Nghiên cứu so sánh sự phát triển sinh khối và hàm lượng β-glucan ở một số chủng nấm Hương nuôi cấy trong môi trường lỏng

Nghiên cứu so sánh sự phát triển sinh khối và hàm lượng β-glucan ở một số chủng nấm Hương nuôi cấy trong môi trường lỏng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆPTÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU SO SÁNH SỰ PHÁT TRIỂN SINH KHỐI VÀHÀM LƯỢNG β-GLUCAN Ở MỘT SỐ CHỦNG NẤM HƯƠNG

NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG LỎNG

HÀ NỘI – 2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận nàylà trung thực và chưa hề được sử dụng trong các công bố khoa học nào trướcđây.

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận nàyđã được cảm ơn và các thông tin được trích dẫn trong khóa luận này đã được ghirõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 24 tháng 5 năm 2010

Bùi Thị Kim Tuyền

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này ngoài sự cố gắng của bản thântôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của cá nhân và tập thể Trước hết tôi xinbày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Duy Lâm - Giám đốc Trung tâmNghiên cứu và Kiểm tra chất lượng nông sản thực phẩm – Viện Cơ điện nôngnghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi thựchiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Công nghệ thực phẩmtrường ĐH Nông nghiệp Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập vànghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ trong Trung tâm Nghiên cứu vàKiểm tra chất lượng nông sản thực phẩm – Viện Cơ điện nông nghiệp và Côngnghệ sau thu hoạch đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệpnày.

Qua đây tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, khích lệvà giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Thay lời cảm ơn một lần nữa tôi xin gửi đến các thầy cô cùng toànthể các anh chị và các bạn lời chúc tốt đẹp nhất.

Hà Nội, ngày 24 tháng 5 năm 2010

Bùi Thị Kim Tuyền

DANH MỤC ĐỒ THỊ - BIỂU ĐỒ - HÌNH ẢNH vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vii

Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về nấm Hương và hệ sợi nấm Hương 3

2.1.1 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của nấm Hương 3

2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Hương .42.1.3 Giá trị dinh dưỡng của nấm Hương 5

2.2 Hoạt chất β-glucan 6

2.2.1 Định nghĩa 6

2.2.2 Hoạt tính sinh học của β-glucan 8

2.2.3 Ứng dụng của β-glucan 10

2.2.4 β-glucan trong nấm Hương 11

2.3 Một số sản phẩm thương mại từ nấm Hương 13

2.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm Hương 14

2.4.1 Tình hình ngoài nước 14

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

2.5 Nuôi cấy hệ sợi nấm Hương trong môi trường lỏng 17

2.5.1 Phương pháp lên men chìm đối với vi sinh vật 17

2.5.2 Môi trường nuôi cấy lỏng cho nấm Hương 19

2.5.3 Ảnh hưởng của chủng giống 20

2.5.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng đối với nấm Hương 20

Phần III ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU223.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm, thời gian nghiên cứu 22

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất tiến hành 22

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 23

3.2 Nội dung nghiên cứu 23

3.3 Phương pháp nghiên cứu 24

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 24

3.3.2 Phương pháp chuẩn bị môi trường 25

3.3.3 Phương pháp nuôi cấy 26

3.3.4 Phương pháp xác định lượng sinh khối tươi và khô 26

3.3.5 Phương pháp phân tích hàm lượng β-glucan 27

3.3.6 Phương pháp xử lý thống kê 29

Phần IV KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 30

4.1 Đánh giá sự phát triển sinh khối của các chủng nấm Hương trên môitrường thạch PDA 30

4.2 Đánh giá sự phát triển của các chủng nấm Hương trong môi trường lỏngPDR 32

4.3 Đánh giá hàm lượng β-glucan trong sinh khối sợi nấm ở một số chủngnấm Hương phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng 34

Phần V KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 38

5.1 Kết luận 38

5.2 Đề nghị 38

PHỤ LỤC 42

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Một số loại β-glucan 6Bảng 4.1 Đường kính (mm) hệ sợi của các chủng giống nấm Hương trênmôi trường PDA 30Bảng 4.2 Khối lượng sinh khối sợi nấm khô của các chủng nấm Hương nuôicấy trong môi trường lỏng PDR sau 22 ngày 33Bảng 4.3 Hàm lượng glucan của các chủng nấm Hương 36

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Liên kết β-1,3 glicozit và β-1,6 glicozit 7Hình 2.2 Liên kết β-1,3; glicozit β-1,6 glicozit và β-1,3:β-1,6 glicozit củaphân tử β-glucan 7Hình 2.3 Công thức cấu tạo Lentinan 12Hình 2.4 Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật 18Hình 4.1 Sự phát triển của 3 chủng nấm Hương sau 6 ngày nuôi cấy trênmôi trường thạch PDA (Từ trái qua phải là các chủng Ld, Lg, Lc) 32Hình 4.2 Sự phát triển của 3 chủng nấm Hương sau 9 ngày nuôi cấy trênmôi trường thạch PDA (Từ trái qua phải là các chủng Ld, Lg, Lc) 32Hình 4.3 Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độD-glucose 35Hình 4.4 Sự thay đổi đường kính hệ sợi nấm của các chủng nấm Hương 42Hình 4.6 Sự phát triển sinh khối sợi nấm Hương sau 22 ngày nuôi cấy trongmôi trường lỏng PDR của các chủng nấm Ld (trên cùng), Lg (ở giữa), Lc(hình dưới cùng) 43

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

1 APPIF (acute phase protein-inducing factor): là một dạng phân tử củainterleukin.

2 AZT (Azido-Thymidine): là một chất có tác dụng ngăn cản sự nhân lêncủa virus bằng cách tác động vào quá trình ARN của virus HIV.

