, 1966) Hiện nay những loại bình này vẫn còn được sử dụng trong vi nhân giống

Ngoài các cải tiến về kiểu dáng, vật liệu dùng thiết kế hệ thống cũng không ngừng thay đổi: thủy tinh, polypropylene, polyvinylglycine và polycarbonate (Zobayed và cộng sự, 2000)

Hiện nay những cải tiến của bình Magenta, được thiết kế đặc biệt để tăng cường sự thoáng khí của không gian trong bình Song song với sự phát triển các loại bình nuôi cấy, khoa học kỹ thuật ngày càng tiến bộ đã tạo ra được nhiều vật liệu khác nhau phục vụ cho việc cải tiến các hệ thống nuôi cấy như màng thoáng khí Milliseal Hệ thống film thoáng khí chứng tỏ có nhiều ưu điểm vượt trội so với các hệ thống cũ tuy nhiên, giá thành của hệ thống này còn quá cao do sử dụng vật liệu đắt tiền (Tetrafluoroethylene perfluoroalkyl vinyl ether copolymer hoặc Tetrafluoroethylene hexafluoropropylene copolymer ) Do đó, khó có thể ứng dụng thương mại trong điều kiện ở Việt Nam

Hầu hết các phòng nuôi cấy mô ở Việt Nam thường sử dụng bình thủy tinh

trong nuôi cấy in vitro Gần đây, những nghiên cứu trong việc sử dụng túi nylon đã chứng tỏ được tính ưu Việt trong việc tiết kiệm chi phí trong nhân giống cây in vitro

Hệ thống túi nylon đang ngày càng được sử dụng rộng rãi, và dần thay thế bình thủy tinh trong các phòng nuôi cấy mô ở nước ta

2.5 Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng

Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation) đã được giáo sư Kozai và các cộng sự đẩy mạnh nghiên cứu trong thập niên 90 Từ đó đến nay có rất nhiều nghiên cứu thành công trong việc ứng dụng phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng vào sản xuất giống cây trồng

Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm hơn phương pháp

truyền thống Nó thúc đẩy sự tăng trưởng của cây in vitro, rút ngắn thời gian nuôi cấy và làm hạ giá thành cây in vitro

Phương pháp mới này chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi trường nuôi cấy (ion, sự khuyết tán khí hòa tan) và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của cây con trong bình nuôi cấy (cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, thành phần không khí, ẩm độ, nhiệt độ và tốc độ luân chuyển của không khí trong bình nuôi cấy…) thay vì chỉ nghiên cứu thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy như nồng độ đường, muối khoáng, vitamin hay các chất điều hòa sinh trưởng thực vật mà các nhà nuôi cấy mô vẫn thường quan tâm Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, đường không được sử dụng trong môi trường nuôi cấy Nói đúng hơn là không sử dụng các cơ chất hữu cơ bao gồm cả các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, vitamin, aminoacid, ngoại trừ các chất khoáng được cho vào môi trường (Nguyễn và Kozai, 1998) Điều này dựa trên cơ sở trong tự nhiên tất cả các cây xanh chứa diệp lục tố điều có khả năng tự quang hợp để tồn tại và phát triển Tất cả các cơ quan dùng trong nuôi cấy mô có diệp lục tố đều có khả năng quang hợp Chúng có thể nhận CO2 trong không khí làm nguồn carbon trong quá trình quang hợp mà không cần đường và vitamin trong quá trình nuôi cấy (Kozai, 1991)

Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng tạo điều kiện tối đa cho cây trong bình nuôi cấy sử dụng khí CO2 có sẵn trong không khí làm nguồn carbon chính cho quá trình tăng trưởng và phát triển của cây Sự loại bỏ đường trong môi trường nuôi cấy dẫn đến tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn trong quá trình nuôi cấy giảm Điều này đem lại ý nghĩa rất lớn trong sản xuất vì chi phí công lao động sẽ giảm đáng kể song song với việc giảm nguyên vật liệu

