2.5.1. Phương pháp lên men chìm đối với vi sinh vật
Khái niệm: Là quá trình nhân nuôi vi sinh vật trong môi trường lỏng có sục khí để bổ sung oxy hoặc nuôi tĩnh. Giống vi sinh vật sau khi được cấy vào môi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) rồi chuyển sang phát triển trong pha lũy thừa (pha log). Ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu oxy tăng, nhiệt lượng tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường tạo thành bọt và lớp bọt tăng dần đến khi nhiều có thể trào ra khỏi bình lên men, làm mất bớt dịch và tăng khả năng nhiễm vi sinh vật lạ không mong muốn. Ưu điểm của phương pháp:
- Hiệu suất sử dụng không gian cao (ba chiều), lượng hoạt chất được sinh tổng hợp trên thể tích sử dụng cao, hiệu suất lên men cao.
- Vì quá trình lên men diễn ra trong lòng chất lỏng nên tránh được nhiễm khuẩn.
- Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu đáp ứng được nhu cầu sinh lý của vi sinh vật.
- Các thiết bị cơ giới hóa và tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ít nhân công.
Tuy nhiên kỹ thuật lên men chìm đòi hỏi nhiều trang thiết bị kỹ thuật, các thiết bị chịu áp lực và đòi hỏi đảm bảo vô trùng tuyệt đối.
Các phương pháp lên men chìm
- Lên men gián đoạn:
Quá trình này còn gọi là lên men theo mẻ có hoạt động như là một hệ thống đóng kín. Sự phát triển vi sinh vật được phân chia thành 4 pha đặc thù: Pha lag (pha tiềm tàng), pha log (pha lũy thừa), pha dừng, và pha suy tàn.
Hình 2.4. Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật
(I- Pha lag, II- Pha log, III- Pha ổn định, IV- Pha suy tàn) - Lên men bổ sung:
Kỹ thuật lên men bổ sung ứng dụng thích hợp cho các trường hợp sau:
- Nồng độ cơ chất khá thấp nhưng lại cần ổn định (lên men nấm men).
- Nồng độ cơ chất cần khá cao và không đổi. - Phải bổ sung tiền chất liên tục.
I II III IV t |h| logxx
2.5.2. Môi trường nuôi cấy lỏng cho nấm Hương
Nuôi cấy nấm Hương trong môi trường lỏng cần chú ý tới nhu cầu dinh dưỡng như sau:
- Về nguồn cacbon, nấm Hương có thể đồng hóa rộng rãi nhiều nguồn cacbon khác nhau như đường đơn, đường kép, đường đa (như tinh bột, chất xơ, chất gỗ).
- Về nguồn nitơ, nấm Hương có thể sử dụng nitơ hữu cơ như protein, peptit, axit amin hay urê hoặc đạm vô cơ như các muối amôn. Nấm Hương không đồng hóa được nitơ trong nitrat, nitrit.
Tỷ lệ C:N trong môi trường ở giai đoạn nuôi sợi nên dùng tỷ lệ 25-40:1. Nhưng tỷ lệ C:N tối ưu cho sự phát triển của hệ sợi nấm là 30:1. Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Rossi và CS khi sử dụng môi trường rỉ đường thì tỷ lệ C:N là 107:1, còn khi bổ sung thêm 40% cám gạo thì tỷ lệ C:N là 38:1. Theo nghiên cứu này bổ sung cám gạo vào môi trường đến một lượng nhất định thu được kết quả tỷ lệ C:N phù hợp nhất là 30:1 cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương [18].
- Về nhu cầu nguyên tố khoáng, ngoài Mg, S, P, K nấm hương còn cần một số nguyên tố khoáng vi lượng như Fe, Zn, Mn…Mỗi lít dung dịch nuôi cấy nên bổ sung thêm khoảng 2mg đối với từng loại Fe, Zn, Mn. Khi nuôi trồng nấm Hương cần lưu ý bổ sung vitamin B1. Các vitamin khác nấm Hương đều có thể tự tổng hợp. Trong 1 lít môi trường nuôi cấy cần bổ sung 100μl vitamin B1. Một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật như gibberellin (GA3), axit indolaxetic (IAA), kinetin (KT)…cũng có tác dụng xúc tiến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương [1].
Các môi trường nuôi cấy để nuôi hệ sợi cũng phải có đầy đủ nguồn cácbon, nitơ, chất khoáng… đáp ứng cho nhu cầu phát triển của hệ sợi nấm Hương.