3 CFS (colony-stimulating factor): yếu tố kích thích quần thể

4 IL(interleukin): là một trong những yếu tố tạo ra phản ứng viêm của cơthể bằng cách tăng nhiệt độ, kiểm soát tế bào bạch cầu lymphocyte, giatăng tế bào tủy xương

5 KLMPT: khối lượng mẫu đem phân tích.

6 LEM (Lentinula Edodes Mycelium): chế phẩm tách chiết từ hệ sợi nấmHương.

Từ nhiều thế kỷ nay nấm ăn đã được biết đến như một nguồn thực phẩmbổ dưỡng có lợi cho sức khỏe Ngày nay các nhà khoa học càng khẳng định hơnnữa giá trị dinh dưỡng và dược tính của loại thực phẩm vừa là rau vừa là thịtnày Nấm ăn được gọi là loại thực phẩm vừa là rau vừa là thịt vì nó có rất ít chấtbéo, cung cấp ít năng lượng nhưng lại rất giàu protein và axít amin Trong các

loại nấm ăn thì phải kể đến nấm Hương (Lentiluna edodes) Nấm Hương rất

quen thuộc trong ẩm thực của cả phương Đông lẫn phương Tây Hiện nay, nấmHương được xếp vào nguồn cung cấp thực phẩm chức năng Nấm Hương đemlại giá trị dinh dưỡng cao, có chứa tới gần 40 loại enzym và axit amin cần thiếtđối với cơ thể người Nấm Hương chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao (β-glucan, Eritadinin, LEM) giúp tăng cường miễn dịch, hạ cholesterol và men gan[3].

Do nấm Hương có giá trị dinh dưỡng cao lại chứa các hoạt chất sinh họccó lợi cho sức khỏe nên các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu về nó Theokết quả của nhiều nghiên cứu thì hệ sợi nấm Hương cũng chứa tương đối đầy đủvề số lượng và chất lượng các hoạt chất sinh học và dinh dưỡng như ở trong thể

quả [21] Việc nuôi cấy hệ sợi nấm cho phép rút ngắn thời gian, không đòi hỏiđiều kiện nhiệt độ khắt khe như nuôi trồng nấm thu thể quả Mặt khác việc nuôicấy hệ sợi nấm Hương lại hoàn toàn có thể sử dụng phương pháp nuôi cấy trongmôi trường lỏng [9] Hiện nay trên thế giới việc nghiên cứu sự phát triển của cácloại nấm ăn (nấm Hương, nấm Sò ) cũng như nấm dược liệu (nấm Linh Chi)trong môi trường lỏng là rất phổ biến Trong khi nước ta có nguồn gen nấmHương phong phú, có nhiều giống nấm địa phương, rất có điều kiện để pháttriển sản xuất sinh khối nhưng trong nuôi trồng nấm chưa có làm giống lỏng,chưa sản xuất sinh khối Phổ biến ở nước ta là kỹ thuật nuôi trồng nấm trên giáthể rắn lấy thể quả Do đó việc nghiên cứu nuôi cấy nấm trong môi trường lỏngcó ý nghĩa vô cùng lớn.

Bên cạnh đó khả năng nấm Hương cho sinh khối và hàm lượng hoạt chấtsinh học nhiều hay ít còn phụ thuộc rất nhiều vào chủng giống nấm Dù với bấtkỳ mục đích nào như thu sinh khối sợi hay hoạt chất sinh học để sản xuất thựcphẩm chức năng hoặc làm giống nấm nuôi trồng lấy thể quả thì việc nghiên cứukhả năng phát triển của các chủng nấm Hương cũng là khâu đầu tiên và rất quantrọng Vì vậy, trong khuôn khổ của khóa luận tốt nghiệp này, chúng tôi tiến hành

thực hiện đề tài “Nghiên cứu so sánh sự phát triển sinh khối và hàm lượng glucan ở một số chủng nấm Hương nuôi cấy trong môi trường lỏng”.

- Nuôi cấy tạo sinh khối nấm Hương trong môi trường lỏng.

- Xác định được hàm lượng β-glucan do các chủng nấm Hương tạo ra.

Phần II

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM HƯƠNG VÀ HỆ SỢI NẤM HƯƠNG2.1.1 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của nấm Hương

2.1.1.1 Đặc điểm hình thái

Nấm Hương hay còn gọi là nấm Đông Cô, Hương Cô (danh pháp khoa

học: Lentinula edodes) là một loại nấm ăn có nguồn gốc bản địa ở Đông Á.