Theo khái niệm về nuôi cấy mô quang tự dưỡng thì hộp chứa cây cấy mô được xem như một nhà kính thu nhỏ Với phương pháp này sự tăng trưởng và phát triển của

cây in vitro phần lớn chịu ảnh hưởng của các tác nhân vật lý trong môi trường nuôi cấy

như ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ, nồng độ CO2, sự trao đổi khí

Nồng độ CO2 và ánh sáng là hai yếu tố quan trong nhất trong nuôi cấy mô quang tự dưỡng cùng với cơ quan có diệp lục tố (Kozai, 1996) Sự gia tăng khác biệt

giữa nồng độ CO2 bên trong và bên ngoài hộp nuôi cấy cùng với sự gia tăng cường độ ánh sáng làm cho hiệu suất quang hợp tăng (Kozai, 1996)

2.6 Các ứng dụng trong và ngoài nước về nuôi cấy quang tự dưỡng 2.6.1 Ở trong nước

Từ năm 1996 đến nay, Viện sinh học nhiệt đới đã tập trung nghiên cứu nuôi cấy

mô quang tự dưỡng trên các đối tượng như: cà phê (C arabusta), hông (Paulownia

fortunei), neem (Azadirachta indica), lõi thọ (Gmelina arborea Roxb.), tre tầm vông (Thyrsostachys siamensis), bạch đàn (Eucalyptus tereticornis), xoan Ấn Độ (Azadirachta indica A Juss), nho (Vitis vinifera L.), lan Dendrobium

Các thí nghiệm đã chứng minh các cây in vitro phát triển tốt trên môi trường

nuôi cấy không có đường, vitamin và độ thoáng khí của bình nuôi cấy cao Tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn giảm đáng kể (2 – 0%), ngược với phương pháp nuôi cấy truyền thống trên môi trường có đường và vitamin (tỷ lệ nhiễm lên tới 10 % trên tổng số cây nuôi cấy ban đầu) Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của khí khổng ở mặt dưới lá theo quy luật của tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường Trong khi đó cây nuôi theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích

lá nhỏ, khí khổng luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro

ra vườn ươm Tỷ lệ cây sống 95-100 % sau 1 tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống Kết quả đạt được của những nghiên cứu trên là tạo ra các cây cấy mô có chất lượng

cao, tăng trưởng nhanh do rút ngắn thời gian nuôi cấy in vitro Đồng thời tỷ lệ cây chết

trong giai đoạn vườn ươm thấp dẫn đến việc giảm chi phí chăm sóc khi đưa cây ra vườn ươm (Nguyễn Thị Quỳnh, 2005)

2.6.2 Ở nước ngoài

Đã tiến hành nghiên cứu trên cây dâu tây (Fujiwara và các cộng sự, 1988), lan Cymbidium (Heo và các cộng sự, 1996), cẩm chướng (Jeong và các cộng sự, 1996), khoai tây, khoai lang (Heo và Kozai, 1999), cà phê (Afreen và các cộng sự, 2002)

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công Nghệ Sinh Học thuộc Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt từ ngày 20/03/2006 – 14 /08/2006

3.2 Vật liệu thí nghiệm 3.2.1 Thiết bị và dụng cụ

3.2.2 Điều kiện nuôi cấy

3.2.2.1 Đối với thí nghiệm dùng ánh sáng đèn

- Nhiệt độ phòng sáng :25 ± 2 oC - Quang kỳ: 16 giờ/ngày

- Cường độ chiếu sáng: 2500 lux - Độ ẩm trung bình: 75 – 80 %

3.2.2.2 Đối với thí nghiệm dùng ánh sáng tự nhiên

- Nhiệt độ: 18 – 19 o

C - Độ ẩm 80 – 85 %

- Ánh sáng: sử dụng ánh sáng tán xạ

- Lượng mưa trung bình 1800 – 2000mm/năm

- Thắp bổ sung một bóng đèn có công suất 18W trong 4 giờ, khoảng cách từ đèn đến mẫu cấy là 1,8m

3.2.2 Môi trường nuôi cấy

Các thí nghiệm được thực hiện sử dụng môi trường muối khoáng tổng hợp theo Murashige và Skoog (1962), viết tắt là (MS), có bổ sung hoặc không bổ sung đường và vitamin