2.5.3. Ảnh hưởng của chủng giống
Theo một số kết quả nghiên cứu thấy rằng cùng một loài nấm Hương, nhưng các chủng giống nấm khác nhau tốc độ phát triển của chúng cũng khác nhau. Mata và CS khi nuôi cấy 11 chủng giống nấm Hương trên đĩa Petri với môi trường MEA đã thu nhận được đường kính sợi nấm dao động từ 4,9 đến 7,1cm. Chủng Q616 có đường kính phát triển thấp nhất là 4,9cm, chủng M115 và V084 có đường kính phát triển lớn nhất sau 7 ngày nuôi cấy. Các chủng còn lại có đường kính từ 5,9cm đến 6,8cm [8]. Theo nghiên cứu của De Carvalho thì đường kính phát triển của 2 chủng Lentinula edodes em BDA và Lentinula edodes em SDA trên môi trường thạch là khác nhau. Sau 10 ngày, kết quả đo đường kính phát triển của chúng tương ứng là 9,2cm và 4,5cm [13]. Như vậy các chủng nấm Hương khác nhau thì tốc độ phát triển khác nhau, sinh khối thu được cũng khác nhau và hàm lượng β-glucan chứa trong nó cũng khác nhau.
2.5.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng đối với nấm Hương
Nồng độ ôxy: Nấm Hương thuộc nhóm nấm hoại sinh và hiếu khí, vì vậy trong quá trình nuôi hệ sợi nấm Hương nên bổ sung ôxy bằng thiết bị lắc, khuấy hay sục khí.
Theo nghiên cứu của Hassegawa trong môi trường nuôi cấy lỏng với sự cung cấp ôxy thông qua chế độ nuôi có lắc và không lắc (nuôi tĩnh) sử dụng môi trường YEM ở nhiệt độ 25oC. Khi nuôi cấy tĩnh chỉ thu được hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm Hương tối đa là 4mg/ml. Trong khi nuôi cấy có lắc với tốc độ 150 vòng/phút thì hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm Hương tăng lên 5mg/ml [9].
Nhiệt độ môi trường: Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương. Sợi nấm phát triển ở dải nhiệt độ từ 5 đến 35oC nhưng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 20 đến 25oC. Đây là nhiệt độ phù hợp với điều kiện khí hậu ở nhiều vùng của nước ta. Còn dưới nhiệt độ 10oC và trên nhiệt độ 32oC
sự sinh trưởng của hệ sợi nấm bị hạn chế. Đến nhiệt độ 35oC sợi nấm bắt đầu ngừng phát triển [1].
Độ pH môi trường: Trong nuôi cấy lỏng, theo nghiên cứu của Hassegawa và CS thì pH tối ưu cho sợi nấm Hương phát triển trên môi trường dung dịch là 4,5 [9].
Cường độ ánh sáng: Ánh sáng không ảnh hưởng nhiều đến quá trình phát triển hệ sợi. Khi nuôi trên môi trường thạch đĩa, thường nuôi ở trong tủ ấm, không có ánh sáng, hệ sợi nấm Hương vẫn phát triển tốt. Đối với nuôi cấy môi trường lỏng (trong thiết bị lên men) thì thường sử dụng nuôi ở ánh sáng phòng hay trong tối [22].
Phần III
ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng nấm Hương nghiên cứu đều do Viện Di truyền nông nghiệp cung cấp.
1. Chủng nấm Hương Ld có nguồn gốc xuất xứ từ Ý.
2. Chủng nấm Hương Lg có nguồn gốc xuất xứ từ Trung Quốc. 3. Chủng nấm Hương Lc có nguồn gốc xuất xứ từ Cao Bằng.
3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất tiến hành
` a) Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
- Cân phân tích.
- Máy quang phổ tử ngoại – khả biến U-1800 của Nhật Bản. - Máy ly tâm HERMLE Z300 của Đức.
- Máy lắc ORBIT 1900 của Nhật Bản. - Tủ cấy vi sinh vật.
- Tủ sấy mẫu.
- Tủ ấm nuôi cấy vi sinh vật.
- Dụng cụ thủy tinh các loại: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác 250ml, ống đong, phễu, cốc, đũa thủy tinh, Micropipet loại 1 ml và 0,2ml.
- Các dụng cụ khác như bông thấm nước, bông không thấm nước, đèn cồn, giấy báo, nồi nấu, dao thái, giấy đo pH, thang đo pH.
b) Hóa chất nghiên cứu
- Hóa chất bổ sung môi trường: axít lactic, đường glucose, cám gạo,.... - Hóa chất phân tích β-glucan: D-glucose tinh khiết, phenol, axít sulfuric 96%, cồn 96o.
c) Môi trường nuôi cấy
- Môi trường thạch PDA: 200g khoai tây, 20g glucose, 20g agar. Tính cho 1 lít.
- Môi trường lỏng PDR: 200g khoai tây, 20g glucose, 25g cám gạo. Tính cho 1 lít.
