Nghiên cứu sự phát triển của hệ sợi nấm Hương (Lentinula edodes) trong môi trường nuôi cấy lỏng

Nghiên cứu sự phát triển của hệ sợi nấm Hương (Lentinula edodes) trong môi trường nuôi cấy lỏng

LEM is a product of SUN LEM co., Ltd (former Noda Shokukin Co.,Ltd.) It is a brownish spray-dried powder of the hot-water extract of amycelial culture of the Japanese edible mushroom, Lentinus edodes(shiitake) LEM contains water soluble metabolites together with

components originating from both the autolyzed mycelia and enzymaticallydegraded constituents of the culture medium.

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cùng với xu hướng phát triển của xã hội thì nhu cầu về thực phẩm cũngngày càng tăng cao về số lượng và chất lượng Trong khẩu phần ăn hàng ngàycần phải có các loại thực phẩm có thể cung cấp đẩy đủ dinh dưỡng đa lượngvà vi lượng cho nhu cầu hoạt động và phát triển của cơ thể Bên cạnh nguồndinh dưỡng từ ngũ cốc thì rau và thịt thường không thể thiếu vì chúng cungcấp các loại vitamin và khoáng chất cho cơ thể Trong dinh dưỡng hiện đại,thực phẩm chức năng hiện đang trở thành một ngành khoa học và côngnghiệp được tất cả các nước quan tâm Thực phẩm chức năng trước hết làthực phẩm, nhưng có thêm tính chất phòng và chữa bệnh Nấm ăn là một loạithực phẩm được biết từ lâu đời và ngày nay được xếp vào nguồn cung cấpthực phẩm chức năng của nhiều quốc gia Trong các loại nấm thì nấm Hương

(Lentinula edodes) là một loại thực phẩm vừa là rau vừa là thịt có giá trị dinh

dưỡng cao Hơn nữa nó có khả năng phòng và chữa bệnh Từ xa xưa, cácnước Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc…đã biết trồng và sử dụng nấmHương để làm thực phẩm cũng như dược phẩm Tuy nhiên ngày nay các nướckhu vực Đông Nam Á nói riêng và toàn thế giới nói chung đang sử dụng nấmHương làm thực phẩm đồng thời nghiên cứu các công nghệ sản xuất và chếbiến các sản phẩm có hoạt tính sinh học cao dùng để phòng và chữa bệnh chonhân loại

Vì nấm Hương có giá trị dinh dưỡng và hoạt tính dược lý cao, nên cácnhà nghiên cứu không ngừng tìm hiểu và nghiên cứu về nó Theo nhiều kếtquả nghiên cứu thì nấm Hương dùng làm thực phẩm ở dạng quả thể, nhưng hệ

sợi cũng chứa đầy đủ về số lượng và chất lượng các hoạt tính sinh học, dinhdưỡng và hương vị tương tự như quả thể [15] Việc nuôi cấy hệ sợi nấm lớntrên giá thể rắn là kỹ thuật phổ biến trong trồng nấm lấy quả thể Mặt kháchoàn toàn có thể sử dụng phương pháp nuôi cấy trong môi trường lỏng như đãrất phổ biến đối với các loại nấm mốc và vi khuẩn Nuôi cấy lấy hệ sợi nấmHương rút ngắn được thời gian, không đòi hòi khắt khe về điều kiện nhiệt độnhư nuôi trồng lấy quả thể, vì nuôi trồng lấy quả thể phụ thuộc vào điều kiệnthời tiết Do yều cầu về nhiệt độ thấp khi hình thành và phát triển quả thể nênlà bất lợi lớn nhất trong sản xuất nấm Hương ở nước ta Trên thực tế chỉ mộtsố tỉnh vùng cao miền núi phía bắc mới có thể trồng được nấm Hương, nhưngkhối lượng hàng năm rất thấp Trong khi nuôi nấm Hương lấy sinh khối sợithì Việt Nam lại có điều kiện khí hậu phù hợp trên địa bàn khắp cả nước

Hiện nay trên thế giới việc nghiên cứu sự phát triển của các loại nấmthực phẩm (nấm Bào ngư, nấm Hương…) hay nấm thuốc (nấm Linh Chi)trong môi trường lỏng rất phổ biến phục vụ hai mục đích khác nhau là: 1-Làm giống nấm cho nuôi trồng lấy quả thể qui mô tập trung kiểu công nhiệp;2- Thu sinh khối sợi nấm hoặc thu hoạt chất nấm trong môi trường Như vậy,với mục đích sử dụng nào đối với nấm hương thì việc khảo sát sự phát triểntrong môi trường lỏng cũng là khâu đầu tiên rất cần thiết và quan trọng để tạotiền đề cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo Chính vì vậy, trong khuôn

khổ khoá luận tốt nghiệp này, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên

cứu sự phát triển của hệ sợi nấm Hương (Lentinula edodes) trong môi

trường nuôi cấy lỏng” 1.2 Mục đích và Yêu cầu1.2.1 Mục đích

Thu sinh khối sợi nấm Hương qua quá trình nuôi cấy trên môi trường lỏng

1.2.2 Yêu cầu

- Lựa chọn chủng giống nấm tốt

- Phải nắm bắt được các thao tác thực hiện nuôi cấy chủng nấm Hương trongmôi trường rắn và lỏng trên quy mô phòng thí nghiệm (đúng thao tác, khửtrùng, tiệt trùng đúng cách).