Tiếng Anh và các ngôn ngữ châu Âu gọi nó theo tên tiếng Nhật là shiitake Nấm

Hương thuộc họ Tricholomataceae, bộ Agaricaless, lớp phụ Hymenomycetidae,lớp Holobasidiomycetes (hoặc Homobasidio-mycetes hay Eubasidiomycetes),ngành phụ Basidiomycotina, ngành Nấm thật – Eumycota, giới Nấm – Mycontahay Fungi [1].

Nấm Hương thuộc nhóm nấm hoại sinh, nhóm nấm mọc trên gỗ NấmHương có dạng như cái ô, mũ nấm có đường kính 4 - 10 cm, màu nâu nhạt, khichín chuyển thành nâu sậm Lúc đầu mũ nấm có dạng nón nhọn ở giữa, sau trảirộng ra và bằng phẳng Viền của mũ thường cuộn vào trong Mặt ngoài có màunâu đến đen và rải rác những vẩy trắng Phiến nấm có màu trắng Bề ngang củaphiến tương đối rộng và có khuynh hướng bám vào cuống nấm Mặt trên tai nấmmàu nâu, mặt dưới có nhiều bản mỏng xếp lại Thịt nấm màu trắng, cuống hìnhtrụ [1].

2.1.1.2 Đặc tính sinh học của nấm Hương

Chu trình sống của nấm Hương: đảm bào tử nảy mầm cho hệ sợi sơ cấp.Hai sợi sơ cấp khác phải phối hợp cho hệ sợi thứ cấp Hệ sợi thứ cấp phát triểnthành mạng hệ sợi Trong điều kiện thuận lợi mạng hệ sợi sẽ kết hạch tạo tiền

quả thể (nụ nấm) Nụ nấm tiếp tục lớn dần cho tai nấm trưởng thành, các phiếndưới mũ mang các đảm và sinh ra bào tử Đảm bào tử được phóng thích và chutrình lại tiếp tục.

Giai đoạn phát triển của hệ sợi nấm Hương: Chu trình bắt đầu tử bào tử

đảm nảy mầm cho hệ sợi nấm Hương, sợi nấm lúc đầu nhỏ khoảng 1,5 - 1,0 mmđường kính, về sau lớn dần lên đến kích thước đường kính 1,0 - 2,0 mm Sauquá trình tiếp hợp giữa hai sợi nấm sơ cấp đơn nhân sẽ hình thành nên các sợinấm thứ cấp song nhân Các sợi nấm tăng trưởng theo kiểu tạo ra các móc(clamp) và để lại dấu vết giữa các tế bào Khi gặp điều kiện bất lợi các sợi nấmsong nhân có thể tạo ra các bào tử màng dày (bào tử áo – chlamydospore) giúpsợi nấm sống sót qua các trường hợp bất lợi này Bào tử màng dày khi điều kiệnthuận lợi sẽ nảy mầm tạo ra những sợi nấm mới Khi sợi nấm thứ cấp đã pháttriển dày đặc trên cơ chất sẽ bắt đầu quá trình phân hóa để tạo ra quả thể Trướckhi ra quả thể thì hệ sợi nấm Hương này phát triển sinh khối đến mức tối đachuẩn bị cho quá trình ra quả thể.

2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm Hương

Nấm Hương ngoài sử dụng trực tiếp nguồn xenlulô còn cần thêm nitơ.Đạm thích hợp cho nấm chủ yếu ở dạng hữu cơ như: pepton, axit amin, urê vànhiều loại muối amôni Nấm Hương không thể sử dụng đạm vô cơ như: nitrathay nitrit Nồng độ thích hợp cho sự tăng trưởng của hệ sợi như là: Sulfatammon 0,03% hay Tartrat ammon 0,06% tùy thuộc vào nguồn đạm cung cấp.Nhưng nếu nồng độ đạm cao hơn 0,02% như với sulfat ammon sẽ ức chế sự pháttriển của thể quả Sự hình thành thể quả cần có đường và đạm Yêu cầu đối vớinồng độ đường phải cao, tối thiểu là 8% đối với đường saccharose.

Nhu cầu dinh dưỡng khoáng của nấm Hương như: Mn, Fe, Zn cần 2mg/l.Ngoài ra còn cần Mg, S, K, P để thúc đẩy sự tăng trưởng của nấm Để sợi nấmphát triển tốt nhất cần bổ sung thêm vitamin B với lượng 100µg/l Giá trị pH

thích hợp cho sợi nấm phát triển trong môi trường lỏng là 4,5 - 5,0 Ở pH 8, nấmmọc rất chậm [2].

Nấm Hương mọc ký sinh trên những cây có lá to và thay lá mỗi mùa nhưdẻ, sồi, phong Nấm Huơng thích hợp với khí hậu ôn đới, ưa ẩm

Các thông số môi trường cơ bản cho sự phát triển của nấm Hương [22]: Nhiệt độ sợi nấm phát triển tốt nhất là 24 - 260C

 Nhiệt độ quả thể nấm hình thành và phát triển khoảng 15 - 160C. Độ ẩm cơ chất: 65 - 70%

 Độ ẩm không khí: ≥ 80%  Độ pH trung tính

 Ánh sáng không cần thiết trong giai đoạn sợi nấm phát triển Giai đoạnhình thành quả thể cần ánh sáng khuếch tán

 Độ thông thoáng trung bình.