3.3 Phương pháp thí nghiệm 3.3.1 Bố trí thí nghiệm

Các mẫu Cúc được dòng hóa vô tính trên môi trường MS cơ bản Sau 21 ngày nuôi cấy, sử dụng các chồi ngọn cao khoảng 2cm dùng làm vật liệu cho các thí nghiệm Các kết quả thí nghiệm được ghi nhận sau 21 ngày

Các thí nghiệm đều được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Nếu giữa các nghiệm thức của các thí nghiệm có sự khác biệt ở mức 0,05 hoặc 0,01 thì dùng trắc nghiệm LSD hoặc Ducan để phân hạng

3.3.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của sự thông khí đối với sự sinh trưởng

phát triển của cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dưỡng

Thí nghiệm gồm 25 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bịch, cấy 4 mẫu/bịch

- Tổng số bịch thí nghiệm: 225 - Tổng số mẫu: 900

 Vật liệu thí nghiệm: túi nylon (12cm  18cm); giá thể đất sạch (bán sẵn trên thị trường), môi trường MS không bổ sung đường và vitamin, ánh sáng đèn (viết tắt là MS khoáng)

Bảng 3.1 Mô tả thí nghiệm 1 Nghiệm

thức

Ký hiệu

Loại giấy Số lỗ Số lớp Kích thước lỗ (cm)

3.3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy và tác dụng

của ánh sáng lên sự phát triển của cây Cúc in vitro

Thí nghiệm gồm 2 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên - Yếu tố 1: Phương pháp nuôi cấy: dị dưỡng, quang tự dưỡng

- Yếu tố 2: Ánh sáng: đèn, tự nhiên

Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bịch, cấy 4 mẫu/bịch

- Tổng số bịch thí nghiệm: 36 - Tổng số mẫu: 144

3.3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của giá thể đối với sự phát triển của

cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dưỡng

- Giá thể: Agar, cát, dớn, xơ dừa, đất sạch, giấy báo, giấy vệ sinh

- Thí nghiệm gồm 8 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bịch, cấy 4 mẫu/bịch

- Tổng số bịch thí nghiệm - Tổng số mẫu: 60

3.3.1.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của kích cở bịch nuôi cấy đối với sự phát

triển của cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dưỡng

- Kích cở bịch: 11cm  18cm, 14cm  18cm, 20cm  30cm

Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bịch, cấy 4 mẫu/bịch

- Tổng số bịch thí nghiệm: 27 - Tổng số mẫu: 108

3.3.1.5 Thí nghiệm 5: Ứng dụng phương pháp quang tự dưỡng trong sản xuất giống Cúc đại trà

Thí nghiệm gồm 2 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên

- Môi trường MS khoáng cơ bản; giá thể đất sạch; ánh sáng tự nhiên

Bảng 3.5 Mô tả thí nghiệm 5 Nghiệm

thức

Ký hiệu

Số lỗ Kích thước lỗ

Kích cở bịch

Phương pháp nuôi cấy

Phương pháp nuôi cấy: dị dưỡng, quang tự dưỡng

Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 4 lần, mỗi lần 10 cây Tổng số cây thí nghiệm: 80 cây

Bảng 3.6 Mô tả thí nghiệm 6 Nghiệm thức

Nguồn gốc

phương pháp nuôi cấy Kích cở bịch

3.3.1 Các chỉ tiêu theo dõi

3.3.2.1 Các thí nghiệm 1, 2, 3, 4, 5: Sau 18 – 21 ngày nuôi cấy, quan sát và ghi

nhận sự sinh trưởng, phát triển của cây in vitro qua các chỉ tiêu: gia tăng trọng lượng

tươi, gia tăng trọng lượng khô, chiều cao cây, kích thước lá, số rễ  Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây)

Gia tăng trọng lượng tươi = trọng lượng tươi cuối cùng – trọng lượng tươi ban đầu - Trọng lượng tươi ban đầu: cắt các chồi ngọn có kích thước đồng đều ở trong tủ cấy vô trùng Rồi đưa các chồi ngọn này vào túi nylon vô trùng, cân bằng cân phân tích Sau khi cấy các chồi ngọn này vào các bịch thí nghiệm, tiếp tục cân lại bịch vô trùng Từ đó có thể tính được trọng lượng của tổng các mẫu cấy và trọng lượng tươi trung bình ban đầu của từng mẫu

