Phương pháp PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) (Phản ứng Trùng Phân, Phản ứng chuỗi Polymerase, hay phản ứng PCR). Bản chất của PCR là sự tổng hợp nhân tạo nhằm tạo ra các đoạn ADN mới.

Phương pháp PCR

I Phương pháp PCR1 Khái niệm

PCR (Polymerase Chain Reaction) (Phản ứng Trùng Phân, Phản ứng chuỗi Polymerase, hay phản ứng PCR) Bản chất của PCR là sự tổng hợp nhân tạo nhằm

tạo ra các đoạn ADN mới

Lượng ADN khuôn rất nhỏ khoảng từ 20ng đến 100ng Do lượng ADN cần thiết nhỏ như vậy, nên khi chuẩn bị ADN khuôn phải hết sức chú ý tránh bị lẫn ADN từ các nguồn khác và cần phải có ADN khuôn với độ nguyên vẹn cao

- Nhiệt độ gắn mồi

Trong PCR phải tìm được nhiệt độ thích hợp nhất cho mồi gắn vào ADN khuôn Để xác định nhiệt độ gắn mồi tương đối ban đầu, người ta đã dựa trên những công thức toán khác nhau.

*Đối với những mồi có chiều dài ≤ 20 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức sau:

+ Nồng độ mồi

Nồng độ mồi có thể được sử dụng vào khoảng 100 đến 500 nM Tuy nhiên nồng độ cụ thể phụ thuộc vào từng thí nghiệm và mục đích nghiên cứu Nếu nồng độ mồi quá thấp sẽ không đủ cho phản ứng và nồng quá cao có thể dẫn tới sai lệch kết quả

+ Thời gian gắn mồi

Thời gian gắn mồi vào khuôn thường dao động trong khoảng 30 đến 60 giây Nếu thời gian gắn mồi lâu sẽ gây ra sai lệch kết quả phản ứng do sự gắn mồi không đặc hiệu, hơn nữa sẽ kéo dài thời gian phản ứng làm suy giảm sự hoạt động của enzym Taq

2.3 dNTP

dNTP (A, T, G, C là những “viên gạch” để xây dựng lên sợi ADN mới trong phản ứng chuỗi Nồng độ của dNTP thường sử dụng cho mỗi phản ứng là 200µM Nếu nồng độ dNTP quá cao nó sẽ liên kết với Mg2+, một ion rất cần cho sự hoạt động của enzym tổng hợp, vì vậy mà sẽ ảnh hửng tới phản ứng tổng hợp dNTP rất nhậy cảm với sự thay đổi nhiệt độ, cứ sau 35 chu kỳ của PCR thì dNTP hầu như

đã bị suy giảm; trong một môi trường axít nó sẽ chuyển hoá nhanh thành dNDP và dNMP Do vậy mà dNTP là chất không bền, đặc biệt sử dụng cho PCR.

2.4 Enzym tổng hợp ADN.

Là một thành phần quan trọng của phản ứng PCR Trong điều kiện thích hợp cùng với các thành phần cần thiết khác, enzym hoạt động tổng hợp nên ADN mới Nồng độ sử dụng enzym phụ thuộc vào mỗi loại enzym và thuộc tính của nó; có thể sử dụng từ 1 đến 2 đơn vị enzym sẽ cho hiệu quả tốt nhất với PCR có thể tích 25µl Nếu quá nhiều enzym có thể sẽ làm tăng nồng độ glycerol trong dung dịch phản ứng, dẫn tới quá trình tổng hợp không đồng đều giữa các vị trí và tạo ra hình ảnh điện di không rõ nét Ngược lại, nếu quá ít sẽ thiếu enzym và kết quả nhận được là sản phẩn tổng hợp không đầy đủ