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương

trong môi trường nuôi cấy lỏng và xác định được các thông số tối ưu cho sựphát triển của hệ sợi nấm.

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về nấm Hương và hệ sợi nấm Hương 2.1.1 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của nấm Hương

Nấm Hương (Đông cô, Hương cô, Shiitake) có tên khoa học làlentiluna edodes Nấm Hương thuộc họ Tricholomataceae, bộ Agaricaless, lớpphụ Hymenomycetidae, lớp Holobasidiomycetes (hoặc Homobasidio-myceteshay Eubasidiomycetes), ngành phụ Basidiomycotina, ngành Nấm thật –Eumycota, giới Nấm – Myconta hay Fungi.

Nấm Hương thuộc nhóm nấm hoại sinh, thuộc nhóm nấm mọc trên gỗ.Nấm Hương có dạng như cái ô, mũ nấm có đường kính 4-10 cm, màu nâunhạt, khi chín chuyển thành nâu sậm Lúc đầu mũ nấm có dạng nón nhọn ởgiữa, sau trải rộng ra và bằng phẳng Viền của mũ thường cuộn vào trong.Mặt ngoài có màu nâu đến đen và rải rác những vẩy trắng Phiến có màutrắng, nhưng nếu bị dập hay già biến thành màu nâu Bề ngang của phiếntương đối rộng và có khuynh hướng bám vào cuống nấm Mặt trên tai nấmmàu nâu, mặt dưới có nhiều bản mỏng xếp lại Trên mặt nấm có những vảynhỏ màu trắng Thịt nấm màu trắng, cuống hình trụ [3].

Chu trình sống bắt đầu từ đảm bào tử nảy mầm cho hệ sợi sơ cấp Haisợi sơ cấp khác phải phối hợp cho hệ sợi thứ cấp Hệ sợi thứ cấp phát triểnthành mạng hệ sợi Trong điều kiện thuận lợi mạng hệ sợi sẽ kết hạch tạo tiềnquả thể (nụ nấm) Nụ nấm tiếp tục lớn dần cho tai nấm trưởng thành, cácphiến dưới mũ mang các đảm và sinh ra bào tử Đảm bào tử được phóng thíchvà chu trình lại tiếp tục.

Ngoài nhu cầu nguồn hydrat carbon, nấm Hương còn cần đến nitơ.Đạm thích hợp cho nấm chủ yếu ở dạng hữu cơ như: pepton, axit amin, urê vànhiều loại muối amôni Nấm không thể sử dụng đạm vô cơ như nitrat haynitrit Nồng độ thích hợp cho sự tăng trưởng của hệ sợi cũng tùy thuộc vànguồn đạm cung cấp như: Sulfat ammon 0,03%; Tartrat ammon 0,06%

Sự hình thành quả thể cũng cần có đường và đạm nhưng khi nồng độđạm cao hơn 0,02% như với sulfat ammon sẽ ức chế sự phát triển của nấm.Ngược lại, để nụ nấm tiếp tục phát triển thành tai trưởng thành, nghĩa là sảnlượng tăng thì nồng độ đường phải cao, tối thiểu là 8% với đường saccharose

Nhu cầu dinh dưỡng khoáng của nấm Hương như: Mn, Fe, Zn cần2mg/l Ngoài ra còn cần Mg, S, K, P để thúc đẩy sự tăng trưởng của nấm Đểsợi nấm phát triển tốt nhất cần bổ sung thêm vitamin B1 với lượng 100µg/lGiá trị pH tối ưu cho sợi nấm phát triển trong môi trường lỏng là 4,8, trên mạtcưa là 4,5 Ở pH 8, nấm mọc rất chậm [2].

Nấm Hương mọc tự nhiên nhiều Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc,Đài Loan Chúng sống trên nhiều loại gỗ như gỗ shii, gỗ sồi, hạt dẻ, gỗ thích.Nấm Hương sống ở nhiệt độ ẩm, ưa ẩm Nhiệt độ quả thể nấm hình thành vàphát triển khoảng 15-160C [12].

Các thông số môi trường quan trọng cho sự phát triển của nấm Hươngnhư sau [9,10]:

 Nhiệt độ sợi nấm phát triển tốt nhất là 24-260C  Độ ẩm cơ chất: 65-70%

 Độ ẩm không khí: ≥ 80%  Độ pH trung tính

 Ánh sáng không cần thiết trong giai đoạn sợi nấm phát triển Giai đoạnhình thành quả thể cần ánh sáng khuếch tán

 Độ thông thoáng trung bình.

2.1.2 Giai đoạn phát triển của hệ sợi nấm Hương

Chu trình sống của nấm Hương bắt đầu tử bào tử đảm nảy mầm cho hệsợi nấm Hương, sợi nấm lúc đầu nhỏ khoảng 1,5-1,0 mm đường kính, về saulớn dần lên đến kích thước đường kính 1,0-2,0 mm Sau quá trình tiếp hợpgiữa hai sợi nấm sơ cấp đơn nhân sẽ hình thành nên các sợi nấm thứ cấp songnhân Các sợi nấm tăng trưởng theo kiểu tạo ra các móc (clamp) và để lại dấuvết giữa các tế bào Khi gặp điều kiện bất lợi các sợi nấm song nhân có thểtạo ra các bào tử màng dày (bào tử áo – chlamydospore) giúp sợi nấm sốngsót qua các trường hợp bất lợi này Bào tử màng dày khi điều kiện thuận lợi sẽnảy mầm tạo ra những sợi nấm mới Khi sợi nấm thứ cấp đã phát triển dàyđặc trên cơ chất sẽ bắt đầu quá trình phân hóa để tạo ra quả thể Trước khi raquả thể thì hệ sợi nấm Hương này phát triển sinh khối đến mức tối đa chuẩnbị cho quá trình ra quả thể Nhưng điều đặc biệt là trong hệ sợi nấm Hương cóđẩy đủ về về lượng cũng như về chất giống như quả thể, nó có thể phòng vàchữa bệnh cho người Được sử dụng như một món ăn hay một chế phẩm sinhhọc