2.1.3 Giá trị dinh dưỡng của nấm Hương

Nấm Hương có giá trị dinh dưỡng cao Trong 100g nấm Hương khô (phầnăn được) có chứa 13g nước, 19g prôtêin, 1,8g lipit, 54g hydrat cacbon, 7,8g chấtxơ, 4,9g chất khoáng Vitamin trong nấm Hương cũng rất phong phú: vitaminB1, B2, B12, vitamin PP, provitamin D Ngoài ra trong nấm Hương chứa đầy đủcác loại axít amin, có tới 9 loại axít amin không thay thế (Izôlơxin, Lơxin, Lixin,Mêthiônin, Phênylalanin, Valin, Tyrozin, Trytophan, Alanin).

Hơn nữa trong nấm Hương và hệ sợi nấm Hương có tới 40 loại enzym,một số enzym đáng chú ý như là enzym β (1-3) glucozidaza, kitinaza, lipoidaza,ligninaza, pepsin, loxintinaza, pectinaza, saccaraza, transferaza, hemixenlulaza,amylotransferaza, inulaza, glycozidaza, insulinaza, asparaginaza, peroxydaza,lactaza, tyrozin oxydaza…[2, 21] Theo Mizuno yếu tố tạo nên hương thơm, vị

ngon của nấm là monosodium glutamate, nucleotit, amino axit tự do, chuỗipeptit, axit hữu cơ (axit malic, axít fumalic, axít glutaric, axít oxalic, axít lactic,… ) và đường [16].

2.2 HOẠT CHẤT β-GLUCAN2.2.1 Định nghĩa

glucan là một polysaccarit của D-glucose với các liên kết glicozit glucan là một nhóm các phân tử glucan khác nhau ở khối lượng phân tử, tínhhòa tan, độ nhớt và cấu hình trong không gian β-glucan thường có trong thànhtế bào thực vật, hạt ngũ cốc, nấm men, nấm và vi khuẩn Trong tự nhiên β-glucan có nhiều trong nấm như là nấm Sò, nấm Hương [14]

β-Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-glucan với liên kết (1,3/1,6) có hoạttính sinh học cao hơn β-glucan với liên kết (1,4/1,6) Sự khác nhau giữa các mốiliên kết và cấu trúc hóa học β-glucan sẽ ảnh hưởng đến tính hòa tan, hoạt độngvà hoạt tính sinh học của chúng β-glucan càng phân nhánh mạnh hoạt tính sinhhọc càng cao [14]

Hình 2.1 Liên kết β-1,3 glicozit và β-1,6 glicozit

Hình 2.2 Liên kết β-1,3; glicozit β-1,6 glicozit và β-1,3:β-1,6 glicozit củaphân tử β-glucan

2.2.2 Hoạt tính sinh học của β-glucan2.2.2.1 Hoạt tính chống ung thư

Tháng 12/1985 Công ty Ajinomoto, Yamanouchi và Morishita đã táchchiết β-glucan từ hệ sợi nấm Hương và đã tạo ra chế phẩm như là một dượcphẩm chống ung thư, đặc biệt là ung thư dạ dày có hiệu quả cao Cơ chế cơ bảnlà tăng cường miễn dịch, nâng cao khả nǎng của đại thực bào, một trong nhữngtế bào quan trọng nhất của hệ thống miễn dịch và giết chết tế bào ung thư [16]

Hầu hết các phân đoạn polysaccarit tách từ nấm Hương có hoạt động kíchthích đại thực bào, gia tǎng yếu tố tạo protein pha cấp tính (APPIF), yếu tố gâygiãn mạch và xuất huyết (VDHIF), yếu tố tạo IL - 1 (IL - 1PF), IL - 3 và yếu tốkích thích quần thể (CSF) Các yếu tố này đều xuất hiện, đạt tới cực đại chỉ sauvài giờ cho uống hoặc tiêm lentinan Do vậy hiệu lực chống ung thư thựcnghiệm sarcoma 180 rất rõ ràng [7] Các dòng tế bào ung thư khác cũng đã đượckiểm tra có kết quả rất thuyết phục.

Trên lâm sàng, lentinan đã được kiểm tra kỹ về hoạt tính chống ung thư,đặc biệt hầu như không có tác dụng phụ, do đó được áp dụng như một trị liệupháp có hiệu quả cao cho các bệnh nhân ung thư Nhìn chung, trong nhữngtrường hợp ung thư đường dạ dày - ruột, kể cả đến giai đoạn 3, kết quả vẫn rấtkhả quan Trị liệu phối hợp giữa lentinan với tegafur uracil làm tǎng thời giansống hơn nhiều so với chỉ dùng tegafur uracil đơn độc Trường hợp ung thư dạdày, mức sống sau 1, 2 và 3 nǎm sau khi uống tegafur uracil tǎng chỉ cỡ : 2,9%và 0% Trong khi các bệnh nhân tiêm dưới da thêm lentinan, mức 1mg 2lần/tuần hoặc 2mg 1 lần/tuần, đạt mức sống tương ứng là 19,5%, 10,4% và 6,5%[7] Kết quả tương tự cũng đạt được trong các ca ung thư ruột già.