2.5 Dung dịch đệm PCR

Dung dịch đệm chung nhất của PCR bao gồm các thành phần KCl, MgCl2 và Tris Muối KCl góp phần làm tăng hiệu quả của phản ứng, thông thường những mồi cho sản phẩm PCR với kích thước lớn hơn thì hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối thấp hơn và ngựơc lại những đôi mồi cho sản phẩm PCR ngắn hơn sẽ hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối cao hơn MgCl2 là nhân tố cần thiết để enzym Taq hoạt động, nếu nồng độ MgCl2 thấp, sẽ ức chế sự hoạt động của enzym Taq, tuy nhiên nếu nồng độ quá cao sẽ cho kết quả PCR không đặc hiệu Tris có vai trò giữ cho pH dung dịch ổn định, sự thay đổi nồng độ của Tris không ảnh hưởng nhiều đến kết quả phản ứng PCR

2.6 Thể tích phản ứng:

Thể tích không ảnh hưởng tới kết qủa của phản ứng, nếu chúng ta sử dụng ống PCR nhỏ có thành mỏng và sử dụng loại máy PCR không cần dầu để chống bay hơi dung dịch Thể tích phản ứng có thể được điều chỉnh từ 5µl đến 100µl, tuy nhiên nếu với cùng lượng ADN khuôn, thể tích PCR nhỏ sẽ cho nồng độ sản phẩm lớn hơn so với thể tích PCR lớn

2.7 Chu kỳ phản ứng:

Các thí nghiệm cho thấy số chu kỳ cần áp dụng cho một phản ứng từ 25 đến 45 là vừa đủ Nếu tiếp tục tăng số chu kỳ, thậm trí lên tới 60 chu kỳ thì sản phẩm PCR có tăng lên nhưng không đáng kể

3 Nguyên lý phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR (xem file powerpoint)

Khi chúng ta chuẩn bị một dung dịch phản ứng gồm các thành phần cơ bản như: ADN khuôn, dNTP, Mồi (primer), enzym polymerase (Taq), MgCl2 và đệm PCR.v.v Dung dịch phản ứng trong ông PCR được đặt trong máy PCR và hoạt động theo sơ đồ nguyên lý sau:

II Các kỹ thuật PCRADN khuôn 5’3’

ADN khuôn biến tính

Mồi gắn v o àADN khuôn

(35oC - 65oC)

Tổng hợp ADN (72oC)

3’5’

Một số kỹ thuật đang được ứng dụng phổ biến trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật gồm: (1) Kỹ thuật RT-PCR; (2) Kỹ thuật RAPD; (3) Kỹ thuật AFLP; (4)

Kỹ thuật STS; (5) Kỹ thuật CAPS; (6) Kỹ thuật SSR (xem file powerpoint)

1 Kỹ thuật RT-PCR

RT-PCR (reverse transcription PCR) là kỹ thuật dùng để tổng hợp cADN từ mARN Kỹ thuật này được tiến hành như sau: trước tiên, người ta tách ARN thông tin từ tế bào, sau đó tiến hành phản ứng PCR để phiên mã ngược từ ARN thành cADN, ở giai đoạn này các thành phần tham gia phản ứng vẫn tương tự như PCR thông thường, chỉ trừ enzym tổng hợp người ta phải sử dụng loại sao mã ngược (reverse transcriptase) để tổng hợp ra sợi cDNA, quá trình tổng hợp được thực hiện ở 370C Sau khi có sợi cADN, sợi này sẽ được làm khuôn để nhân bội nhiều bản sao qua một qui trình PCR thông thường Thường người ta tiến hành hai quá trình phiên mã ngược và nhân bội cùng nhau bằng cách bố trí một phản ứng với hai loại enzym và hai loại mồi PCR (một loại để sao mã ngược và một loại để nhân bội), còn các thành phần khác vẫn không đổi