Hình 2.1 Nấm Hương

Trong giai đoạn phát triển hệ sợi, nấm cần các nguồn dinh dưỡng môitrường đảm bảo các nguồn cung cấp về các bon, nitơ và khoáng [3].

2.1.3 Giá trị dinh dưỡng của nấm Hương cũng như hệ sợi nấm

Nấm Hương có giá trị dinh dưỡng cao, sử dụng nấm Hương làm raunhư một thực phẩm cung cấp vitamin (như vitamin B1,B2, vitamin PP,vitamin D2…) chất khoáng (Fe, Mn, K, Ca, Mg, Cd, Cu, P và Zn) cho cơ thể.Đặc biệt trong hệ sợi nấm Hương cũng đầy đủ các vitamin và khoáng chấtnhư ở quả thể, có thể bổ sung dinh dưỡng cho con người

Các chất tạo nên hương thơm: xetôn, sunfit, ankan, axit béo…TheoMizuno yếu tố tạo nên hương thơm, vị ngon của nấm là monosodiumglutamate, nucleotit, amino axit tự do, chuỗi peptit, axit hữu cơ (axit malic,axít fumalic, axít glutaric, axít oxalic, axít lactic,… ) và đường [2, 12].

Hơn nữa trong nấm Hương và hệ sợi nấm Hương có tới 40 loạienzyme, đáng chú ý nhất là các enzyme β (1-3) glucozidaza, kitinaza,esteraza, lipoidaza, ligninaza, almondaza, pepsin, loxintinaza, tannaza,pectinaza, saccaraza, transferaza, maltaza, xenlulaza, hemixenlulaza,amylotransferaza, inulaza, melibiaza, glycozidaza, ureaza, insulinaza,asparaginaza, peroxydaza, lactaza, carboxylpeptidaza, tyrozin oxydaza,zymaza, lichen amylaza, chymosin, metalloproteaza…[12].

2.2 Tính chất dược học của nấm Hương và hệ sợi nấm Hương 2.2.1 Các hoạt chất tách chiết từ hệ sợi nấm Hương

a) Chế phẩm LEM (Lentinula Edodes Mycelium): Chiết xuất từ hệ sợinấm Hương lên men trên giá thể bã mía được coi là một thành công lớn củaNhật Bản và Trung Quốc LEM rất giàu Lentinan - hoạt chất quan trọng nhấtcủa nấm Hương, nó có thể được chiết xuất từ quả thể cũng như từ sinh khốisợi nấm, là chất chính tạo nên tác dụng dược lý của nấm Hương

LEM được tách chiết từ hệ sợi nấm Hương ở dạng bột Hệ sợi của Lentinulaedodes (LEM) Trong 1 kg bột chứa 6-7g LEM.

b) LAP là chế phẩm được tách chiết từ hệ sợi nấm Hương Dung dịchhệ sợi nấm Hương + 4 lần thể tích ethanol được gọi là LAP LAP ≈0,3g LEMHệ sợi nấm Lentinula edodes và LAP là glycoprotein bao gồm đườngglucose, galactose, xylose, arabinose, manoza, fructozo LEM và LAP cũngchứa các dẫn xuất của axít nucleic và vitamin B (như B1, B2) và ergosterol.Tạo nên giá trị dinh dưỡng và tính dược lý của hệ sợi nấm Hương

Năm 1990, EP3 đã thu được từ LEM Là cơ chất hoạt hóa miễn dịchbao gồm nhiều nhóm cacboxyl Chính vì vậy LEM và LAP kích thích hoạthóa hệ thống miễn dịch chống lại bệnh tật

c) Hệ sợi nấm Hương ở dạng bột: Sinh khối sợi nấm Hương chế biến vàbổ sung thành thực phẩm bổ dưỡng ở dạng bột Dạng bột ăn liền này có thể sửdụng thuận tiện như bột canh hoặc pha với nước sôi trước khi sử dụng Có thểtìm thấy sản phẩm kiểu này trong các siêu thị ở Nhật Bản [12].

2.2.2 Tính chất dược học

Hệ sợi nấm Hương chứa một loại polysaccarit tên là Lentinan - hoạt chấtquạn trọng nhất của hệ sợi nấm Hương cũng như của quả thể nấm, mà nó đãtạo nên tính dược lý cho nấm Hương

Lentinan được chiết xuất từ sinh khối sợi nấm Hương và là thành phầnchính của hệ sợi Năm 1969 các nhà khoa học Nhật Bản đã chứng minh rằnglentinan là một loại polysaccarit – công thức nguyên là (C6H5O)n như các loạitinh bột khác, nhưng có trọng lượng phân tử là 5x1015

Ngoài ra còn có maunose peptit KS –Z với trọng lượng phân tử khoảng6-9,5x104, glycoprotein (hiệu quả chống HIV còn mạnh hơn cả so với thuốcAZT), chất eritadenine (làm giảm colestêrin trong máu) [12].

