Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu đa dạng di truyền của cây mắm biển

Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu đa dạng di truyền của cây mắm biển

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN

(Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN

RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2003 – 2007

SINH VIÊN THỰC HIỆN: LÊ ĐỨC TUÂN

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN

(Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN

RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Thành phố Hồ Chí Minh

LỜI CẢM ƠN

Con xin cảm ơn ba mẹ cùng gia đình đã nuôi con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài

Em xin chân thành cảm ơn:

Các Thầy Cô trong trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học

Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận

Thầy Bùi Minh Trí, đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa Sinh đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận

Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập mẫu

Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh, chị trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu

Xin cám ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã cùng tôi chia sẻ biết bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt 4 năm đại học

Xin chân thành cảm ơn! LÊ ĐỨC TUÂN

TÓM TẮT

LÊ ĐỨC TUÂN, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 “HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA

CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG

NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD” Hội đồng hướng dẫn:

TS BÙI MINH TRÍ

Cây mắm biển (Avicennia marina) là một trong những loài thực vật đặc

trưng sinh sống ở rừng ngập mặn đem lại giá trị kinh tế và môi trường rất cao.Tuy nhiên, những thập niên trở lại đây loài mắm biển có dấu hiệu lụi tàn Vì vậy việc xây dựng chiến lược phát triển lâu dài đem lại hiệu quả kinh tế và môi trường cao, vấn đề đánh giá tổng quát quỹ gene và mức độ đa dạng của quần thể mắm tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh được xem là một việc làm cấp thiết

Sau một thời gian thực tập ở Viện Nghiên cứu CNSH và CNMT, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, chúng tôi đã đạt được kết quả:

nghiệm trên ba primer: primer 1 và primer RAH8 và primer OPAC10 thì thấy primer OPAC10 cho sản phẩm thể hiện sự đa dạng về di truyền cao

400 bp cho cả ba loài mắm, giúp xác định được marker chỉ thị cho loài mắm

(Avicenniaceae)

lượng band/mẫu không cao nhưng lại thể hiện rõ sự đa hình giữa các mẫu Chúng

tôi thu đƣợc 9 band đa hình chiếm tỷ lệ 90% và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 10% Kết quả phân tích trên phần mềm NTSYS (Numercial Taxonomy System) phiên bản 2.1, 7 mẫu mắm đƣợc khảo sát đƣợc chia làm 2 nhóm chính với khoảng cách phân nhóm là 0,40 Nhóm 1 gồm 4 mẫu: M8, M18, M25, M40 Các cây này có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,67 – 1,00

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Một số khái niệm về đa dạng sinh học 3

2.1.1 Đa dạng sinh học 3

2.1.2 Đa dạng di truyền 3

2.1.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền 4

2.2 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 4

2.2.1 Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 4

2.2.2 Cấu trúc của khu dự trữ rừng ngập măn Cần Giờ 8

2.2.3 Công tác quản lý khudự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 9

2.3 Cây mắm biển 11

2.3.1 Hình thái học 11

2.3.2 Nơi sống và sinh thái 12

2.3.3 Phân bố 12

2.3.2 Quy trình ly trích DNA thực vật 13

2.4.1 Định lượng DNA bằng phương pháp quang phổ 14

2.4.2 Định tính DNA ly trích bằng phương pháp điện di 15

2.5 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền 16

2.5.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử 16

2.5.2.2 Quy trình chuẩn của phản ứng PCR 19

2.5.2.3 Tối ưu hoá phản ứng PCR 21

2.5.3 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 22

2.5.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 22

2.5.4.1 Ưu điểm của kỹ thuật RAPD 25

2.5.4.2 Nhược điểm của kỹ thuật RAPD 25

2.5.4.3 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD 25

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 27

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 27

3.1.1 Thời gian nghiên cứu 27

3.1.2 Địa điểm thực hiện 27

3.2 Vật liệu thí nghiệm 27

3.3 Phương pháp nghiên cứu 27

3.3.1 Vật liệu dùng trong ly trích DNA 27

3.3.2 Quy trình ly trích DNA 31

3.3.3 Kiểm tra kết quả ly trích DNA 33

3.3.4 Thực hiện kỹ thuật RAPD 34

3.3.4.1 Dụng cụ và hóa chất dung trong kỹ thuật RAPD 34

3.3.4.2 Bố trí thí nghiệm 35

3.4 Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS 38

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

4.1 Kết quả thu thập mẫu mắm tại rừng ngập mặn Cần Giờ 40

4.2 Bảo quản mẫu và hoàn thiện quy trình ly trích DNA 41

4.2.1 Bảo quản mẫu 41

4.2.2 Hoàn thiện quy trình ly trích 41

4.3 Kết quả chạy RAPD 43

4.3.1 Thí nghiệm 1: Sử dụng primer RAH8 với chu kỳ nhiệt 1 43

4.3.2 Thí nghiệm 2: Sử dụng primer 1 với chu kỳ ở Bảng 44

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

bp: Base pair

CNMT: Công Nghệ Môi Trường CNSH: Công Nghệ Sinh Học DNA: Deoxyribonucleic acid

dNTP: Deoxynucleotide triphosphate E: East

EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid EtBt: Ethidium bromide

N: North

OD: Optical density

PCR: Polymerase chain reaction

RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA RNA: Ribonucleic acid

RNase: Ribonuclease Ta: Annealing temperature Tm: Melting temperature TE: Tris EDTA

TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA

UNESCO: United Nations Educational Scientific, and Cultural Organization UV: Ultra Violet

Hình 4.1: Trái mắm biển(A); Hoa(B) 41

Hình 4.2: Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ 42

Hình 4.3: Kết quả ly trích theo quy trình 1 44

Hình 4.4: Sản phẩm DNA ly trích theo quy trình cải tiến (quy trình 2) 44

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose có nồng độ khác

nhau 16 Bảng 2.2: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide có nồng độ khác nhau 16

Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 36 Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 36 Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm2 37 Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 37 Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm3 38 Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 3 38

Chương 1

LỜI MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Mắm biển (Avicennia marina) là một nhóm các loại cây rừng ngập mặn,

phân bố rộng khắp trên toàn thế giới trong các vùng bờ biển nằm trong khoảng giữa triều lên và triều xuống về phía Nam của Bắc chí tuyến [17]

Sau 22 năm khôi phục, tổ chức UNESCO sau khi kiểm tra công trình rừng ngập mặn Cần Giờ đã thống nhất công nhận là khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn vào ngày 21/01/2000 [18]

Ở nước ta, cây mắm thường sống ở những vùng rừng ngập mặn như Cần Giờ, Long An, Củ Chi… dùng làm liệu xây dựng là cây có giá trị kinh tế và môi trường rất cao Gỗ mắm được sử dụng rộng rãi để xây dựng nhà cửa, đóng vật dụng, làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh bắt thủy sản Than mắm cho nhiệt lượng cao và ít khói Các khu rừng mắm có vai trò vô cùng quan trọng vào việc duy trì cân bằng sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm quá trình xói lở, sa mạc hoá, ngăn chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng biển Mặt khác, các khu rừng mắm là nơi cư trú của nhiều loài động vật hoang dã

Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM, được sự hướng dẫn của TS Bùi Minh Trí, chúng tôi thực hiện đề tài “HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI

TRUYỀN TRÊN QUẦN THỂ MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ

SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”

1.2 Mục đích, yêu cầu 1.2.1 Mục đích

 Hoàn thiện kỹ thuật RAPD trên cây mắm biển

 Đánh giá về mặt di truyền quần thể mắm trồng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp Hồ Chí Minh

 Ứng dụng trong tuyển chọn giống mắm phục vụ cho việc tái tạo rừng ngập mặn trong tương lai

 Ly trích được DNA từ mẫu lá mắm với độ tinh sạch cao  Thu thập được bằng kỹ thuật RAPD

 Vẽ cây phân loại loài bằng phần mềm NTSYS

1.2.2 Hạn chế của đề tài

Cần Giờ

Do vậy đa dạng sinh học được xem xét theo 3 mức độ:

 Đa dạng sinh học ở cấp độ loài bao gồm toàn bộ các sinh vật sống trên trái đất, từ vi khuẩn đến các loài thực vật, động vật và các loài nấm

 Đa dạng sinh học ở mức độ gen là sự khác biệt gen giữa các loài, giữa các quần thể sống cách ly về địa lý cũng như các cá thể cùng chung sống trong một quần thể

 Đa dạng sinh học còn bao gồm sự khác biệt giữa các quần xã mà trong đó các loài sinh sống và các hệ sinh thái, nơi mà các loài cũng như các quần xã sinh vật tồn tại và cả sự khác biệt của mối tương quan giữa chúng với nhau (Phạm Bình Quyền, 2002)

 Ngoài ra đa dạng sinh học còn liên quan đến việc phân bố địa lý Đây là sự phân biệt có tầm rộng và là chiến lược nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới

2.1.2 Đa dạng di truyền

Các cá thể trong một quần thể thường có genome khác nhau Sự đa dạng về genome được biểu hiện qua sự khác nhau về gen giữa các cá thể Những alen khác nhau của cùng một gen có thể làm cho sự phát triển các đặc điểm sinh lý ở mỗi cá thể khác nhau là khác nhau Những cây trồng được trồng lai ghép hay những động vật được lai tạo từ những genome khác nhau có thể tạo ra những giống cây trồng,

vật nuôi cho năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt (Richard B Primack,

2.1.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên và nó cũng quan trọng đối với con người

Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trường Sự đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con người

2.2 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2.1 Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nằm ở địa bàn huyện Cần Giờ, được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai-Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam

Thành Phố Hồ Chí Minh có toạ độ địa lý như sau:

Vĩ độ Bắc: 100

22’14’’ - 100 37’39’’

46’12’’ – 1070 00’59’’ Ngày được UNESCO công nhận: 21/01/2000 Tổng diện tích: 71.370 ha

Dân số: 57.403người

Tên chính thức: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ,Tp Hồ Chí Minh

Hình 2.1: Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu

Khí hậu Cần Giờ có hai mùa rõ rệt: mùa mƣa từ tháng 5 -10 và mùa nắng từ

1.400 mm/năm

Ghi chú:

Vùng lõi Vùng đệm

Vùng chuyển tiếp

Cách Tp Hồ Chí Minh 30 – 40 km theo đường chim bay, rừng ngập mặn Cần Giờ được gọi là “Lá phổi xanh của Thành phố” với chức năng điều hoà không

quyển rừng ngập mặn Cần Giờ được công nhận là khu rừng phòng hộ từ năm 1991 Ủy ban nhân dân Tp Hồ Chí Minh đã phê duyệt dự án đầu tư xây dựng Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ giai đoạn 2002 - 2011 theo Quyết định số 8413/QĐ-UB ngày 12/12/2001

Rừng ngập mặn tập trung ở huyện Cần Giờ (phía Nam Thành phố) vốn là rừng nguyên sinh, xuất hiện đã lâu năm theo lịch sử của quá trình hình thành bãi bồi

cửa sông ven biển; ưu thế loài cây mắm (Avicenniaceae) có kích thước lớn; với hệ

thực vật khá phong phú khoảng 104 loài thuộc 48 họ [14] Thời thuộc Pháp, nó là rừng cấm, song khoảng từ năm 1961 - 1970 bị các đợt khai quang rải chất độc hóa học của Mỹ, nên có tới 80% diện tích rừng vùng này bị hủy diệt, khiến đại bộ phận đất đai trở thành những trảng cỏ cây bụi thứ sinh Từ năm 1978, thành phố Hồ Chí Minh đã đầu tư trồng phục hồi hàng chục ngàn ha rừng mắm, chủ yếu tập trung vào khoảng thời gian 1978 – 1986 [16]

Về cấu trúc quần thể thực vật rừng ngập mặn, sự phân bố các quần xã phụ thuộc rõ rệt vào điều kiện lập địa - mà ở vùng ngập mặn, thì mức độ ngập thủy triều và độ dẽ chặt của đất là yếu tố chi phối chủ yếu Nhìn chung, các quần xã thực vật quen thuộc ở rừng ngập mặn phía Nam nước ta, hầu như đều hiện diện tại Cần Giờ Ngoài một số trên diện tích không lớn đất "giồng" đã được canh tác nông nghiệp và trồng cây vườn ra, ở Cần Giờ hiện có các quần xã thực vật tự nhiên chủ yếu, được hình thành và phân bố tuần tự từ nơi đất thấp, bùn lỏng chưa cố định đến nơi cao ít ngập triều đất đã cố định, như: quần xã mắm có các hợp tác xã mắm thuần loại-

mắm trắng (Avicennia alba), mắm đen (Avicennia officinalis); các quần xã mắm hỗn giao với đước hoặc với bần trắng (Sonneratia alba); quần xã dà + mắm có các xã hợp dà + mắm đen (ceriop tagal + Avicennia alba); quần xã chà là có các xã hợp chà là thuần loại (Phoenix paludosa), chà là + ráng đại (Acrostichum aureum), chà là + giá (Excoecaria agallocha) và nhiều loài cây khác như sú, cóc (Lumnitzera

racemosa)…, thể hiện quy luật diễn thế thảm thực vật rừng ngập mặn, theo độ cao

địa hình một cách rõ rệt và nhạy cảm [19]

Từ khi phục hồi, môi trường sinh thái vùng ngập mặn Cần Giờ được cải thiện, chim, thú đã dần dần tái hiện, như cá sấu, khỉ, heo, chồn, cáo, trăn, rắn và hàng chục loài chim Ðồng thời, sản lượng tôm cá vùng rừng ngập mặn cũng ngày càng nâng cao Tác dụng to lớn của rừng ngập mặn Cần Giờ, là bảo vệ bờ lấn biển và về lâu dài, còn là giữ vai trò "lá phổi" điều hòa khí hậu cho Thành phố, cho các

vùng lân cận và tô điểm cảnh quan phục vụ phát triển du lịch [19]

Sau ngày miền Nam hoàn toàn giải phóng 30/4/1975, rừng ngập mặn Cần Giờ thuộc địa phận huyện Duyên Hải, tỉnh Đồng Nai Đến năm 1978, huyện Duyên Hải được giao lại cho thành phố Hồ Chí Minh với tổng diện tích toàn huyện lúc đó là 71.361 ha, trong đó diện tích rừng ngập mặn và đất lâm nghiệp là 34.468 ha Lâm trường Duyên Hải lúc đó trực thuộc Ty Lâm nghiệp Tp Hồ Chí Minh được thành lập vào năm 1978

Từ năm 1984 trở đi, một số loài cây khác như gõ biển (Intsia bijuga), dà vôi (Ceriops tagal), dà quánh (C decandra), cóc trắng (Lumnitzera racemosa), xu ổi (Xylocarpus granatum), tra (Thespesia populnea)… cũng được trồng để phủ xanh

các vùng đất cao, ít ngập triều

mang tính chất rừng nhiệt đới cổ và phong phú về số loài thực vật di cư Theo số liệu điều tra, Rừng ngập mặn Cần Giờ có khoảng 35 loài thực vật, phổ biến là mắm

quăn (Avicennia lanata), mắm trắng (Avicennia alba), bần (Sonneratia evata), chà là (Phoenix paludosa), dừa nước (Nipa fruticans)… [18]