2.2.2.2 Hoạt tính chống virus, vi khuẩn

β-glucan và các dẫn xuất của nó có tác dụng chống virus, vi khuẩn và kýsinh trùng thông qua sự tăng cường các phản ứng miễn dịch bằng cách gia tăngsố lượng, kích thước, khả năng của đại thực bào, tăng cường hoạt động củalymphocyte T và B, về thực chất cũng giống với cơ chế chống ung thư

Gần đây các nhà nghiên cứu tại Trường Đại học Y ở Yamaguchi NhậtBản đã thông báo rằng Lentinan có hiệu ứng “ bảo vệ” (protective effect) Đó làức chế sự phá hủy tế bào bình thường do ảnh hưởng của virus HIV Trên lâmsàng đã cho thấy khi sử dụng Lentinan cùng với hợp chất AZT (azido-Thymidine) có thể ngăn chặn virus HIV cao hơn chỉ sử dụng AZT đơn độc đồngthời giảm độc tính của AZT, đặc biệt sulphat lentinan ức chế rất mạnh hoạt tínhcủa reverse transcriptase (enzym sao chép ngược của HIV) [21].

Lentinan còn có khả năng giúp những người bị lao phổi chống lại độc tốcủa vi khuẩn lao Nếu sử dụng Lentinan 1g/ngày, mỗi tuần 2 lần thì có thể ngănchặn hoàn toàn độc tố của vi khuẩn lao trong cơ thể [3, 20]

2.2.2.3 Hoạt tính kháng sinh

Vi sinh vật có thể gây bệnh theo hai cách sau: Một là chúng gây viêmbằng cách phá hủy các mô xung quanh Hai là vi khuẩn sinh ra các độc tố Cácnhà khoa học đã khẳng định Lentinan kích hoạt việc tăng sản xuất các yếu tốhuyết thanh khác nhau liên quan đến miễn dịch và sự gây viêm.

Sudirman et al (1996) đã kiểm tra khả nǎng kháng khuẩn của các chủngnấm shiitake trồng ở Indonesia, chống Rigidoporus lignosus (vi nấm gây mụctrắng cây cao su), Bacillus subtilis, [3].

Chihara [7] đã chứng minh khả năng của Lentinan trong kháng khuẩn,kháng virus, kháng nấm bệnh và ký sinh trùng Đặc biệt, Lentinan làm giảm

mạnh ảnh hưởng trong hóa trị liệu lao, chống bội nhiễm khuẩn ở các bệnh nhânHIV.

2.2.3 Ứng dụng của β-glucan

Ứng dụng của β-glucan trong thực phẩm: β-glucan trong tự nhiên rất

sạch, có khả năng giữ nước cao, không tạo gel, không bị phân hủy bởi enzymtiêu hóa ở người, vì vậy chúng thích hợp như một nguồn xơ thực phẩm Khi β-glucan đi qua ruột già, nó bị phân hủy một phần bởi hệ vi khuẩn ruột mà khônglàm mất tính giữ nước của chúng Quá trình lên men này tạo ra các chuỗi axítbéo ngắn (chủ yếu là acetat, propionat, butyrat) có lợi cho tế bào nhầy lót ruột.Dung tích giữ nước của β-glucan lớn hơn rất nhiều so với những chất xơ thựcvật và hạt khác Do đó, β-glucan được sử dụng làm phụ gia thực phẩm để tăngsự tiêu hóa và chữa rối loạn tiêu hóa [6]

Đặc biệt với hoạt tính sinh học cao β-glucan đang được ứng dụng nhiềutrong sản xuất thực phẩm chức năng.

Ứng dụng của glucan trong y dược: Nhiều nghiên cứu đã cho thấy

β-glucan có tác động lên hệ thống miễn dịch thông qua cơ chế kích thích đại thựcbào, nâng cao khả năng của đại thực bào hoặc tạo ra các chất trung gian hoạt hóaoxy và các nhân tố khác giết chết vật thể lạ Trên lâm sàng β-glucan được sửdụng trong hỗ trợ điều trị ung thư Đối với bệnh nhân ung thư phải điều trị bằnghóa chất hoặc chiếu xạ β-glucan có khả năng tăng nhanh sự phục hồi máu khichiếu xạ, kích thích sự phục hồi tủy xương sau hóa trị liệu và ngăn cản biếnchứng nhiễm bệnh trong quá trình điều trị Bên cạnh đó, β-glucan còn có hiệuquả kháng khối u, giảm kích cỡ khối u [6, 7].