Sử dụng nấm Hương cũng như hệ sợi nấm Hương để phòng và chữabệnh:

Hoạt tính chống ung thư: Lentinan trong nấm Hương đã được chấp

nhận như một liệu pháp phụ trợ trong tiến trình dùng hóa trị liệu Nó có khả

năng kích thích tết bào của hệ miễn dịch làm tăng sức đề kháng Nó cũng kíchthích các tế bào “sát thủ tự nhiên” trong cơ thể để chúng tấn công những tếbào ung thư Nó còn có tác dụng chống virus viêm gan B Các thử nghiệmcũng cho thấy, chất lentinan đơn độc không có tác dụng gì đối với HIV,nhưng nếu kết hợp với AZT thì tác dụng diệt virus tăng lên 24 lần so với dùngAZT đơn độc Lentinan còn có khả năng giúp những người bị lao phổi chốnglại độc tố của vi khuẩn lao Đặc biệt khi bệnh nhân trị liệu bằng lentinan thìtăng được thời gian sống sót cho bệnh nhân.

Hoạt tính kháng sinh: Chihara [16] đã chứng minh khả năng của

Lentinan trong kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm bệnh và ký sinh trùng.Đặc biệt, Lentinan làm giảm mạnh sự suy sụp khi trị liệu hóa chất cho chuộtgây lao phổi thực nghiệp, chống lại sự xâm nhiễm của virus viêm não, virus

Abelson, Schistosoma mansoni và Schistosoma japonicum, chống bội nhiễm

khuẩn ở các bệnh nhân AIDS Do Lentinan có khả năng làm tăng đề khángcủa vật chủ khỏi sự tấn công của virus ung thư và virus lạ

Hoạt động ngoại trừ chlosterol: Nấm Hương có thể làm giảm

chlosterol trong máu do có chứa chất Eritidenin Chất Eritidenin (Lentysin,Lentinacin) được Mizuno xác định trong quả thể nấm Hương nuôi trồng [17,18] Chất này về sau lại được Lelik và CS xác định trong sinh khối sợi lênmen công nghiệp và đã được chứng minh là có khả năng làm giảm mứccholesrol và các lipid trung tính trong máu [19] Chính vì vậy nấm Hương cóhiệu quả đối với tim mạch Bởi hầu hết các bệnh nhân mắc bệnh về tim mạchdo hàm lượng chlosterol trong máu cao.

Hoạt tính chống virus, vi khuẩn và ký sinh: Lentinan và dẫn xuất của

nó có tác dụng chống lại vi khuẩn, virus (kể cả virus AIDS) và nhiễm ký sinh

trùng Trong nghiên cứu in vitro cho thấy Lentinan khi được sử dụng cùng với

hợp chất AZT (azido-Thymidine) có thể ngăn chặn virus làm giảm miễn dịchở người (virus HIV) trên tế bào T hơn là chỉ sử dụng AZT đơn độc [20].

Chế phẩm LEM (Lentinula edodes Mycelium) chiết xuất từ hệ sợi nấmHương lên men trên giá thể bã mía được coi là một thành công lớn của NhậtBản và Trung Quốc

Khắp thế giới, nhất là Châu Á đều thích nấm Hương Nó có giá thànhcao chủ yếu do có giá trị cao về dinh dưỡng và “thực phẩm chức năng”,nhưng một mặt cũng do khó ươm trồng, thời gian phát triển dài, năng suấtthấp Một số nghiên cứu trong và ngoài nước đã sử dụng chất thải nôngnghiệp và công nghiệp chế biến để cung cấp nguồn cacbon cho nuôi cấy rắnvà lỏng [9] Trong các siêu thị ở Nhật Bản có bán bột sợi nấm Hương thuđược từ sinh khối sợi nấm Sử dụng bột sợi nấm này như một loại bột canh sửdụng hàng ngày

Từ nhu cầu về dinh dưỡng và tác dụng phòng và chữa bệnh của nấmHương cũng như hệ sợi nấm Hương thì các nước trên thế giới không ngừngnghiên cứu và gần đây việc nghiên cứu thu sinh khối sợi nấm đang được chú

ý, vì điều kiện phát triển hệ sợi không yêu cầu khắt khe như nuôi lấy quả thểnấm.

2.3.2 Tình hình trong nước

Nấm Hương rất quen thuộc đối với người Việt Nam từ lâu đời và cónhiều món ăn được chế biến với nấm Hương Nhưng dù sao thì việc ươmtrồng loại nấm này ở nước ta vẫn chưa được phát triển nên ở nước ta phần lớnsử dụng nấm ở dạng quả thể nấm khô được nhập từ Trung Quốc Có thể tìmthấy nấm Hương dạng quả thể khô ở khắp các siêu thị ở nước ta, và có bántrên thị trường do nhu cầu sử dụng rộng rãi của người dân.