- Trọng lượng tươi cuối cùng: dùng pince gắp các cây ở mỗi lần lặp lại ra khỏi bịch Sau đó rửa bộ rễ vào trong nước sạch để hạn chế đến mức thấp nhất sự bám dính của giá thể vào bộ rễ Dùng giấy thấm để thấm khô lượng nước còn bám vào bộ rễ rồi cân bằng cân phân tích Từ đó tính được trọng lượng tươi trung bình cuối cùng của mỗi cây ở từng lần lặp lại

Gia tăng trọng lượng tươi cho ta biết sự gia tăng sinh khối tươi của cây  Gia tăng trọng lượng khô (mg/cây)

Gia tăng trọng lượng khô = trọng lượng khô cuối cùng - trọng lượng khô ban đầu - Trọng lượng khô ban đầu: lấy 12 chồi ngọn (3 lần lặp lại, mỗi lần 4 mẫu) có kích thước tương đương nhau, cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 70 oC trong 72 giờ Sau đó lấy ra cân nhanh bằng cân phân tích Từ đó tính được trọng lượng khô trung bình ban đầu của từng mẫu

- Trọng lượng khô cuối cùng: lấy các cây ở từng lần lặp lại, sấy khô tương tự như trên và cân bằng cân phân tích Từ đó tính được trọng lượng khô trung bình cuối cùng của mỗi cây ở từng lần lặp lại

Gia tăng trọng lượng khô cho biết khả năng tích lũy sinh khối hữu cơ của cây  Chiều cao cây (mm/cây)

Dùng thước đo chiều cao cây từ gốc đến ngọn

Chỉ tiêu chiều cao cây đánh giá sức phát triển của cây  Kích thước lá (mm/lá)

Dùng thước đo bề ngang mép lá, của lá thành thục thứ hai (tính từ ngọn) Kích thước lá đánh giá khả năng quang hợp của cây

- Tỷ lệ sống = (số cây cuối cùng/tổng số cây) x 100 - Gia tăng trọng lượng tươi

- Gia tăng chiều cao cây = chiều cao cây cuối cùng – chiều cao cây ban đầu - Kích thước lá

- Số rễ

3.3.4 Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý dựa trên phần mềm MSTATC và Excel

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của sự thông khí đối với sự sinh trưởng phát triển

của cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dưỡng

Sau 21 ngày nuôi cấy, sự tăng trưởng của cây in vitro ở các mức độ thông

thoáng khí khác nhau được thể hiện qua các chỉ tiêu sau:

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của sự thông khí đến các chỉ tiêu tăng trưởng của cây in vitro

Nghiệm thức

Ký hiệu

GTTLT (mg/cây)

GTTLK (mg/cây)

CCC (mm/cây)

KTL

1 ĐC 106,2 MNO 9,23 I 31,33 JKLM 11,83 BCDE 3,5 FGH 2 A111 112,9 LMN 13,17 DEFGHI 37,0 GHIJKL 9,83 EFG 4,33 EFGH 3 A112 214,7 CD 17,7 BCD 53,9 ABC 13,17 AB 9,5 ABC 4 A121 202,8 CDE 15,67 CDEFGH 51,67 ABCD 13,17 AB 6,83 BCDE

6 A131 224,6 BC 16,9 BCDE 45,67 BCDEFG 12,67 ABC 8,6 BC 7 A132 114,2 LMN 15,2 CDEFGH 37,67 GHIJK 11,17 BCDEF 8,4 BC 8 A211 82,43 O 13,4 DEFGHI 34,67 HIJKLM 9,67 FG 5,83 CDEF