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm - Trung tâm Nghiên cứu và Kiểm tra chất luợng nông sản thực phẩm - Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch.
Địa chỉ: Số 4 - Ngô Quyền - Hà Nội.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu so sánh sự phát triển sinh khối của một số chủng nấm Hương trên môi trường thạch PDA.
- Nghiên cứu so sánh sự phát triển sinh khối của một số chủng nấm Hương trong môi trường lỏng PDR.
- Xác định và so sánh hàm lượng β-glucan trong sinh khối sợi nấm ở một số chủng nấm Hương phát triển trong môi trường nuôi cấy lỏng.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.3.1.1. Thí nghiệm nghiên cứu so sánh khả năng phát triển của các chủng nấm Hương khác nhau trên môi trường thạch PDA
Tiến hành nuôi cấy các chủng nấm Hương khác nhau trên môi trường thạch PDA, pH trong khoảng 5, nhiệt độ môi trường nuôi cấy trong tủ ấm là 25oC. Sau đó, xác định đường kính phát triển hệ sợi nấm của các chủng giống sau từ 3 đến 9 ngày nuôi cấy. Từ kết quả thu được đánh giá tốc độ phát triển của các chủng nấm Hương trên môi trường thạch đĩa để kết luận chủng giống nào phát triển tốt nhất trên môi trường rắn làm cơ sở cho sự nghiên cứu phát triển của các chủng giống này trong môi trường nuôi cấy lỏng tiếp theo.
Nhân và làm sạch giống trên đĩa thạch: Tiến hành nhân giống trên đĩa thạch từ ống giống. Chuẩn bị 5 đĩa/giống x 3 giống = 15 đĩa.
So sánh theo sinh khối trên đĩa thạch: Sau khi nhân giống 10 ngày, tiến hành nghiên cứu so sánh khả năng phát triển của 3 chủng nấm Hương trên môi trường thạch PDA thông qua đo đường kính hệ sợi nấm. Chuẩn bị 5 đĩa/giống x 3 giống = 15 đĩa.
3.3.1.2. Thí nghiệm nghiên cứu so sánh khả năng phát triển sinh khối của các chủng nấm Hương trong môi trường lỏng PDR
Tiến hành cấy chuyển từ các đĩa thạch đã được bảo quản ở 5oC sau 10 ngày nhân giống như đã nêu ở mục 3.3.1.1 sang môi trường lỏng PDR. Chuẩn bị 5 bình/giống x 3 giống = 15 bình. Nuôi cấy ở cùng điều kiện của môi trường phòng thí nghiệm (20 - 30oC), pH trong khoảng 4 - 5, tốc độ lắc 120 vòng/phút (lắc 8 giờ/ngày chia làm 2 lần). Lấy mẫu để xác định khối lượng sinh khối khô vào ngày 22. Kết quả cần xác định là khả năng phát triển sinh khối của các
chủng giống để xem chủng nào có khả năng phát triển tốt nhất trong môi trường lỏng.
3.3.1.3. Thí nghiệm phân tích hàm lượng β-glucan trong sinh khối ở các chủng nấm Hương
Để đánh giá hàm lượng β-glucan trong sinh khối sợi của 3 chủng nấm Hương Ld, Lg, Lc tiến hành thu sinh khối sợi nấm khô từ 3 chủng ở mục 3.3.1.2 và phân tích hàm lượng β-glucan trong sinh khối. Số lượng mẫu bố trí là 3 giống x 3 lần lặp = 9 mẫu phân tích. Từ kết quả thu được đánh giá chủng nấm nào cho hàm lượng β-glucan cao nhất.
3.3.2. Phương pháp chuẩn bị môi trường
3.3.2.1. Phương pháp chuẩn bị môi trường thạch đĩa PDA
Chuẩn bị khoai tây (đã gọt vỏ, cắt nhỏ) 200g + 20g glucose + 20g thạch agar và nước cho đủ 1 lít.
Khoai tây (đã gọt vỏ, cắt nhỏ) 200g đun sôi đến chín kỹ rồi lọc qua vải lọc 2 lần. Sau đó mới thêm 20g glucose + 20g thạch agar, bổ sung cho đủ 1 lít rồi đun cho tan thạch. Điều chỉnh pH trong khoảng 5 bằng axít lactic. Phân vào các bình tam giác, đậy nút bông rồi hấp khử trùng ở điều kiện nhiệt độ 121oC, áp suất 1at trong 20 phút. Sau khi khử trùng môi trường để nguội xuống khoảng 50oC tiến hành đổ vào đĩa Petri vô trùng khoảng 20ml/đĩa (ф 9) rồi dùng tay xoay tròn cho môi trường dàn đều trong đĩa. Sau đó đậy nắp để thạch đông thì lật ngược lại cho vào tủ ấp. Sau 2 ngày kiểm tra đĩa thạch nào bị nhiễm mốc xanh hay đen thì loại bỏ. Các đĩa sử dụng phải vô trùng mới mang đi cấy giống nấm.
3.1.2.2. Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy lỏng PDR
Môi trường PDR (200g khoai tây, 20g glucose, 25g cám gạo. Tính cho 1 lít): Khoai tây gọt vỏ cắt nhỏ được 200g định mức 1 lít nước đem đun chín kỹ
rồi bổ sung 25g cám gạo vào và khuấy đều. Đem lọc qua vải lọc 2 lần rồi lọc tiếp bằng vải lọc malt 2 lần. Sau đó định lượng đến 1 lít, bổ sung 20g đường glucose. Đun nóng cho tan đường rồi điều chỉnh pH đến khoảng 4 - 5. Phân vào các bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình 100 ml rồi tiệt trùng ở 121oC, áp suất 1at trong 30 phút.
3.3.3. Phương pháp nuôi cấy 3.3.3.1. Phương pháp đặt thạch
Thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Dùng que cấy móc, khử trùng bằng dung dịch cồn 70oC và hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Khi móc nguội dùng lấy sợi nấm trong ống nghiệm giống gốc rồi chấm vào 3 điểm trên đĩa thạch. Sau đó lật ngược lại nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 25oC. Sau 10 ngày khi sợi nấm phát triển rộng thì tiến hành đục lỗ thạch (nơi có sợi nấm phát triển) bằng cái đục tròn rỗng có đường kính 5mm. Dùng kẹp đã khử trùng gắp mảng thạch đường kính 5mm đó đặt vào tâm đĩa thạch khác và tiếp tục nuôi ở nhiệt độ 25oC trong tủ ấm. Theo dõi sự phát triển thông qua đo đường kính của hệ sợi nấm.
3.3.3.2. Phương pháp nhân nuôi chủng nấm Hương trong môi trường lỏng
Cấy chuyển sang môi trường lỏng:Tiến hành trong tủ cấy vô trùng, đục lỗ thạch bằng dụng cụ đục lỗ có đường kính 5mm như đã nêu ở mục 3.3.3.1, gắp cho vào mỗi bình 5 miếng thạch. Đậy nút bông và đặt trên máy lắc. Nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc 120 vòng/phút (8h/ngày), trong 22 ngày.
3.3.4. Phương pháp xác định lượng sinh khối tươi và khô
Sử dụng loại giấy lọc có đường kính 9mm, sấy vải lọc ở nhiệt độ 120oC trong thời gian 4h. Sau đó để nguội trong bình hút ầm có silicagel. Cân các giấy lọc để biết khối lượng của chúng. Dùng các giấy lọc đó để lọc sinh khối từ các bình tam giác sau khi nuôi cấy. Dùng phễu để đỡ tờ giấy lọc. Sau khi chảy hết môi trường qua giấy lọc sẽ đem sấy sinh khối cùng giấy lọc. Sấy ở nhiệt độ 60oC
trong 18h rồi đem để nguội trong bình hút ẩm trước khi cân. Tính toán khối lượng sinh khối khô thông qua chênh lệch khối lượng. Lượng sinh khối được tính theo mg trên 1 ml môi trường. Giá trị trung bình được tính từ 5 mẫu song song.
3.3.5. Phương pháp phân tích hàm lượng β-glucan
Theo nghiên cứu của Manzi và Pizzoferrato hàm lượng β-glucan trong nấm Hương khoảng 0,22g/100g chất khô [19]. Như vậy, để tách chiết và phân tích được lượng β-glucan trong nấm Hương là rất khó, yêu cầu thiết bị hiện đại. Mặt khác theo nghiên cứu ở Mỹ hàm lượng glucan tổng số tách chiết từ thành tế bào nấm men bánh mỳ thu được là 80%, trong đó β-glucan chiếm khoảng 50% [6]. Như vậy, để đánh gía hàm lượng β-glucan hoàn toàn có thể tiến hành thông qua đánh giá hàm lượng glucan tổng số.
3.3.5.1. Chiết xuất β-glucan từ sinh khối sợi nấm khô
Sử dụng sinh khối sợi nấm khô thu được từ thí nghiệm ở mục 3.3.1.2 tiến hành phân tích xác định hàm lượng glucan ở các chủng nấm Hương. Cân 100 mg sinh khối khô và 10 ml nước cất đem hấp ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1at trong 15 phút. Sau đó ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút. Lọc qua giấy lọc whatman. Dịch lọc thu được pha trộn với 4 lần ethanol 96%, lắc mạnh và để qua đêm ở 4 oC. Sau đó ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút. Phần nổi