Cùng với sự phục hồi về thảm thực vật rừng, nhiều loài động vật tưởng chừng đã biến mất cùng với sự tàn phá của chiến tranh đã hồi sinh và phát triển lại nhanh chóng ở rừng ngập mặn Cần Giờ như khỉ, lợn rừng, chồn, trăn, rái cá… trong đó có nhiều loài được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam như Cá sấu hoa cà, Rắn hổ mang chúa… Đặc biệt, nhờ có sinh cảnh thuận lợi, các loài chim tự nhiên đã và đang hình

thành trở lại với số loài đã chiếm tới 34% tổng số loài chim nước ở Việt Nam, trong đó có tới 9 loài qúy hiếm được ghi trong Sách Đỏ Thế giới [18]

2.2.2 Cấu trúc của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ được chia làm 3 vùng chính: vùng lõi, vùng đệm, vùng chuyển tiếp

- Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn bao gồm rừng trồng và rừng tự nhiên - Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn với các môi trường sống của động vật hoang dã, đặc biệt là chim nước

- Bảo tồn hệ thống thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển nơi kiếm ăn và sinh đẻ của các loài động vật vùng triều

- Tiến hành một số công trình nghiên cứu khoa học về sức bền hệ sinh thái và du lịch sinh thái có giới hạn

 Vùng đệm (37.339 ha)

Là vùng tiếp giáp với vùng lõi, có thể tiến hành các hoạt động kinh tế, nghiên cứu, giáo dục và giải trí nhưng không ảnh hưởng đến mục đích bảo tồn trong vùng lõi

Vùng đệm bao gồm các tiểu khu rừng số 1, 2, 4a, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 và 24 Với chức năng phục hồi các hệ sinh thái, vùng đệm có vai trò quan trọng trong bảo tồn vùng lõi Các hoạt động du lịch sinh thái, tham quan và nghiên cứu có thể triển khai ở Khu căn cứ địa kháng chiến, đặc khu Rừng

Sác, thăm thú sẽ góp phần nâng cao thu nhập cho người dân, nâng cao ý thức và hiểu biết giá trị của công tác bảo tồn góp phần làm giảm sức ép lên vùng lõi của khu dự trữ sinh quyển Mặt khác, vùng đệm còn tạo không gian cho thú hoang dã như khỉ, rái cá, kỳ đà … kiếm ăn Khi các khu vực này trở nên ổn định, có thể bổ sung vào vùng lõi nếu cần thiết, đồng thời tạo cảnh quan tự nhiên và hoạt động văn hoá phục vụ cho du lịch sinh thái Ngoài ra, các mô hình lâm ngư kết hợp thân thiện với môi trường cũng được ứng dụng, trình diễn cho nhân dân địa phương đến tham quan, học tập và trao đổi kinh nghiệm

 Vùng chuyển tiếp: 29.310 ha

Vùng chuyển tiếp còn được gọi là vùng phát triển bền vững, nơi cộng tác của các nhà khoa học, nhà quản lý và người dân địa phương Tạo điều kiện thuận lợi và đẩy mạnh các hoạt động phát triển kinh tế, du lịch, dịch vụ đi đôi với tuyên truyền giáo dục nâng cao nhận thức cộng đồng

Vùng chuyển tiếp bao gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ bao gồm các vùng bãi bồi, giồng, bãi cát, các khu vực sản xuất nông nghiệp, thủy sản, diêm nghiệp và dân cư dọc theo ven biển Cần Giờ Đây là vùng chuyển tiếp có nhiều tiềm năng cho hoạt động kinh tế, đặc biệt là phát triển du lịch sinh thái, phát triển nông nghiệp, ngư nghiệp và thủy sản bền vững Hệ thống nhà nghỉ, khách sạn, nhà hàng vùng ven biển Cần Giờ rất hấp dẫn khách du lịch

2.2.3 Công tác quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ được quản lý theo hệ thống rừng đặc dụng (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) theo quyết định số 173/CT ngày 29/05/1991 do Chủ tịch Hội đồng Bộ trưởng phê duyệt thành lập Rừng phòng hộ Môi trường Ủy ban nhân dân Tp Hồ Chí Minh đã phê duyệt dự án đầu tư xây dựng Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ giai đoạn 2002-2011 theo Quyết định số 8413/QĐ-UB ngày 12/12/2001

Ủy ban nhân dân Huyện Cần Giờ: Trực tiếp quản lý về mặt hành chính, đất

đai, tài nguyên rừng cũng như tất cả các hoạt động kinh tế, xã hội, dân cư trên địa bàn huyện Các cơ quan trực thuộc bao gồm:

 Ban Quản lý rừng ngập mặn Cần Giờ Tp Hồ Chí Minh: Quản lý tài nguyên rừng, thực hiện chính sách bảo vệ rừng, cung cấp nguồn trợ cấp cho các hộ dân trong rừng Các đơn vị trực thuộc ban quản lý là các tiểu khu Các tiểu khu chịu trách nhiệm quản lý rừng và các hộ dân sống trong khu vực đó

 Ủy ban nhân dân xã, phường, thị trấn: Quản lý về mặt hành chính trong địa bàn xã, thị trấn

Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn: Quản lý tài nguyên rừng theo

ngành, các chủ trương chính sách từ Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Các cơ quan trực thuộc chính gồm:

 Chi cục Kiểm lâm: Tuần tra, bảo vệ rừng theo luật pháp hiện hành Chi cục có các Trạm Kiểm lâm nằm ở các vị trí xung yếu trong rừng để công tác bảo vệ rừng đạt hiệu quả