Ứng dụng của β-glucan trong mỹ phẩm: β-1,3-glucan còn có khả năng

cảm ứng hoạt tính của tế bào Langerhans khi bôi lên da Tế bào Langerhans làmột loại tế bào đại thực bào chuyên hóa nằm trên da hoạt động tương tự như đại

thực bào β-1,3-glucan làm se lỗ chân lông, giảm số lượng, độ sâu, độ dài củanếp nhăn, cảm ứng tổng hợp collagen và elastin, giảm màu đỏ, giảm kích thíchvà sự khô da, giảm số lượng và kích cỡ tổn thương trên da β-1,3-glucan có thểthêm vào kem bôi da, mỹ phẩm thuốc mỡ, kem cạo râu và nói chung là các sảnphẩm tiếp xúc trực tiếp với da [6].

Ứng dụng của β-glucan trong nuôi trồng thủy sản: Tôm sú là mặt hàng

xuất khẩu chủ lực của nhiều nước châu Á, trong đó có Việt Nam Nhưng cácloại bệnh virus và vi khuẩn ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng tôm và dẫnđến ảnh hưởng tới kinh tế hộ nông dân nói riêng, kinh tế đất nước nói chung Cómột số nghiên cứu sử dụng β-glucan như một chất kích thích hệ thống miễn dịchtiềm năng trong nuôi trồng thủy sản [6]

Chang cheng-Fang và cs.(2000) đã nghiên cứu hiệu quả của β-1,3-glucan

lên sự sống sót của tôm sú lớn (Penaeus monodon) Tôm được bổ sung

β-1,3-glucan (2g/kg trọng lượng) trong 40 ngày Kết quả nhận được cho thấy lượngtôm sống sót trong lô có bổ sung β-1,3-glucan cao hơn hẳn (p<0,001) so với lôđối chứng [6]

Kết quả thí nghiệm của Rostad Gunnar và cs.(1995) cho thấy khi bổ sung

β-glucan vào thức ăn hàng ngày của cá hồi Atlantic (Salmo salar) với hàm

lượng 1g/kg thức ăn trong 12 tuần trước khi nhiễm nguồn bệnh, lượng cá sốngsót tăng lên rất nhiều [6].

2.2.4 β-glucan trong nấm Hương

Trong nấm Hương chứa một lượng β-glucan, tên là Lentinan Lentinan làmột β-glucan có chứa các liên kết glicozit β-1,3: β-1,6 Lentinan là mộtpolysaccarit không chứa nitơ, trọng lượng phân tử xấp xỉ 500 000 Da [14].Lentinan được chiết suất từ thể quả cũng như từ sinh khối sợi nấm.

Hình 2.3 Công thức cấu tạo Lentinan

Lentinan là hợp chất quan trọng của hệ sợi nấm Hương cũng như của thểquả nấm Lentinan tạo nên các tính chất dược lý của nấm Hương Các nhànghiên cứu đã ghi nhận rằng Lentinan có khả năng tăng cường các phản ứngmiễn dịch, có tính chất chống ung thư mạnh, có tác dụng chống virus, tínhkháng sinh [20,21].

Theo nghiên cứu của Manzi và Pizzoferrato (1999) về hàm lượng

β-glucan chứa trong một số loại nấm ăn thì trong nấm Hương (Lentinula edodes)lượng β-glucan khoảng 0,22g/100g chất khô, trong nấm Sò (Pleurotus ostreatus)là khoảng 0,30g/100g chất khô, trong nấm Sò vua (Pleurotus eryngii) là khoảng0,32g/100g chất khô, trong nấm Sò xám (Pleurotus pulmunarius) là khoảng

0,53g/100g chất khô Như vậy, hàm lượng β-glucan có trong các loại nấm ăndao động trong khoảng 0,22g – 0,53g/100g chất khô [19].

2.2.5 Các phương pháp tách chiết β-glucan

Bản chất β-glucan là một polysaccarit do đó các phương pháp tách chiếtβ-glucan cũng dựa trên nguyên lý chung tách chiết các polysaccrit Cơ bản có 2phương pháp tách chiết β-glucan là phương pháp hóa học và phương phápenzym.

- Phương pháp hóa học: thường sử dụng dung môi natri hydroxide(NaOH) hay kali hydroxide (KOH), hoặc natri hydro cacbonat (NaHCO3), hoặcnatri cacbonat (Na2CO3) để chiết β-glucan Sau đó tiến hành ly tâm thu hồi vàtinh chế Phương pháp hóa học thích hợp với các mẫu phân tích chứa lớn hơn20% glucan tổng số Theo nghiên cứu của Mỹ các phương pháp này đạt hiệusuất thu hồi 50-80%, quy trình đơn giản, không tốn kém tuy nhiên thời gian táchchiết lâu [24].

- Phương pháp enzym: sử dụng enzym 1,3-glucanase để tách chiết glucan sau đó tiến hành tinh chế Phương pháp enzym thích hợp với các mẫuphân tích có chứa hàm lượng β-glucan thấp Phương pháp này đạt hiệu suất thuhồi hơn 80%, thời gian tách chiết ngắn nhưng yêu cầu về thiết bị hiện đại, chiphí cao [17]

β-2.3 MỘT SỐ SẢN PHẨM THƯƠNG MẠI TỪ NẤM HƯƠNG

Ngoài sản phẩm nấm Hương tươi, hiện nay còn một số sản phẩm từ nấmphổ biến như sau:

- Thể quả thu hái tự nhiên được sấy khô, hoặc nghiền thành bột mịn rồiđóng viên con nhộng hay viên nén.

- Bột thể quả nấm nuôi trồng nhân tạo.

- Dịch chiết thu được do chiết nước nóng hay chiết bằng ethanol từ bột thểquả, dịch chiết cô đặc.

- Các chế phẩm sấy khô và nghiền mịn từ giá thể hỗn hợp gồm hệ sợinấm, giống nấm và môi trường rắn ăn được (thường là hạt).

- Sinh khối hoặc dịch chiết từ sinh khối sợi nấm hoặc từ môi trường lênmen.

- Chế phẩm LEM (Lentinula Edodes Mycelium): chiết suất từ hệ sợi nấmHương lên men giá thể bã mía LEM được tách chiết từ hệ sợi nấm, ở dạng bột.Trong 1 kg bột chứa 6-7g LEM.

- Chế phẩm LAP là dung dịch hệ sợi nấm Hương + 4 lần thể tích ethanol LAP ≈ 0,3g LEM.

Các sản phẩm trên được thấy phổ biến ở các nước có ngành công nghiệpnấm phát triển như Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Mỹ [4, 5].

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT NẤM HƯƠNG2.4.1 Tình hình ngoài nước

Nấm Hương được nuôi trồng nhân tạo tại Trung Quốc từ cách đây trên1000 năm tức là từ thời Bắc Tống (960 - 1127) Đầu thế kỷ XX nấm Hương đãđược nuôi trồng nhân tạo ở quy mô công nghiệp tại Nhật, Pháp, Mỹ Gần đâyNhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên là những nước trồng nhiều nấm Hương nhấttrên thế giới Tổng sản lượng hàng năm đạt trên 1 triệu tấn Sản phẩm nấm đượcsử dụng chủ yếu ở dạng tươi và sấy khô Các nước này còn phát triển sản xuấtsinh khối sợi nấm Hương và đang cung cấp cho thị trường trong và ngoài nướcmột số sản phẩm dạng bột và dạng lỏng rất có giá trị về dinh dưỡng và phòng trịbệnh

Đặc tính làm lành vết thương của nấm đã được biết đến từ hàng ngàn nămnay, với báo cáo đầu tiên về khả năng y học của chúng được đánh dấu khoảng3000 năm trước, mặc dù đặc tính này do một số thành phần khác nhau của nấmnhưng β-glucan lôi kéo sự chú ý hơn cả.

Năm 1969 các nhà khoa học Nhật Bản đã chứng minh rằng nấm Hươngcó chứa một loại polysaccarit tên là Lentinan Chất này có tác dụng nâng caotính miễn dịch của cơ thể và có tác dụng chống khối u [1] Người ta đã phát hiện

ra rằng hiệu lực kháng khối u của glucan là kêt quả kích thích tế bào miễn dịchchứ không phải là độc tính trực tiếp của glucan đối với tế bào khối u.

Từ đầu những năm 1970, một số viện nghiên cứu ở Nhật Bản đã thử táchchiết β-glucan từ nấm lớn và nó trở thành hướng nghiên cứu chính ở Nhật Bản.Trong 50 năm qua, rất nhiều nhà khoa học và viện nghiên cứu đã góp phần tolớn vào việc định loại tách chiết, định lượng, định tính các thành phần khácnhau của β-glucan Các nhà khoa học và các bác sỹ trong nhiều lĩnh vực ngàycàng chú ý hơn đến việc sử dụng β-glucan để giải quyết nhiều vấn đề liên quanđến đáp ứng miễn dịch [1]

Có rất nhiều nghiên cứu liên quan đến hoạt tính sinh học của β-glucannhưng kết quả đôi khi trái ngược nhau Điều này chủ yếu là do sử dụng β-glucancó trọng lượng phân tử khác nhau và sự thay đổi hóa học do β-glucan được nhậntừ các nguồn nấm khác nhau Hiệu quả miễn dịch của β-glucan phụ thuộc vàomức độ phân nhánh của phân tử, độ dài của polyme và cấu trúc bậc 3 của nó [6].

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-glucan có nhiều trong nấm như là nấmLinh Chi, nấm Sò, nấm Hương, nhiều nhất là trong thành tế bào nấm men bánhmỳ β-glucan trong yến mạch và lúa mạch có rất ít hoặc không có hoạt tính.Nhưng trong nước của yến mạch có thể giảm nguy cơ bệnh tim [6].

Do những giá trị dinh dưỡng và tác dụng phòng, chữa bệnh của nấmHương cũng như hệ sợi nấm Hương đem lại nên gần đây các nhà khoa học trênthế giới đang ngày càng chú ý đến việc nghiên cứu thu sinh khối sợi nấm, vìđiều kiện phát triển hệ sợi không yêu cầu khắt khe như nuôi lấy thể quả, thờigian nuôi cấy lại rút ngắn Đã có một số nghiên cứu trong và ngoài nước tậndụng phế phụ phẩm nông nghiệp và công nghiệp chế biến để làm giá thể nuôicấy nấm trên môi trường rắn và lỏng Điều này có ý nghĩa rất lớn vừa giảm thiểuđược ô nhiêm môi trường vừa tạo ra được thực phẩm.

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Từ lâu nấm Hương rất quen thuộc đối với người Việt Nam Tuy nhiênviệc ươm trồng loại nấm này ở nước ta vẫn chưa được phát triển nên phần lớnnấm được sử dụng ở dạng quả thể nấm khô nhập khẩu từ Trung Quốc Có thểtìm thấy nấm Hương dạng quả thể khô ở khắp các siêu thị ở nước ta, và có bántrên thị trường do nhu cầu sử dụng rộng rãi của người dân

Hiện nay có một số tỉnh trồng nấm Hương với quy mô nhỏ vì còn phùthuộc vào điều kiện thời tiết, nó chỉ hợp với với nhiệt độ vào mùa đông ở miềnBắc nước ta Một số tỉnh triển khai trồng nầm như: Cao Bằng, Hà Giang, LạngSơn, Lào Cai …

Các nghiên cứu liên quan đến công nghệ trồng nấm Hương từ trước đếnnay chủ yếu là dạng truyền thống tức là sử dụng giá thể rắn để trồng nấm thuquả thể Hiện nay chưa có một công bố kết quả nghiên cứu liên quan đến sảnxuất sinh khối sợi nấm Các nghiên cứu về tách chiết hoạt chất nấm cũng khôngnhiều, chủ yếu tập trung trên nấm dược liệu như nấm Linh Chi.

Năm 2000, Phòng Công nghệ sinh học và Kỹ thuật hạt nhân Đà LạtTrường Đại học Tây Nguyên đã công bố kết quả lên men dịch thể hệ sợi nấmHương Kết quả cho thấy có thể thu sinh khối thuần khiết với hiệu suất cao sau20-30 ngày nuôi cấy, tùy theo thể tích bình lên men và điểu kiện sục khí [3].Nghiên cứu đã mở ra hướng phát triển về nuôi cấy nấm trong môi trường lỏng.

Gần đây các nghiên cứu liên quan đến hoạt chất sinh học, sản xuất thựcphẩm chức năng đang ngày càng được quan tâm nhiều hơn Năm 2005 NguyễnThị Chính và CS đã tiến hành các nghiên cứu về công nghệ sản xuất nấm dượcliệu, bao gồm các nghiên cứu về nấm Hương như là nghiên cứu đặc tính sinh

học và công nghệ nuôi trồng nấm Hương, hoạt tính kháng sinh của Lentinula

edode Nghiên cứu gần đây về β-glucan là tách chiết β-glucan từ thành tế bào

nấm men của viện Công nghiệp Thực phẩm (2005) Điều này cho thấy nhu cầungày càng lớn về thực phẩm chức năng và hướng phát triển của nghành thựcphẩm chức năng trong tương lai.

2.5 NUÔI CẤY HỆ SỢI NẤM HƯƠNG TRONG MÔI TRƯỜNG LỎNG2.5.1 Phương pháp lên men chìm đối với vi sinh vật

Khái niệm: Là quá trình nhân nuôi vi sinh vật trong môi trường lỏng có

sục khí để bổ sung oxy hoặc nuôi tĩnh Giống vi sinh vật sau khi được cấy vàomôi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) rồichuyển sang phát triển trong pha lũy thừa (pha log) Ở giai đoạn này thành phầnmôi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu oxy tăng, nhiệt lượng tạo ra caođồng thời bề mặt môi trường tạo thành bọt và lớp bọt tăng dần đến khi nhiều cóthể trào ra khỏi bình lên men, làm mất bớt dịch và tăng khả năng nhiễm vi sinhvật lạ không mong muốn

Ưu điểm của phương pháp:

- Hiệu suất sử dụng không gian cao (ba chiều), lượng hoạt chất được sinhtổng hợp trên thể tích sử dụng cao, hiệu suất lên men cao.

- Vì quá trình lên men diễn ra trong lòng chất lỏng nên tránh được nhiễmkhuẩn

- Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu đáp ứng được nhu cầu sinh lýcủa vi sinh vật

- Các thiết bị cơ giới hóa và tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ítnhân công.

Tuy nhiên kỹ thuật lên men chìm đòi hỏi nhiều trang thiết bị kỹ thuật, cácthiết bị chịu áp lực và đòi hỏi đảm bảo vô trùng tuyệt đối

Các phương pháp lên men chìm

- Lên men gián đoạn:

Quá trình này còn gọi là lên men theo mẻ có hoạt động như là một hệthống đóng kín Sự phát triển vi sinh vật được phân chia thành 4 pha đặc thù:Pha lag (pha tiềm tàng), pha log (pha lũy thừa), pha dừng, và pha suy tàn.

Hình 2.4 Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật

(I- Pha lag, II- Pha log, III- Pha ổn định, IV- Pha suy tàn)- Lên men bổ sung:

Kỹ thuật lên men bổ sung ứng dụng thích hợp cho các trường hợp sau: - Nồng độ cơ chất khá thấp nhưng lại cần ổn định (lên men nấm

men)

- Nồng độ cơ chất cần khá cao và không đổi.- Phải bổ sung tiền chất liên tục

t |h|logx

x