Hiện nay có một số tỉnh trồng nấm Hương với quy mô nhỏ vì còn phùthuộc vào điều kiện thời tiết, nó chỉ hợp với với nhiệt độ vào mùa đông ởmiền Bắc nước ta Một số tỉnh triển khai trồng nầm như: Cao Bằng, HàGiang, Lạng Sơn, Lào Cai (sapa)…

2.4 Các phương pháp nuôi trồng nấm Hương lấy quả thể2.4.1 Trồng nấm Hương trên cây gỗ [1]

Theo truyền thống thì ban đầu nấm Hương được trồng trên gỗ và về sauđã từng bước áp dụng thêm phương pháp nuôi trồng giá thể đóng túi sử dụngmùn của một số cây và các loại phụ phế thải nông nghiệp khác

Cần chọn các loại gỗ không có tinh dầu, cây còn tươi tốt, không sâubệnh Nhóm gỗ thích hợp nhất để nấm Hương sinh trưởng và phát triển chonăng suất cao, chất lượng tốt là gỗ sồi, dẻ, sau sau Lựa chọn những đoạn gỗthẳng, cắt thành khúc có đường kính từ 5-20cm, chiều dài 1,0-1,2m Khônglàm sây xát lớp vỏ Để gỗ trong nhà thoáng mát, sạch sẽ, sau 5-9 ngày là trồngđược.

Các đoạn gỗ đạt tiêu chuẩn đem rửa sạch, dùng nước vôi đặc quét haiđầu đoạn gỗ Lấy búa chuyên dùng hoặc khoan tạo lỗ trên đoạn gỗ, đườngkính lỗ 1,5cm, sâu 3-4cm, cứ cách 15-20cm tạo một lỗ; hàng nọ cách hàng kia7-10cm; các lỗ so le nhau Tra giống nấm gần đầy miệng lỗ, lượng giống

dùng 3kg/1m3, dùng phoi gỗ đã tạo ra làm nắp đậy (chiều dày bằng chiều dàycủa vỏ cây), lấp kín lớp giống cấy Phía ngoài dùng xi măng hòa thành bộtgiống như vữa trát tường quét trên miệng nắp để bịt kín miệng lỗ.

Xếp gỗ theo kiểu "cũi lợn" thành đống, cách mặt đất 15-20cm cao1,5m, chiều dài tùy theo khối lượng gỗ đem trồng Phía trên cùng dùng bao tảigai dấp ướt để ráo nước phủ kín toàn bộ đống ủ Hàng ngày chăm sóc đống ủ,chủ yếu là tưới nước Lượng nước tưới chỉ đủ ướt lớp bao tải Tuyệt đốikhông tưới nhiều, nước sẽ thấm sâu vào thân gỗ làm chết giống Tốt nhất nênươm trong nhà thoáng mát, tránh mưa nắng Thời gian ươm kéo dài 6-16tháng tùy thuộc theo từng chủng loại gỗ Cứ 2 tháng lại tiến hành đảo đống gỗmột lần Khi đảo cần kiểm tra độ ẩm của gỗ Nếu thấy gỗ quá khô cần dùngbình để phun nước nhẹ xung quanh thân gỗ, sau đó mới ủ đống lại Khi pháthiện các đoạn gỗ bị bệnh cần để cách ly khỏi đống ủ nhằm tránh lây lan sangcác đoạn gỗ khác.

Khi kết thúc giai đoạn ươm, nấm Hương bắt đầu hình thành quả thể.Quan sát trên bề mặt thân gỗ có những chấm màu hồng nhạt, chúng lớn dầnnhư hạt ngô và hình thành nên cây nấm hoàn chỉnh Dựng đứng thân gỗ, xếptheo kiểu giá súng, hàng nọ cách hàng kia 50-60cm Có thể xếp gỗ trong nhàcó mái che, thoáng mát, độ ẩm không khí cao, ánh sáng khuyếch tán Hàngngày tiến hành tưới nước nhẹ vài lần trực tiếp lên thân gỗ.

Khi nấm đủ lớn thì bắt đầu hái Hái nấm xong cắt bỏ phần gốc bám vàothân gỗ Tiêu thụ ở dạng tươi hoặc sấy khô Cứ khoảng 2 tháng một lần cầnđảo đầu đoạn gỗ trên quay xuống dưới để độ ẩm trong thân gỗ đều hơn Quátrình chăm sóc, thu hái nấm liên tục như vậy trong khoảng thời gian 2-3 năm.Năng suất trung bình khi kết thúc toàn bộ quá trình thu hái đạt 15-20 kg nấmkhô/1m3 gỗ.

2.4.2 Trồng nấm Hương trên mùn cưa và giá thể khác [1]

Xử lý nguyên liệu: Chọn các loại mùn cưa không có tinh dầu, không

bị mốc và không có các độc tố (dầu mỡ, hóa chất ) Một số cơ chất thườngsử dụng để nuôi trồng nấm Hương như: mùn cưa, rơm rạ, bã mía, vỏ hạtbông, vỏ lạc, khô dầu đậu đỗ, lạc vừng… Làm ẩm đạt độ thủy phân 70% Ủđống có khối lượng từ 300 kg/đống trở lên Thời gian ủ kéo dài 4-6 ngày, đảomột lần mỗi lần cách nhau 2-3 ngày Mùn cưa đã ủ xong trộn thêm 3% bộtnhẹ (CaCO3) hoặc 1,5% vôi bột đóng vào túi nilon chịu nhiệt Kích thước túirộng 25cm, cao 40cm Khối lượng 1,5kg/túi Nút cổ túi bằng ống nhựa vàbông, đưa túi mùn cưa vào nồi thanh trùng

Cấy giống nấm: Túi mùn cưa đã được thanh trùng theo một trong hai

cách trên, lấy ra để trong phòng sạch sẽ, đến khi nguội Cấy giống nấm trongcác tủ cấy vô trùng sang túi mùn cưa theo tỷ lệ 2,5-3% lượng giống so vớinguyên liệu.

Ươm túi mùn cưa đã cấy giống và chăm sóc: Chuyển các túi mùn cưa

đã cấy giống vào nhà ươm có nhiệt độ 24-26o C Nhà cần thoáng, mát, sạchsẽ, không có ánh sáng Thời gian ươm bịch kéo dài khoảng 60-70 ngày Sợinấm phát triển, ăn dần vào nguyên liệu, tạo nên màu trắng đồng nhất

Chăm sóc và thu hái nấm: Khi kết thúc thời gian nuôi sợi (pha sợi) ta

chuyển các túi mùn cưa đã có sợi nấm ăn kín đáy túi, mở túi bông và miệngtúi rộng ra, đặt sang phòng khác Yêu cầu nhà có ánh sáng, nhiệt độ đạt 16-18oC, độ ẩm không khí 80% Dùng bình phun tưới nước dưới dạng sương mùngày 2-3 lần Khoảng 15 ngày sau, nấm bắt đầu lên và thu hoạch Thời gianthu hoạch kéo dài 4-5 tháng sẽ kết thúc một đợt nuôi trồng

Trong suốt quá trình chăm sóc và thu hái nấm cần chú ý đảm bảo việctưới nước đúng lúc theo nguyên tắc: nấm lên nhiều và kích thước lớn thìlượng nước tưới nhiều lần trong ngày, hết đợt nấm ra phải tạo nên sự thay đổi

2.5 Nuôi cấy hệ sợi nấm Hương trong môi trường lỏng 2.5.1 Quá trình lên men chìm đối với vi sinh vật

2.5.1.1 Khái niệm

Là quá trình nhân nuôi vi sinh vật trong môi trường lỏng có sục khí đểbổ sung oxy hoặc nuôi tĩnh Giống vi sinh vật sau khi được cấy vào môitrường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) rồichuyển sang phát triển trong pha lũy thừa (pha log) Ở giai đoạn này thànhphần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu oxy tăng, nhiệt lượng tạora cao đồng thời bề mặt môi trường tạo thành bọt và lớp bọt tăng dần đến khinhiều có thể trào ra khỏi bình lên men, làm mất bớt dịch và tăng khả năngnhiễm vi sinh vật lạ không mong muốn

Ưu điểm của phương pháp:

- Hiệu suất sử dụng không gian cao (ba chiều), lượng hoạt chất đượcsinh tổng hợp trên thể tích sử dụng cao, hiệu suất lên men cao.

- Vì quá trình lên men diễn ra trong lòng chất lỏng nên tránh đượcnhiễm khuẩn

- Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu đáp ứng được nhu cầu sinh lýcủa vi sinh vật

- Các thiết bị cơ giới hóa và tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ítnhân công.

Tuy nhiên kỹ thuật lên men chìm đòi hỏi nhiều trang thiết bị kỹ thuật,các thiết bị chịu áp lực và đòi hỏi đảm bảo vô trùng tuyệt đối

2.5.1.2 Các phương pháp lên men chìm

a Lên men gián đoạn:

Quá trình này còn gọi là lên men theo mẻ có hoạt động như là một hệthống đóng kín Sự phát triển vi sinh vật được phân chia thành 4 pha đặc thù:Pha lag (pha tiềm tàng), pha log (pha lũy thừa), pha dừng, và pha suy tàn.

Pha lag: Khi cấy các tế bào vi sinh vật từ môi trường này sang môi

trường khác, khoảng thời gian đầu số tế bào không thay đổi Trong giai đoạnnày vi sinh vật làm quen với môi trường, thích nghi dần với điều kiện môitrường mới

Pha log: Cuối pha lag các tế bào đã thích nghi với điều kiện sống mới

và bắt đầu phát triển mạnh mẽ, quần thể vi sinh vật chuyển sang pha log, phaphát triển năng động nhất

Pha dừng hay pha ổn định: Sau khi đồng hóa các chất dinh dưỡng

hay sau khi tích lũy các sản phẩm trao đổi chất, sinh trưởng của vi sinh vậtgiảm xuống hay hoàn toàn ngừng lại Trong pha ổn định này sinh khối có thểcòn tăng chậm hoặc không đổi

Pha suy tàn: Đặc trưng của pha này là các chất dinh dưỡng bị cạn kiệt.

Năng lượng của tế bào giảm đến tối thiểu và tế bào chết dần Minh hoạ cácpha phát triển nêu trên hình 2.2.

b Lên men bổ sung

Kỹ thuật lên men bổ sung ứng dụng thích hợp cho các trường hợp sau: - Nồng độ cơ chất khá thấp nhưng lại cần ổn định (lên men nấm

men)

- Nồng độ cơ chất cần khá cao và không đổi - Phải bổ sung tiền chất liên tục

Hình 2.2 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn

(I- Pha lag, II- Pha log, III- Pha ổn định, IV- Pha suy tàn)

2.5.2 Ảnh hưởng của chủng giống

Theo một số kết quả nghiên cứu thấy rằng cùng một loài nấm Hương,nhưng các chủng giống nấm khác nhau tốc độ phát triển của chúng cũng khácnhau Mata và CS [6] khi nuôi cấy 11 chủng giống nấm Hương trên đĩa Petrivới môi trường MEA đã thu nhận được đường kính sợi nấm dao động từ 4,9đến 7,1cm Chủng Q616 có đường kính phát triển thấp nhất là 4,9cm, chủngM115 và V084 có đường kính phát triển lớn nhất sau 7 ngày nuôi cấy Cácchủng còn lại có đường kính từ 5,9cm đến 6,8cm Theo nghiên cứu của DeCarvalho [7]thì đường kính phát triển của 2 chủng Lentinula edodes em BDAvà Lentinula edodes em SDA trên môi trường thạch là khác nhau Sau 10

ngày, kết quả đo đường kính phát triển của chúng tương ứng là 9,2cm và4,5cm

t |h|logx

x

2.5.3 Môi trường nuôi cấy lỏng cho nấm Hương2.5.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng của nấm Hương

Về nguồn cacbon, nấm Hương có thể đồng hóa rộng rãi nhiều nguồncacbon khác nhau như đường đơn, đường kép, đa đường (như tinh bột, chấtxơ, chất gỗ) Về nguồn nitơ, nấm Hương có thể sử dụng nitơ hữu cơ nhưprotein, peptit, axit amin hay urê.

Tỷ lệ C:N trong môi trường ở giai đoạn nuôi sợi nên dùng tỷ lệ 40:1 Nhưng tỷ lệ C:N tối ưu cho sự phát triển của hệ sợi nấm là 30:1 Theonghiên cứu của nhóm tác giả Rossi và CS khi sử dụng môi trường rỉ đường thìtỷ lệ C:N là 107:1, còn khi bổ sung thêm 40% cám gạo thì tỷ lệ C:N là 38:1.Theo nghiên cứu này bổ sung cám gạo vào môi trường đến một lượng nhấtđịnh thu được kết quả tỷ lệ C:N phù hợp nhất là 30:1 cho sự phát triển của hệsợi nấm Hương [14].

25-Về nhu cầu nguyên tố khoáng, ngoài Mg, S, P, K nấm hương còn cầnmột số nguyên tố khoáng vi lượng như Fe, Zn, Mn…Mỗi lít dung dịch nuôicấy nên bổ sung thêm khoảng 2mg đối với từng loại Fe, Zn, Mn Khi có Fe,Mn, Zn tồn tại trong môi trường với nồng độ thích hợp thì việc bổ sung thêmmột chút Cu và Mo có thể làm xúc tiến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm

Khi nuôi trồng nấm Hương cần lưu ý bổ sung vitamin B1 Các vitaminkhác nấm Hương đều có thể tự tổng hợp Trong 1 lít môi trường nuôi cấy cầnbổ sung 100μl vitamin B1 Một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhưgibberellin (GA3), axit indolaxetic (IAA), kinetin (KT)…cũng có tác dụngxúc tiến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương [1].

Các môi trường nuôi cấy để nuôi hệ sợi cũng phải có đầy đủ nguồncácbon, nitơ, chất khoáng… đáp ứng cho nhu cầu phát triển của hệ sợi nấmHương.

2.5.3.2 Môi trường giữ giống

Có hai loại môi trường thường được sử dụng cho mục đích giữ giốngnấm Hương, đó là môi trường PDA và môi trường MEA

Môi trường PDA: Áp dụng để giữ giống trong ống thạch nghiêng và

đĩa Petri Thành phần trong 1 lít môi trường gồm: 200g khoai tây, 20gglucoza (có thể thay bằng đường kính hoặc maltoza), 20g thạch và nước.Trong 200g khoai tây có 38g hydratcacbon, 0,2 chất béo, 6g protein và 158gnước Bên cạnh đó, khoai tây còn chứa các chất dinh dưỡng như vitamin, chấtkhoáng

Môi trường MEA: Thành phần gồm chiết malt 15g và thạch 20g trong

1 lít môi trường

2.5.3.3 Môi trường nuôi cấy lỏng đối với nấm Hương

1 Môi trường YEM:

2g chất chiết nấm men, 10g chất chiết malt, 1 gam CaSO4 Tính cho 1lít.

2 Môi trường PD (đường và khoai tây):

200g khoai tây, 10 g glucose (hoặc dextrose) Tính cho 1 lít

3 Môi trường YMPG:

3 g chất chiết men, 3g chất chiết malt, 5g peptone, 10g glucose Tính cho1 lít

4 Môi trường ME:

15 g chất chiết malt, 5g pepton Tính cho 1 lít.

5 Môi trường YME:

2% chất chiết malt, 0.2% chất chiết nấm men Tính cho 1 lít.

6 Môi trường PDR:

200 g khoai tây, 10 g glucose; 0,25 g cám gạo Tính cho 1 lít.

7 Môi trường PDY:

20g chất chiết nấm men, 10g glucose; 250g khoai tây Tính cho 1lit.

8 Môi trường MP:

20g chất chiết malt, 250g khoai tây, 20g glucose Tính cho 1 lít

9 Môi trường SMPY:

10g Sucrose; 10g chất chiết malt; 5g pepton; 5g chất chiết nấm men.Tính cho 1 lít.

10 Môi trường CYM

2g pepton; 2g chất chiết nấm men; 20g glucose; 0,5g K2HPO4; 0,5gMgSO4; 0,46g KH2PO4 Tính cho 1 lít [5,6,10,11].

2.5.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng đối với nấm Hương2.5.4.1 Nồng độ ôxy

Nấm Hương thuộc nhóm nấm hoại sinh và hiếu khí, vì vậy trong quátrình nuôi hệ sợi nấm Hương nên bổ sung ôxy bằng thiết bị lắc, khuấy hay sụckhí Bào tử nấm sau khi được cấy vào môi trường lên men thì bắt đầu pháttriển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) khoảng 24 giờ, rồi chuyển sang phát triểntrong pha lũy thừa (còn gọi là pha log) Cuối pha lag các bào tử nấm đã thíchnghi với điều kiện sống mới và bắt đầu phát triển mạnh mẽ Ở giai đoạn nàythành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu ôxy tăng, nhiệtlượng tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường tạo thành bọt và lớp bọt tăng.Nên phải cấp khí ôxy bằng cách lắc ở quy mô phòng thí nghiệm và dùng thiếtbị sục khí như khuấy, sục khí ở quy mô sản xuất để tăng hiệu suất lên mencao tạo sinh khối sợi nấm Hương

Theo nghiên cứu của Hassegawa trong môi trường nuôi cấy lỏng với sựcung cấp ôxy thông qua chế độ nuôi có lắc và không lắc (nuôi tĩnh) sử dụngmôi trường YEM ở nhiệt độ 25oC Khi nuôi cấy tĩnh chỉ thu được hàm lượngsinh khối sợi khô của nấm Hương tối đa là 4 mg/ml Trong khi nuôi cấy có lắcvới tốc độ 150 vòng/phút thì hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm Hươngtăng lên 5 mg/ml [5].

2.5.4.2 Nhiệt độ môi trường

Bào tử nấm Hương nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 22-26oC Trong điềukiện khô hạn ở 70oC bào tử đảm của nấm sẽ bị chết sau 5 giờ Nếu ở 80oC thìsẽ chết chỉ sau 10 phút

Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương.Sợi nấm phát triển ở dải nhiệt độ từ 5 đến 35oC nhưng phát triển tốt nhất ở 20đến 25oC Đây là nhiệt độ phù hợp với điều kiện khí hậu ở nhiều vùng củanước ta Còn dưới nhiệt độ 10oC và trên nhiệt độ 32oC sự sinh trưởng của hệsợi nấm bị hạn chế Đến nhiệt độ 35oC sợi nấm bắt đầu ngừng phát triển [3].

Theo nghiên cứu của Hassegawa thì ở nhiệt độ 20oC thu được lượngsinh khối sợi nấm là lớn nhất, hay 20oC là nhiệt độ tối ưu cho sự phát triểncủa hệ sợi nấm Hương Tác giả này đã nghiên cứu với nhiều môi trường khácđều cho kết quả ở nhiệt độ này là tối ưu [5].

Trong nhiều nghiên cứu khác, người ta thường dùng khoảng nhiệt độ20 đến 25o cho sự phát triển của hệ sợi Nghiên cứu tại Trường đại học Utah[13] cho biết điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấmtrong môi trường rắn và lỏng đều là 25oC Theo nghiên cứu của nhóm tác giảIshikawa và CS [8] thì nhiệt độ phù hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấmHương cũng là 25oC Nhiều nghiên cứu cho thấy ở nhiệt độ 25oC cho sinhkhối sợi cao và nhiệt độ này là khoảng nhiệt độ phòng thí nghiệm và thườngphù hợp với điều kiện tự nhiên của nhiều vùng nên không đòi hòi khắt khe vềthiết bị nuôi, giảm chi phí cho quá trình lên men

2.5.4.3 Độ pH môi trường

Độ pH thích hợp cho sự sinh trưởng của hệ sợi của nấm Hương trênmôi trường nuôi cấy rắn là pH 5,0-6,0 Sau khi nuôi cấy được vài ngày, pHmôi trường sẽ giảm đi rất nhanh do nấm Hương sản sinh ra một số axit hữu cơnhư axit axetic, axit sucxinic, axit oxalic Trong giai đoạn nuôi sợi, pH không

ảnh hưởng nhiều đến sinh khối sợi Thường sử dụng pH tự nhiên của môitrường dinh dưỡng.

Trong nuôi cấy lỏng, theo nghiên cứu của Hassegawa và CS thì pH tốiưu cho sợi nấm phát triển trên môi trường dung dịch là 4,5 Tuy nhiên, ở pH4,5 này thì vi khuẩn cũng phát triển mạnh, nên pH từ 3 – 3,5 là tốt nhất vì ởpH này hệ sợi phát triển tốt và kháng khuẩn [5].

2.5.4.3 Cường độ ánh sáng

Ánh sáng không ảnh hưởng nhiều đến quá trình phát triển hệ sợi, vìtrong giai đoạn phát triển hệ sợi không cần quan tâm đến cung cấp ánh sáng.Khi nuôi trên môi trường thạch đĩa, thường nuôi ở trong tủ ấm, không có ánhsáng, hệ sợi nấm Hương vẫn phát triển tốt

Tuy nhiên, đối với nuôi cấy môi trường lỏng (trong thiết bị lên men) thìthường sử dụng nuôi ở ánh sáng phòng hay trong tối [9]