 Chi cục Phát triển Lâm nghiệp: Xây dựng kế hoạch tổng thể, nguồn nhân lực và tài chính cho công tác trồng và bảo vệ rừng

 Trung tâm Nghiên cứu Khoa hoc Kỹ thuật và Khuyến nông: Cung cấp và tư vấn giống cây trồng vật nuôi, các mô hình kinh tế phát triển nông lâm nghiệp hài hoà với môi trường

Sở Du lịch, Sở Tài nguyên và Môi trường, Sở Khoa học và Công nghệ: Quản

lý theo ngành về các lĩnh vực liên quan: Phát triển du lịch, nghiên cứu triển khai các đề tài khoa học, công nghệ, hệ thống giám sát môi trường, tuyên truyền giáo dục, đào tạo…

Các công ty kinh doanh tư nhân: Bao gồm các công ty dịch vụ du lịch, các

chủ đầm nuôi tôm, đánh bắt thuỷ hải sản… tham gia bảo vệ môi trường thông qua việc đóng góp thuế phí…

Các trường đại học, viện nghiên cứu: Triển khai các đề tài nghiên cứu khoa

học, giám sát, đánh giá tác động môi trường, tuyên truyền giáo dục người dân nâng cao ý thức bảo vệ rừng…

Ban Quản lý khu dự trữ sinh quyển: Ban quản lý khu dự trữ sinh quyển Cần

Giờ dưới sự quản lý và chỉ đạo trực tiếp của Ủy ban Nhân dân huyện Cần Giờ và Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn với vai trò và nhiệm vụ điều phối tổng thể các hoạt động trên theo đúng tiêu chí của khu dự trữ sinh quyển là kết hợp hài hoà giữa bảo tồn và phát triển kinh tế, đồng thời tạo điều kiện triển khai các đề tài nghiên cứu khoa học, tuyên truyền giáo dục và đào tạo, mở rộng hợp tác quốc tế

2.3 Cây mắm biển

Tên La Tinh: Avicennia marina

Họ: Verbenaceae

Chi: Avicennia Lớp: Magnoliopsida

Bộ: Lamiales

Hình 2.2: Cấu trúc cành, lá và trái Mắm 2.3.1 Hình thái học

Cây mắm có thể đạt đường kính gốc và chiều cao khác nhau, có loài đạt đường kính gốc 60 cm và chiều cao 30 m Cây mắm trước đây dùng làm ghe, thuyền, cất nhà và làm củi Ngày nay mắm cũng cung cấp nguyên phẩm cho việc biến chế dược liệu và cung cấp sắc tố cho công nghiệp thuộc da

Đặc điểm của cây mắm là có rễ đất và rễ phổi Rễ phổi (cặc mắm) có nhiệm vụ hấp thụ dưỡng khí, là biện pháp sinh tồn khi nền đất ngập mặn Rễ phối cũng là "kiến trúc" của thiên nhiên thích ứng để bảo vệ đất bồi

Vì thiếu cây giống để trồng bảo vệ ven biển và đất bồi, một số nước đã có lệnh cấm xuất khẩu gỗ và cây con các loại cây mắm, đước và vẹt [19]

 Hình dáng: Cây gỗ, cao đến 10 m với đường kính 0,5 m, nhánh thấp, tán

rộng, cành non, có lông tơ màu trắng hay xám, thân ít khi thẳng, vỏ không nứt, màu trắng với lớp vỏ cóc có dạng phiến mỏng (giống như vỏ ổi), rễ phổi đứng

 Lá: Lá đơn, mọc đối, phiến nguyên láng, mỏng, thường quăn queo, hình

xoan, đầu nhọn hay tù, chân nêm, dài 3 – 5 cm, bìa nguyên, hơi dợn sóng và có lông ở gân phụ, cuống dài 0,5 cm, nhiều lông nhỏ

 Rễ: Rễ phổi đứng

 Hoa: Hoa vàng, to 5 – 8 mm, có mùi thơm mạnh, tạo thành tán - gié ở ngọn,

thường có 3 nhánh, lá bắc phụ hình bầu dục, lõm, tai đài không bằng nhau và có lông tơ, vành hình ống, ngắn hơn cánh, có thùy bằng nhau, dài 1 – 2 mm, tròn dài, 4 tiểu nhị: (2 dài, 2 ngắn), bầu nhụy hình trụ, tròn ở dưới, không vòi nhụy Trổ bông vào tháng 10 - 12 dương lịch

 Quả: Trái hình tim, dài 1,5 – 2 cm, vỏ màu vàng xanh, đầy lông mịn Cho

trái mắm vào tháng 4 - 6 dương lịch

2.3.2 Nơi sống và sinh thái

Tại rừng sát Cà Mau, thường gặp loài này trên đất bồi đã dẽ chặt, dọc bờ biển ít ngập bởi nước triều, tạo thành quần thụ đơn thuần hoặc hỗn giao với các loài

Avicennia officinalis (mắm đen), Excoecaria agallocha (giá) và Ceriop decandra

(dà quánh)

2.3.3 Phân bố

Châu, Bồ Ðào Nha, Pakistan, Ấn Ðộ, Myanma, Xri Lanca, Trung Hoa (Hải Nam), Ðài Loan, Hồng Kông, Nhật (Ryukyu), Tân Tây Lan, Madagascar, Úc Châu