10 A221 142,3 IJK 14,2 CDEFGH 40,0 EFGHIJ 11,17 BCDEF 8,17 BC 11 A222 164,4 FGHI 16,8 BCDEF 41,4 EFGHIJ 12,17 BC 9,33 ABC 12 A231 156,0 HIJ 17,93 BCD 38,5 FGHIJK 11,17 BCDEF 7,83 BCD 13 A232 80,73 O 12,77 EFGHI 27,33 LM 9,83 EFG 5,83 CDEF 14 B111 129,5 KLM 13,43 DEFGHI 43,33 DEFGHI 10,0 DEFG 5,87 CDEF 15 B112 157,5 GHIJ 14,23 CDEFGH 49,0 ABCDE 10,83 CDEF 7,5 BCD 16 B121 316,9 A 24,93 A 56,67 A 14,67 A 11,93 A

17 B122 180,0 EFGH 13,9 CDEFGHI 44,0 CDEFGH 12,0 BCD 9,17 ABC 18 B131 192,3 DE 17,43 BCDE 55,0 AB 12,17 BC 9,0 BC 19 B132 137,0 JKL 11,83 GHI 40,17 EFGHIJ 11,33 BCDEF 8,83 BC

22 B221 190,1 DEF 17,33 BCDE 48,33 ABCDEF 12,67 ABC 7,83 BCDEF 23 B222 84,35 O 12,0 FGHI 34,67 HIJKLM 9,67 FG 5,03 FGHI 24 B231 182,3 EFG 16,0 BCDEFG 44,0 CDEFGH 12,0 BCD 9,0 BC 25 B232 99,77 NO 18,5 BC 33,17 IJKLM 11,17 BCDEF 5,7 EFGH

Ghi chú: Ở Bảng 4.1 dưới đây, các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột

không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0.01

Kết quả Bảng 4.1 cho thấy có sự khác biệt rất có ý nghĩa giữa các nghiệm thức ở

các chỉ tiêu tăng trưởng của cây in vitro Trong đó nghiệm thức giấy báo – 1 lỗ, 2 lớp –

kích thước lỗ 1cm x 3cm (B121 ) cho kết quả tốt nhất ở tất cả các chỉ tiêu: gia tăng trọng lượng tươi (316,9mg/cây), gia tăng trọng lượng khô (24,93 mg/cây), chiều cao cây (56,7mm/cây), kích thước lá (14,7mm/lá), số rễ (11,9 rễ/cây) Nghiệm thức giấy A4 – 1 lỗ - 2 lớp – kích thước lỗ 2cm x 3cm (A122) cho kết quả thấp hơn nghiệm thức B121 ở các chỉ tiêu: gia tăng trọng lượng tươi (248,6 mg/cây), gia tăng trọng lượng khô (20,6 mg/cây), chiều cao cây (55mm/cây), kích thước lá (12,8mm/lá), số rễ (9,7 rễ/cây) Giữa hai nghiệm thức B121 và nghiệm thức A122, ngoại trừ chỉ tiêu gia tăng trọng lượng tươi có sự khác biệt có ý nghĩa Các chỉ tiêu còn lại không có sự khác biệt về mặt thống kê

Ở tất cả các chỉ tiêu tăng trưởng, nghiệm thức B121 và nghiệm thức A 122 có sự khác biệt so với nghiệm thức 0 lỗ thông khí (ĐC) và nghiệm thức giấy báo – 2 lỗ – 1lớp – kích thước lỗ 2cm x 3cm (B212)

Giữa nghiệm thức ĐC và nghiệm thức B212, chỉ tiêu gia tăng trọng lượng khô ở nghiệm thức B212 cao hơn nghiệm thức ĐC (10,8 mg/cây so với 9,23 mg/cây) Ngược lại, ở chỉ tiêu chiều cao cây, nghiệm thức B212 thấp hơn nghiệm thức ĐC (24,7mm/cây so với 31,3mm/cây) Tuy nhiên chỉ tiêu gia tăng trọng lượng khô và chiều cao cây giữa hai nghiệm thức ĐC và B212 không có sự khác biệt về mặt thống kê Các chỉ tiêu còn lại ở nghiệm thức ĐC cao hơn và có sự khác biệt so với nghiệm thức B212 Cụ thể như sau: gia tăng trọng lượng tươi (106,2 mg/cây so với 30,6 mg/cây), kích thước lá (11,8mm/lá so với 8mm/lá), số rễ (3,5 rễ/cây so với 2 rễ/cây).

Qua quá trình theo dõi thí nghiệm và phân tích số liệu, chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau:

- Ở các nghiệm thức có sự thông thoáng khí quá lớn (cụ thể là nghiệm thức B212), các chỉ tiêu tăng trưởng cho kết quả thấp nhất Điều chúng tôi quan sát được ở các nghiệm thức này đó là:

+ Giá thể ở trong tình trạng thiếu ẩm độ

+ Gia tăng trọng lượng tươi, gia tăng trọng lượng khô và chiều cao cây thấp + Kích thước lá nhỏ Các lá ở các nghiệm thức này có màu xanh sẫm chứng tỏ chúng có sự quang hợp mạnh Tuy nhiên phần lớn các lá này ở trong tình trạng héo khô do bị thiếu nước

+ Số rễ ít, đầu chóp rễ bị khô

Những kết quả trên chứng tỏ cây được nuôi cấy ở mức độ thông khí quá lớn, sự trao đổi khí và thoát hơi nước trong bịch nuôi cấy diễn ra mạnh Độ ẩm trong bịch nuôi cấy không được duy trì Điều đó dẫn đến tình trạng cây không đủ nước để duy trì các hoạt động sống một cách bình thường

- Ở nghiệm thức không có sự thông thoáng (ĐC), các chỉ tiêu tăng trưởng cũng cho kết quả rất thấp Đặc biệt là chỉ tiêu gia tăng trọng lượng khô cho kết quả thấp nhất

- Ở tất cả các nghiệm thức của thí nghiệm 1, cây sinh trưởng trong môi trường MS khoáng cơ bản (không có đường và vitamin) Vì vậy hoạt động sống của cây chủ yếu dựa vào nguồn CO2 Ở nghiệm thức đối chứng, cây không có sự trao đổi khí với môi trường bên ngoài Nên hoạt động sống của cây chủ yếu dựa vào lượng CO2 dự trữ trong bịch Lượng CO2 dự trữ này không đủ cho cây hoạt động quang hợp bình thường Bên cạnh đó, độ ẩm trong bịch nuôi cấy quá cao (thể hiện qua lượng nước tích tụ trên thành bịch) Độ ẩm cao đã làm cho tốc độ thoát hơi nước của các khí khổng kém Điều này làm cản trở sự hấp thu nước và muối khoáng từ trong môi trường nuôi cấy, đồng thời gây trở ngại cho sự vận chuyển nước và các chất khoáng trong bó mạch (Fujiwara và Kozai, 1995) Do đó

lượng sinh khối do cây tạo ra ở nghiệm thức này rất thấp

- Ở nghiệm thức có sự thông thoáng khí ở mức vừa phải (cụ thể là nghiệm thức B121), các chỉ tiêu tăng trưởng cho kết quả cao nhất Sự thông thoáng khí ở mức độ vừa phải này không những đảm bảo sự duy trì ẩm độ trong bịch nuôi cấy mà còn giúp cho cây sử dụng có hiệu quả nguồn CO2 từ môi trường bên ngoài để tham gia vào quá trình quang hợp

Kết luận sơ bộ: Qua kết quả ở thí nghiệm trên, chúng tôi rút ra một số kết luận như

sau: sử dụng túi nylon có một lỗ thông khí Lỗ thông khí được dán giấy báo 2 lớp có kích thước 1cm x 3cm, và giấy A4 2 lớp có kích thước lỗ 2cm x 3cm cho kết quả tốt nhất

Qua kết quả thu được ở Bảng 4.1 và những số liệu phân tích trên các biểu đồ ở

thí nghiệm 1, cho thấy: giấy báo và giấy A4 đều có thể sử dụng để dán lỗ thông khí Ảnh hưởng của số lỗ, số lớp giấy và kích thước lỗ không có ý nghĩa quyết định đến kết quả thí nghiệm, mà chỉ góp phần phục vụ mục đích tìm độ thông thoáng khí thích hợp, giúp cho hoạt động sinh lý của cây quang tự dưỡng diễn ra một cách bình thường

Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây)

190.1 182.3

180 192.3

Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng của sự thông khí đến sự gia tăng trọng lượng tươi của

cây in vitro

Gia tăng trọng lượng khô (mg/cây)

16.8 17.9324.93

ĐCGiấy A4Giấy báo

Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng của sự thông khí đến sự gia tăng trọng lượng khô của

cây in vitro

Chiều cao cây (mm/cây)

ĐCGiấy A4Giấy báo

Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng của sự thông khí đến chỉ tiêu chiều cao thân của cây in

vitro

Kích thước lá (mm/lá)

10 10.8314.67

12 11.17

ĐCGiấy A4Giấy báo

Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng của sự thông khí đến chỉ tiêu kích thước lá của cây in vitro

8.6 8.4

8.17 7.83

9.17 9

Biểu đồ 4.5 Ảnh hưởng của sự thông khí đến chỉ tiêu số rễ của cây in vitro

Hình 4.1 Cây in vitro tăng trưởng ở các lớp giấy khác nhau

Hình 4.2 Cây in vitro tăng trưởng ở các kích thước lỗ khác nhau

Hình 4.3 Cây in vitro tăng trưởng ở các số lỗ khác nhau

4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy và tác dụng của ánh

sáng lên sự phát triển của cây Cúc in vitro

Qua quá trình theo dõi và phân tích số liệu chúng tôi thu được một số kết quả được

trình bày trong Bảng 4.2

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy và tác dụng của ánh sáng

lên sự phát triển của cây Cúc in vitro

Nghiệm thức (mg/cây) GTTLT (mg/cây) GTTLK (mm/cây) CCC (mm/lá) KTL SR

DĐ DT QĐ QT

427,1 A

423,6 A 282,8 C 361,0 B

20,77 29,01 24,33

31,33

89,67 A

50,75 BC 61,75 B 47,00 C

9,00 C 12,67 B 13,75 AB

14,58 A

8,92 C

17,43 A

10,00 C 13,67 B

Phương pháp nuôi cấy

Dị dưỡng Quang tự dưỡng

425,3 A 321,9 B

24,92 B 27,83 A

70,208 A54,375 B

10,83 B 14,17 A

Ánh sáng

Đèn Tự nhiên + đèn

355,0 B 392,3 A

22,55 B 30,20 A

75,708 A48,875 B

11,38 B 13,63 A

9,46 B 15,54 A

4.2.1 Gia tăng trọng lượng tươi

Dựa vào Bảng 4.2 cho thấy có sự khác biệt về chỉ tiêu gia tăng trọng lượng tươi

giữa các nghiệm thức là có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 0,05 Trong đó nghiệm thức dị dưỡng – ánh sáng đèn (DĐ) có sự gia tăng trọng lượng tươi cao nhất (427,1 mg/cây), và nghiệm thức quang tự dưỡng – ánh sáng đèn (QĐ) có sự gia tăng trọng lượng tươi thấp nhất (282,8 mg/cây) Điều đó cho thấy ở điều kiện ánh sáng đèn, cường độ ánh sáng yếu, khả năng sử dụng nguồn CO2 của cây quang tự dưỡng bị hạn chế, dẫn đến sự

hạn chế khả năng quang hợp của cây Sự tăng trưởng của cây quang tự dưỡng chủ yếu phụ thuộc vào hoạt động quang hợp để tổng hợp chất hữu cơ Nên cây quang tự dưỡng cho gia tăng trọng lượng tươi thấp nhất Đối với cây dị dưỡng, cây sử dụng đường trong môi trường làm nguồn carbon cho quá trình phát triển Thêm vào đó, cây dị dưỡng được nuôi cấy trong điều kiện không thoáng khí (độ ẩm cao, nồng độ ethylene cao, nồng độ CO2 thấp), dẫn đến sự rối loạn biến dưỡng và hình thái Kết quả đưa đến sự tích tụ nước quá mức hay còn gọi là hiện tượng thủy tinh thể (vitrification hay hyperhydricity) (Woodward S., 1991; Leshem B và Sachs F ,1985), sự trong mờ hay sự mọng nước Kết quả là sự gia tăng trọng lượng tươi của cây đạt ở mức cao nhất

Xét về phương pháp nuôi cấy, sự khác biệt gia tăng trọng lượng tươi giữa các nghiệm thức là rất có ý nghĩa ở mức 0,01 Trong đó nuôi cấy dị dưỡng cho sự gia tăng trọng lượng tươi cao nhất (425,3mg/cây)

Xét về ánh sáng, sự khác biệt gia tăng trọng lượng tươi giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa Trong đó, các nghiệm thức sử dụng ánh sáng tự nhiên có bổ sung ánh sáng đèn đạt trọng lượng tươi cao nhất (392,3mg/cây) Điều đó chứng tỏ sự gia tăng cường độ ánh sáng ở mức thích hợp, làm gia tăng hiệu suất quang hợp Qua đó làm gia tăng sinh khối của cây (Kozai, 2005; Bùi Trang Việt, 2000)

Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây)

AS đèn AS tự nhiên

dị dưỡngquang tự dưỡng

Biểu đồ 4.6: Sự khác biệt về gia tăng trọng lượng tươi giữa các nghiệm thức

 Ghi chú:

AS đèn : Ánh sáng đèn AS tự nhiên : Ánh sáng tự nhiên

4.2.2 Gia tăng trọng lƣợng khô

Kết quả nhận được cho thấy ở nghiệm thức quang tự dưỡng – ánh sáng tự nhiên (QT) cho gia tăng trọng lượng khô cao nhất (31,33mg/cây) và nghiệm thức dị dưỡng -ánh sáng đèn (DĐ) cho kết quả thấp nhất (20,77mg/cây) Nhưng sự khác biệt giữa tất cả các nghiệm thức là không có ý nghĩa về mặt thống kê

Tuy nhiên khi xét riêng giữa từng cặp tác nhân: dị dưỡng và quang tự dưỡng; ánh sáng đèn và ánh sáng tự nhiên Sự khác biệt rất có ý nghĩa Các nghiệm thức dùng phương pháp quang tự dưỡng và nghiệm thức sử dụng ánh sáng tự nhiên có kết quả gia tăng trọng lượng khô cao nhất Từ kết quả trên chúng tôi rút ra một số nhận xét:

Cây được nuôi cấy trong điều kiện quang tự dưỡng, nguồn carbon cung cấp cho cây chủ yếu là CO2 của không khí Qua các lỗ thông khí, cây vừa lấy nguồn CO2 từ môi trường bên ngoài để quang hợp, vừa thải khí ethylene, và có thể là các khí ức chế sinh trưởng nào đó, đồng thời giảm độ ẩm trong bịch nuôi cấy Sự trao đổi khí làm gia tăng khả năng hấp thụ và thoát hơi nước của lá, giúp cho sự vận chuyển chất khoáng trong cây dễ dàng (Bùi Trang Việt, 2000) Kết quả làm giảm sự tích lũy nước quá mức và gia tăng khối lượng vật chất khô

Trong điều kiện ánh sáng tự nhiên, cường độ ánh sáng cao, nồng độ khí CO2cao, giúp cho bộ máy quang hợp của cây hoạt động hiệu quả Trong đó lá là cơ quan chủ yếu để quang hợp tạo ra sản lượng vật chất khô Vì vậy sản lượng vật chất khô phụ thuộc chủ yếu vào diện tích lá Qua các kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy ở các nghiệm thức sử dụng ánh sáng tự nhiên: kích thước lá và số rễ có sự gia tăng đáng kể nó cũng đóng vai trò quan trọng tạo nên sự khác biệt trong gia tăng trọng lượng khô giữa nghiệm thức sử dụng ánh sáng đèn và ánh sáng tự nhiên

Gia tăng trọng lượng khô (mg /cây)

AS đènAS tự nhiên

dị dưỡngquang tự dưỡng

Biểu đồ 4.7 Sự khác biệt về gia tăng trọng lƣợng khô giữa các nghiệm thức