2 Kỹ thuật RAPD

RAPD là viết tắt của cụm từ tiếng Anh: Randomly Amplified Polymorphic DNA (Đa hình ADN dược nhân bản ngẫu nhiên) Nó là kỹ thuật được xây dựng dựa trên nguyên lý PCR, với những mồi được thiết kế ngẫu nhiên có chiều dài khoảng 10 nucleotide Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào ADN khuôn ở bất kỳ vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó Phản ứng sau đó xảy ra với sự tham gia của enzym Taq, dNTP và các thành phần khác Kỹ thuật này chỉ sử dụng một lượng nhỏ ADN khuôn (khoảng 25ng) Sản phẩm PCR được điện di trong gel agarose và phát hiện bằng cách nhuộm với dung dịch ethidium bromide, kích thước sản phẩm có chiều dài từ 200bp đến 2000 bp Về cơ bản, chỉ thỉ RAPD là một chỉ một chỉ thị trội, nghĩa là chỉ thị này không phân biệt được giữa những cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử trong quần thể F2

RAPD là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thời gian, ít tốn kém Kỹ thuật này rất phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản đồ gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line) Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật RAPD đó là nó rất nhậy cảm với nhiều yếu tố như: các thành phần tham gia phản ứng và đặc biệt là nhiệt độ gắn mồi, vì yếu tố gắn mồi mà có thể có hai kết quả khác nhau với cùng một thí nghiệm sử dụng hai máy PCR khác nhau Để hạn chế nhược điểm này, cần phải tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện thí nghiệm và phải tiến hành đồng bộ giữa các lần thí nghiệm.

Qui trình và ví dụ minh họa

- Các thành phần PCR

- Chu kỳ nhiệt của phản ứng

B1: Nhiệt độ tiền biến tính 950C, thời gian 5 phút

B2:Nhiệt độ biến tính 940C, thời gian 1 phút

B3: Nhiệt độ gắn mồi 350C, thời gain 30 giây

B4:Nhiệt độ tổng hợp 720C, thời gian 2 phút

3 Kỹ thuật SSR (Single Sequence Repeat hay Microsatelite)

Khi nghiên cứu genom của một số sinh vật người ta đã phát hiện ra những đoạn ADN có chiều dài khác nhau phân bố một cách ngẫu nhiên mà trình tự của nó bao gồm các nhóm nucleotide giống nhau nhắc lại nhiều lần; các nhóm này thường có số lượng không vượt quá 5 nucleotide ví dụ như (TG)n hoặc (AAT)n ở lúa các nhóm nucleotide đã phát hiện được gồm GA, GT, CAT, CTT Những đoạn ADN lặp lại như vậy được gọi là Microsatelite hay còn có các tên khác như: SSLPs (single sequence length polymorphisms), SSRs (simple sequence repeats), STRs (short tADNom repeats) Các đoạn ADN nhắc lại này có rình tự hai đầu rất đặc trưng cho mỗi đoạn; bởi vậy mà trình tự đặc trưng ở hai đầu của đoạn nhắc lại này đã được sử dụng để thiết kế mồi cho PCR Do có sự khác nhau về chiều dài giữa các đoạn nhắc lại, bởi vậy mà kỹ thuât nhận dạng ADN Microsatelite rất phù hợp trong nghiên cứu đa hình; lập bản đồ và phân lập gen Cũng giống như kỹ thuật RAPD, kỹ thuật SSR đơn giảm, thuận tiện, không tốn kém; mặt khác

Microsatelites là chỉ thị đồng trội nên nó được sử dụng để phát hiện cá thể dị hợp tử và lập bản đồ gen sử dụng quần thể F2.

Qui trình và vi dụ minh họa

- Chu kỳ nhiệt của phản ứng

B1: Nhiệt độ tiền biến tính 95oC, thời gian 5 phút

B2:Nhiệt độ biến tính 94oC, thời gian 1 phút B3: Nhiệt độ gắn mồi 35oC, thời gain 1 phút

B4:Nhiệt độ tổng hợp 72oC, thời gian 2 phútB5: 72oC trong 7 phút

Các bước B2, B3, B4 được lặp lại 35 lần và bước B5 ở 720C trong 7 phút để tất cả các đoạn ADN có thể được tổng hợp hoàn thiện

- Điện di và phát hiện sản phẩm

Sản phẩm PCR có thể được điện di trong gel agarose 3% và phát hiện bằng nhuộm ethidium bromide (hình 1A) hoặc điện di trong gel polyarylamide và phát hiện bằng cách nhuộn bạc.

4 Kỹ thuật AFLP- Nguyên lý AFLP

Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphim) được phát triển dựa trên nguyên lý PCR để nhân bản những đoạn ADN đã được phân cắt bởi enzym giới hạn (restriction enzyme) Điểm cơ bản nhất của kỹ thuật này đó là sự thiết kế mồi PCR đặc trưng Qui trình thiết kế mồi PCR được tiến hành như sau trước tiên, ADN tổng số được cắt bởi các enzym giới hạn; hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng hai enzym EcoRI (enzym nhận biết 6 nucleotit) và MseI (enzym nhận biết 4 nucleotit) Khi sử lý với enzym giới hạn, ADN sẽ bị cắt thành vô số mảnh có kích thước khác nhau mà mỗi mảnh ta đều biết được trình tự nucleotide của chúng ở hai đầu cắt Dựa vào trình tự đã biết ở đầu cắt, ta thiết kế các đoạn gắn (adapter) và gắn chúng vào mỗi đầu Dựa vào trình tự adapter người ta thiết kế mồi PCR, mồi gồm hai phần: một phần có trình tự nucleotide bổ sung với adapter và phần còn lại là những nucleotide đựơc thêm vào tuỳ ý, thông thường từ 1 đến 3 nucleotide Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự ở hai đầu bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản Do kết hợp được những đặc điểm của kỹ thuật RFLP và kỹ thuật RAPD nên kỹ thuật AFLP có nhiều ưu điểm như:

đơn giản, ổn định, khả năng ứng dụng rộng và do có thể bổ sung các nucleotide khác nhau khi thiết kết mồi nên số lượng mồi có thể thiết kế được và tiềm năng ứng dụng rất lớn Về cơ bản AFLP là chỉ thị trội và vị trí nhiễm sắc thể của chúng chưa xác định, do vậy nếu dùng chỉ thị này để lập bản đồ gen ở quần thể F2 thì cần phải sử dụng kết hợp với các chỉ thị khác đã biết trước vị trí nhiễm sắc thể như: RFLP hoặc microsattelite

Qui trình và ví dụ minh hoạ của kỹ thuật AFLP

S1 Xử lý enzym giới hạn

ADN tổng số được cắt bởi các enzym giới hạn, thường là hai enzym EcoRI

và MseI để tạo thành các đoạn nhỏ gọi là đoạn hay mảnh giới han Ví dụ dưới đây được tiến hành trên một số cây trồng như lúa, ngô, lúa mỳ Phản ứng cắt được pha trộn với các thành phần sau:

- Đoạn ADN giới hạn 5µl- EcoRI adapter (5pmol/µl) 1µl- MseI adapter (50pmol/µl) 1µl- Enzym gắn ADN T4 (350u/µl) 0,08µl

Bước này có mục đích nhân bội những mảnh ADN đã được gắn adapter để tạo thành nhiều mảnh làm khuôn cho các bước nhân bội chọn lọc tiếp theo ở bước

này sử dụng hai loại mồi PCR gồm: mồi tiền EcoRI và mồi tiền

AFLP-MseI, những mồi này có trình tự bổ sung chính xác với phần adapter (hoặc cộng

thêm một vài nucleotide tùy ý).

B4: Sản phẩm cuối cùng của phản ứng được bảo quản ở 40C

Sản phẩm tiền nhân bội được pha loãng xuống 50 lần và được sử dụng làm ADN khuôn cho bước nhân chọn lọc

4 Nhân bội chọn lọc

Sau khi đã có ADN khuôn nhận từ giai đoạn tiền PCR, chúng ta tiến hành PCR chọn lọc sử dụng cặp mồi EcoRI và MseI bổ sung với adapter và có những nucleotide thêm vào đầu 3’ của chúng Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự bổ sung hoàn toàn với mồi mới được nhân bội, các đoạn khác mồi chỉ bổ sung với phần adapter mà không bổ sung với các nucleotide đặt

thêm thì sẽ không được nhân bội Sản phẩm PCR trong giai đoạn này gọi là sản phẩm nhân bội chọn lọc

- Chu kỳ nhiệt

B1: một chu kỳ gồm:940C 30 giây680C 30 giây720C 1 phútB2: 17 chu kỳ

940C 30 giây680C* 30 giây720C 1 phút

*Giai đoạn gắn mồi (680C) ở mỗi chu kỳ bị giảm xuống 0,70C

B3: 23 chu kỳ gồm:940C 30 giây560C 30 giây720C 1 phútB4: 720C 10 phútB5: 40C

5 Điện di và phát hiện sản phẩm

Sản phẩm AFLP được điện di trong gel polyacrylamide sau đó nhuộm bạc, dung dịch ethidium bromide hoặc vistra green để phát hiện các băng ADN (hình 1B, hình 2)

5 Kỹ thuật STS

STS (Sequence Tagged Sites) có thể được xem như là một kỹ thuật thay thế RFLP và RAPD Trong các kỹ thuật ADN thì RFLP rất phức tạp, tốn kém và khó thực hiện nhất; trong khi đó RAPD lại được xem như một kỹ thuật không ổn định, kết quả có thể không đồng nhất nếu thực hiện phản ứng trong cùng điều kiện nhưng ở hai máy PCR khác nhau Để khắc phục những nhựơc điểm này, người ta đã xây dựng kỹ thuật STS Nguyên lý của STS đó là: trước tiên người ta xác định trình tự các nucleotide ở hai đầu của các đoạn ADN sử dụng làm mẫu dò trong kỹ thuật RFLP và sản phẩn RAPD; sau đó dựa vào trình tự đã xác định, người ta đã thiết kế những mồi PCR có chiều dài khoảng 18 đến 20 nucleotide Với những mồi như vậy, chúng có thể tổng hợp nên những đoạn ADN nằm trong vùng sản phẩm RFLP và RAPD Vì dựa trên nguyên lý PCR nên dễ thực hiện, không tốn kém, hơn nữa lại sử dụng mồi đặc hiệu nên kết quả ổn định Qui trình kỹ thuật STS cũng tương tự với SSR, tuy nhiên có một số điểm cần điều chỉnh cho phù hợp chẳng hạn như nhiệt độ gắm mồi

6 Kỹ thuật CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)

Do sự đa hình giữa các cá thể sinh vật được xác định dựa vào kết qủa so sánh kích thước các băng ADN của chúng, vì vậy mà sản phẩm PCR gồm các băng ADN của các mẫu sinh vật có thể không khác nhau về kích thước nhưng lại có thể khác nhau về trình tự sắp xếp các nucleotide Từ lý giải nói trên, các nhà khoa học đã sử dụng các enzym giới hạn để cắt sản phẩm RAPD, STS., SSR nếu trình tự nucleotide của các sản phẩm đó chứa vị trí nhận biết của enzym nào đó thì nó sẽ bị cắt tại đó Sự đa hình sẽ được phát hiện khi sản phẩm cắt được tiếp tục được điện di trong gel Sau đây là qui trình và ví dụ của kỹ thuật CAPS khi cắt sản phẩm STS.

Xử lý enzym giới hạn tiến hành như sau:1 Sản phẩm STS 10µl

2 Đệm cắt 1,5µl3 Enzym giới hạn 10 đơn vị

4 Cho thêm nước cất khử trùng tới thể tích là: 15µl.

Phản ứng cắt được thực hiện ở 370C từ 2 đến 12 giờ Sản phẩm cắt được điện di trong gel agarose ở 120V khoảng 2 đến 3 giờ; các băng ADN sẽ được phát hiện bằng nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide Hình dưới là kết quả điện di của cùng một sản phẩm STS và được cắt với các ezim khác nhau; chỉ có 2 enzym PstI và KpnI cho phản ứng cắt sản phẩm STS; tuy nhiên chỉ có enzym KpnI là cho đa hình giữa hai mẫu