2.4 Quy trình ly trích DNA thực vật

Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số như quy trình của Scott O.Rogers và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình của Ziegenhagen và Fladung (1997)… Mỗi phương pháp đều có ưu và khuyết điểm riêng Chúng ta có thể dựa vào đối tượng được cũng như yêu cầu về chất lượng, số lượng DNA cần thu để chọn phương pháp cho thích hợp Ngoài ra, giá thành cũng là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phương pháp tách chiết thích hợp

Phương pháp ly trích DNA cơ bản gồm ba bước:

 Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng phương pháp cơ học (nghiền) Thông thường người ta nghiền tế bào, trong một hỗn hợp chất tẩy (như SDS, Sarcosyl, CTAB) và proteinase (Proteinase K) Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA Để đảm bảo sự toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, hạn chế sự hoạt động của các enzyme thuỷ phân nội bào, người ta có thể phá vỡ cơ học mô và tế bào

dụng chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân (phá vỡ hóa học)

 Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein Sự loại bỏ này dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các loại phân tử khác nhau (nucleic acid/ protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/ nước) Mẫu được lắc nhẹ trong dung dịch phenol/chloroform/iso amylalcohol (tỉ lệ 25/24/1) Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol, chloroform Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại

 Bước 3: Tủa nucleic acid Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol, nhưng thông thường người ta dùng isopropanol Nucleic acid sẽ được thu nhận

lại bằng ly tâm Sau đó, cặn tủa được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn

Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA:

2.4.1 Định lượng DNA bằng phương pháp quang phổ

Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ (tức là nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng Ví dụ đỉnh hấp thụ của các phân tử acid nucleotide là 260 nm Sự hấp thụ này là do sự tương tác giữa các photon với các electron của vòng purine và pyrimidine Dựa vào sự hấp thụ này người ta có thể định lượng được hàm lượng DNA có trong mẫu ly trích

Sự hấp thụ ở đây được tính bằng đơn vị OD (Optical Density) Đối với DNA tinh khiết một đơn vị OD260 nm tương ứng với:

 50 g/ml DNA sợi đôi

 40 g/ml DNA sợi đơn hay RNA  20 g/ml oligonucleotide sợi đơn

trong mẫu ly trích

Cách tính trên chỉ đúng với mẫu DNA tinh khiết Nếu mẫu ly trích có lẫn tạp protein thì kết quả tính toán sẽ không chính xác Ngoài đỉnh hấp thụ là 280 nm protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các acid nucleotide và làm

sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleotide Để ước lượng độ tinh sạch của mẫu ly trích người ta tính tỷ lệ OD260 nm/OD280 nm

 Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,7 - 2,2 thì mẫu ly trích được xem là

sạch

 Nếu mẫu bị nhiễm protein thì tỷ lệ này sẽ thấp hơn nhiều

Tuy nhiên, việc định lượng bằng phương pháp hấp thu mật độ quang lại không cho biết chất lượng của DNA ly trích Để biết chính xác chất lượng DNA ly trích, người ta sử dụng phương pháp điện di trên gel

2.4.2 Định tính DNA ly trích bằng phương pháp điện di

Nguyên tắc của kỹ thuật điện di: Trong một điện trường, các phân tử sẽ di chuyển với vận tốc tùy thuộc vào điện tích và kích thước của chúng Nếu hai phân tử có cùng khối lượng thì phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn

Đối với phân tử DNA, việc điện di được thực hiện trên giá thể bán rắn là gel Gel là môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử acid nucleotide đi qua Kích thước phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm Có hai loại gel được sử dụng tùy theo kích thước và mức độ phân tách của phân tử acid nucleotide: Gel agarose và gel polyacrylamide

 Gel agrose: Lỗ có đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử

DNA sợi đôi, kích thước 300 - 10000 bp Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau

Bảng 2.1 Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose với các nồng độ khác nhau

Nồng độ gel agarose (%, w/v) Kích thước đoạn DNA dạng thẳng (kb)

0,6  0,8 0,9  1,2 1,2  1,5

1 20 0,5  7 0,5  5

 Gel polyacrylamide: Cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn

DNA có kích thước dưới 500bp, hiệu quả phân tách có thể đạt 1 nucleotide (Lưu ý: Gel polyacrylamide ở dạng lỏng là chất gây độc cho hệ thần kinh nên phải cẩn thận khi sử dụng

Bảng 2.2 Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau

Nồng độ gel polyacrylamide (%, w/v)

Kích thước đoạn DNA dạng thẳng (bp)

4 5 8 11

200  800 80  200 40  100 10  50

Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, người ta sử dụng một số phương pháp phát hiện như sau:

Đối với gel agarose: Nhuộm bằng ethidium bromide Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel

Dựa vào kết quả điện di, chúng ta có thể biết được chất lượng của DNA ly trích như gẫy, lẫn tạp…

2.5 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền

2.5.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử

Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác

với những cá thể khác cùng giống Sự khác biệt về di truyền như vậy được gọi là tính đa dạng di truyền [2]

Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính trạng bên ngoài Người ta thường tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra được sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị.[2]

Có 3 loại chỉ thị thường được sử dụng: - Chỉ thị hình thái

- Chỉ thị isozyme.- Chỉ thị phân tử.

2.5.1.1 Chỉ thị hình thái

Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể phát hiện được Tuy nhiên nếu dựa vào những chỉ thị loại này để lập bản đồ gene và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lượng chỉ thị ít do không phải tất cả những tính trạng kiểu hình nào ta cũng có thể nhận diện được, đồng thời độ chính xác và độ tin cậy thấp

2.5.1.2 Chỉ thị isozyme

Là những chỉ thị protein Mỗi protein là sản phẩm biểu hiện của một hay một vài gene, do vậy người ta dựa vào điều này để tìm ra những chỉ thị Dựa vào hàng loạt những enzyme giống nhau được mã hóa bởi những allen khác nhau nằm cùng trên một locus Do sự khác nhau về điện tích của aminoacid, isozyme có thể được phân tách bằng điện di Nhiều enzyme bất biến trong quần thể và hầu hết sự đa hình của những enzyme này chỉ do một vài biến đổi nhỏ Kết quả mà chỉ thị isozyme đem lại khả quan hơn so với chỉ thị hình thái do có số lượng chỉ thị có thể phát hiện được nhiều hơn, tuy nhiên số lượng chỉ thị cũng vẫn ít, không đáp ứng cho những nghiên cứu sâu rộng [2]

2.5.1.3 Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA

Là những chỉ thị phân tử DNA được tạo ra nhờ những kỹ thuật sinh học phân tử Có thể nói rằng kể từ khi con người biết đến sự hiện diện của gene và khi Watson và Crick phát minh ra cấu trúc của chuỗi DNA năm 1955, các kỹ thuật sinh học phân tử được phát minh ngày càng nhiều và càng ngày càng tỏ ra là công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu khoa học do số lượng chỉ thị nhiều hơn hẳn so với 2 loại chỉ thị trên (Tansley và ctv, 1980), độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều Càng ngày người ta càng tìm ra được nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị, tuy nhiên có thể được chia ra làm 2 nhóm:

 Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR (PCR based): RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…

 Kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP

Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân bản nhanh chóng một chuỗi DNA nào đó trong ống nghiệm, phương pháp này có ba axit nucleic: một DNA dây đôi cần phải khuyếch đại, hai sợi đơn đóng vai trò mồi (primer) với kích thước rất ngắn chạy theo chiều thuận và chiều nghịch trên DNA

2.5.2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR

Được miêu tả qua 3 giai đoạn:

 Giai đoạn 1 – Biến tính (denature): Biến tính DNA mạch đôi ở nhiệt độ cao (khoảng 92oC – 96oC) tạo những khuôn DNA mạch đơn có độ dài bằng nhau và bằng DNA mạch đôi tạo ra nó

 Giai đoạn 2 – Bắt cặp (annealing): Gắn các primer vào các khuôn DNA mạch đơn (tạo ra ở giai đoạn 1), dựa trên nguyên tắc bổ sung Primer là các oligonucleotide có khoảng 10 – 25 nucleotide, có trình tự bắt cặp bổ sung với một

C – 56oC

 Giai đoạn 3 – Kéo dài (extension): kéo dài mạch đơn DNA bắt đầu từ

các nucleotide vào với nhau, theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung (A – T, G – C) với những nucleotide của mạch khuôn (DNA template) Kết quả là từ một phân tử DNA ban đầu sẽ cho 2 phân tử DNA hoàn toàn giống nhau và giống với phân tử DNA ban đầu về chiều dài và trình tự các nucleotide Giai đoạn này thường được tiến hành ở 70o

C – 72oC

Phản ứng PCR được tiến hành với sự hiện diện của: đoạn DNA khuôn

đệm (buffer) và máy thermocycler – máy điều khiển chu kỳ nhiệt độ, thực hiện duy trì và luân chuyển nhiệt độ của từng giai đoạn một cách chính xác và ổn định trong một khoảng thời gian chính xác trong 30 – 45 chu kỳ

Hình 2.3: Nguyên lý của phản ứng PCR 2.5.2.2 Quy trình chuẩn của phản ứng PCR

Tiến hành qua 25 – 35 chu kì, trong điều kiện nhiệt độ và nồng độ các chất: Nồng độ các chất trong hỗn hợp PCR:

Nguyên lý kỹ thuật PCR

Từ 30 – 45 chu kỳ Bước 1: Biến tính

Bước 2: Bắt cặp

Bước 3: Nối dài

 Nồng độ enzyme: Thường sử dụng ở nồng độ 0,1 – 0,5 U/25 μl dung dịch

phản ứng Nếu như nồng độ enzyme Taq polymerase quá cao có thể làm phát sinh những sản phẩm không đặc hiệu, còn nếu nồng độ enzyme Taq polymerase quá thấp

thì phản ứng không xảy ra hoàn toàn do không có đủ enzyme

 Các dNTP: Hàm lượng các dNTP trong khoảng 20 – 200 μM cho kết quả ổn định và đặc hiệu Bốn loại dNTP (A, T, G, C) phải có nồng độ gần tương đương nhau

 Hàm lượng MgCl2: Nồng độ tối ưu của MgCl2 cho kết quả PCR tốt Ion Mg+ có thể ảnh hưởng đến:

- Nhiệt độ để biến tính mạch đôi thành mạch đơn

chính xác của primer với DNA khuôn

- Sự đặc hiệu của sản phẩm PCR: bao gồm cả sự bắt cặp chính xác của primer với DNA khuôn và sự nối dài chính xác

- Hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả

Chu trình nhiệt:

như tất cả các đoạn DNA khuôn mạch đôi bị biến tính tách ra thành 2 DNA khuôn mạch đơn phân biệt và không tự bắt cặp lại với nhau

của chu kỳ PCR trước tiếp tục bị làm biến tính để thành DNA khuôn mạch đơn cho chu kỳ PCR tiếp theo

 Nhiệt độ bắt cặp: 55oC (50oC – 56oC) trong 30 giây Nhiệt độ bắt cặp là quan trọng nhất, bảo đảm rằng không quá thấp (do dẫn đến bắt cặp không đặc hiệu) và cũng không quá cao (dẫn đến khó bắt cặp hoàn toàn hay không bắt cặp)

 Nhiệt độ nối dài: 72oC trong 90 giây Thời gian kéo dài phải đủ để có thể kéo dài hoàn toàn một trình tự và hầu hết các đoạn DNA khuôn mạch đơn, nếu không sẽ dẫn đến những kết quả sai lầm do không đủ thời gian để nối dài

Ba bước này lặp lại khoảng 30 – 45 chu kỳ

2.5.2.3 Tối ưu hoá phản ứng PCR

Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR trên DNA của nhiều loại sinh vật khác nhau các nhà khoa học cần phải tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR bởi mỗi loại sinh vật có một đặc trưng riêng Các biện pháp tối ưu đó liên quan đến những vấn đề

 Trình tự của primer: Trình tự của primer xác định kích thước, vị trí của sản phẩm PCR và nhiệt độ Tm, giúp ước lượng được nhiệt độ bắt cặp khoảng Tm – 2 (thường chỉ đúng với những primer có chiều dài nhỏ hơn 20 basepairs)

các nucleotide tương ứng có trong chuỗi primer, tuy nhiên công thức này chỉ để tham khảo hay ước lượng

 Nồng độ các dNTP: mỗi dNTP thường khoảng 200 μM

 Những enzyme DNA polymerase chịu nhiệt: Nên sử dụng ở nồng độ 0,5 U/25 μl đủ để kiểm soát sự đặc hiệu của phản ứng PCR Không nên sử dụng enzyme ở nồng độ cao hơn 2,5 nM (1,25 U/25 μl)

 Chất ổn định hoạt động enzyme (enzyme stabilizer): thường là gelatin ở nồng độ 0,01 % hay Triston X – 100 ở nồng độ 0,1 % trong dung dịch buffer để tồn trữ DNA

 Nồng độ các primer: pimer F (forward primer) và primer R (reverse primer) phải có nồng độ bằng nhau và không nên dư thừa

 Tỉ lệ primer/DNA khuôn: Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng dimer – primer sẽ xuất hiện do lượng DNA khuôn thấp và lượng primer quá cao Ngược lại, sản phẩm PCR không nhiều do không đủ primer cho nhân bản

2.5.3 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lượng và kích thước của những đoạn DNA được tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống được nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA được cắt ra này được lai với những đoạn dò (probe) được đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả được quan sát qua màu huỳnh quang phát ra Sử dụng đoạn dò chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tượng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao [2], [6]

2.5.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến [2], [6]

Một trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông tin về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải được biết rõ trước khi chuẩn bị các primer

tương ứng Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome của một giống cây trồng mới sẽ gặp nhiều khó khăn

Vào đầu thập kỷ 90, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi là RAPD (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác nhau (William, 1990; Welsh và ctv., 1991)

Hình 2.4: Nguyên lý chỉ thị RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền

Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng một primer chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên Thường primer này chứa từ 9 - 12 oligonucleotit, tối thiểu là 4 bp Có hàng ngàn loại primer chứa khoảng 10 bp nhưng số lượng primer dùng trong nghiên cứu này rất hạn chế Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn

Nếu các điểm gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản được (thường 200 - 2000 nucleotide) thì đoạn DNA sẽ được nhân lên Sự có mặt của sản phẩm này được quan sát thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide Các primer dùng trong RAPD có kích thước ngắn nên dễ tìm được các đoạn tương đồng trên các mạch đơn DNA trong genome Vì thế, nó là một

thể Ví dụ, tần số tìm thấy sự đa hình RAPD là 0,3 / 1 primer ở cây Arabidopsis

thaliana là 0,5 / 1 primer ở cây đậu tương, 1 / 1 primer ở ngô (Lê Duy Thành,

2000)

Các ưu điểm chính của chỉ thị RAPD không cần biết trước trình tự nuleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa hình cao, tiến hành chỉ với một lượng nhỏ DNA tính bằng nanogam và trên một số lượng mẫu thí nghiệm lớn Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện đa hình Do đó RAPD thường dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại

Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể tiến hành với các bước như sau:

 Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR  Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid

 Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-pc, UPGMA cluster.) Các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu

Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và nguồn gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng được sử dụng cho những mục đích sau:

 Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó như tính trạng chất lượng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà chua (Tatieni và ctv., 1996; Winter và ctv., 1995)

 Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể  In dấu vân tay (DNA fingerprinting)

 Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal variation) Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng chỉ thị RAPD cũng có một số hạn chế như sau: