Tìm hiểu nấm mốc Peniccilium roqueforti

Tìm hiểu nấm mốc Peniccilium roqueforti

HUỲNH THỊ DIỆU HIỀN

MỤC LỤCLời nói đầu

Phần I

Tổng Quan Về Penicillium Roqueforti

I Lịch sử phát hiện 4

II Phân loại khoa học 4

III Đặc điểm nhận dạng 6

IV Đặc điểm sinh hoá 9

Phần II Các Phương Pháp Xác ĐịnhI Phương pháp truyền thống 8

II Các phương pháp hiện đại 1 Phương pháp PCR 22

2 Phương pháp RAPD 25

Phần III: Kết Luận

LỜI NÓI ĐẦU

Trong những năm gần đây với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, quá trình địnhdanh cho nhiều loài vi sinh vật cũng như dễ dàng hơn với thiết bị hiện đại hơn.Nhiểu loại vi sinh có lợi, hại đều được biết đến rõ ràng hơn Trong những năm visinh học phát triển một loài sinh độc tố nhưng có ít trong đó có loại nấm mốc

Peniccilium roqueforti được xác định từ trong sản phẩm phomat xanh vốn quen

thuộc với dân châu Âu Penicilium roqueforti được các nhà khoa học tìm hướngđi mới ngoài việc sử dụng để sản xuất phomat xanh.

PHẦN I : TỔNG QUAN TÀI LIỆUI LỊCH SỬ PHÁT HIỆN

Đầu tiên được mô tả bởi Thom

vào năm 1906, Penicillium roqueforti

thoạt đầu là một loài hỗn tạp của nấmxanh sinh bào tử Chúng được chiathành các nhóm loài khác nhau dựatrên sự khác biệt về kiểu hình, và sauđó chúng được kết hợp thành mộtloài bởi Raper và Thom

Nhóm Pencillium được phân loại lại vào năm 1996 dựa vào sự khác nhau của

dãy DNA ribosom và đặc tính chuyển hoá thứ cấp Trước đây được chia thành hai

loại khác nhau – một là được dùng cho phomat ( Penicillium roqueforti var.

roqueforti) và một là tạo patulin.

II PHÂN LOẠI KHOA HỌC

Giới: Nấm Ngành: Ascomycota

Lớp: EurotiomycetesBộ: EurotialesHọ: Trichocomaceae

(Penicillium roqueforti var carneum), Penicillium roqueforti được phân loại thànhba loài là Pencillium roqueforti, Penicillium carneum và Penicillium paneum.

III ĐẶC ĐIỂM

1.Đặc điểm hình thái

Hình ảnh Penicilium roqueforti

Penicilium roqueforti là loại mốc có màu xanh, có cuốn đính bào từ, sinhbào tử, sinh sản hữu tính, hình sợi, thuộc ngành nấm nang.

Qúa trình hợp giao tử (A – F) ; Toàn giao (Hologamy)(G – J); Tiếp xúc giữa 2 giao tử (K– L); Tự giao (autogamy)(M – N: sinh sản ở nấm mốc.

2.Đặcđiểm bào tử

Bào tử của nấm mốc Peniciliumroqueforti : hình cầu gần nhưhình tròn, bề mặt tròn nhẵn(kíchthước 3,5- 5,5 µm), không cómàng tế bào.

Cuống dài 100-200 x 4-5,5,….

Khuẩn lạc Penicilium roqueforti

Bào tử Penicilium roqueforti

3.Môi trường sống

Đặc điểm trên môi tổng hợp:

Penicillium roqueforti chỉ là một loài của Penicillium mà nó có thể phát

triển trên môi trường chứa 0-5% acid acetic, ở nồng độ rượu cao, và ở nồng độoxy thấp (nói rõ trong phần sau) Khuẩn lạc trên môi trường Czapek thạch vàMEA 25oC phát triển rất nhanh chóng, đường kính đạt 4-5 cm, trong vòng 14ngày, các bào tử có các cuống mọc dày đặc, mượt, Màu xanh xanh, sau đó trở nêntối hơn Dịch tươi do loài này tiết ra trong như giọt pha lê Mùi không rõ nét Sauđó môi trường thay đổi màu sắc từ màu xanh sang xanh đậm Cuống bào tử đínhkích thích 100-200 x 4,0-6,5 μm Hạt bào tử đính trong cột lỏng lẻo,hình cầu, màum Hạt bào tử đính trong cột lỏng lẻo,hình cầu, màuxanh lục, nhẵn-tường, chủ yếu là từ 4-6 mm, có khi đến 8mm.

Phân bố trong tự nhiên:

Roqueforti Penicillium là một loại nấm hoại sinh phổ biến , nó thì tồn tại

khắp nơi trong tự nhiên và có thể được phân lập từ đất, các chất hữu cơ phân hủyvà các bộ phận của cây Ngoài ra, chúng được tìm thấy trong ẩm ướt, hầm tối,

Hình ảnh

P.roqueforti

đến vườn đất và tán lá, mà còn trong phòng tắm, nước, đường ống, con dấu cao su,ngưỡng cửa sổ, thảm, nệm và đồ nội thất…

4.Tốc độ phát triển

Tốc độ phát triển nhanh trên các môi trường và đạt kích thước sau: CYA:34-55mm, MEA: 35-56 mm, YES: 47-74 mm Khuẩn lạc của Penicilium roquefortiphát triển rất tốt trên môi trường acid acetic : 0,5%, và cũng phát triển tốt trênCREA thích hợp trên môi trường acid.

IV ĐẶC TÍNH SINH HOÁ

1.Sinh hợp chất thứ cấp

1.1 Penicilium roqueforti là loài sinh ra hợp chất thứ cấpmarcfortines và fumigaclvine A.

Marcfortines từ Penicilium roqueforti

Những tư liệu về những hợp chất này tạm thời chưa được rộng nên khó khăn trongviệc lấy nó làm tư liệu.

1.2 Độc tố PR và eremofortin C

Là chất chuyển hóa thông thường của Penicilium roqueforti Các cấu trúc

hóa học của hai hợp chất liên quan chặt chẽ với nhau và khác nhau chỉ bởi mộtaldehyde và một nhóm acohol tại vị trí C-12

Định tính, định lượng độc tính enzyme:

Các hoạt động tối đa các enzym trong các môi trường đã được tìm thấy vừa xảy ra vào ngày 13 tính từ khi bắt đầu thí nghiệm, trong đó tương ứng cực đại của PR trong vật chứa độc tố Enzyme này được phân lập và tinh chế từ các môi trường và vừa khuẩn ty thể của nấm tương ứng thông qua một thao tác liên quan đến amoni sulfat và fractionation DEAE-cellulose sắc ký.

Sản lượng đã được 33,3 và 21,6% cho các enzym có hoạt tính trung Độ pHtối ưu cho enzym khi pH 5,6 Khi nó xúc tác sự chuyển đổi ở 30 ° C và phân rã vớithời gian phản ứng khi ở nhiệt độ cao Ở 100 ° C, hoạt động của enzyme đã hoàntoàn bị mất Các K và Vmax của các enzym như được xác định ở 30 ° C là 0,02mM và 4.0, umol / phút mỗi mg, tương ứng Trọng lượng phân tử của enzyme đãđược ước tính bằng cách lọc ,áp suất sắc ký lỏng thu được là I-250 protein đến40.000 Độc tố PR và eremofortin C (EC) là chất chuyển hóa thứ cấp của nấm

Penicillium roqueforti, những độc tố này gây nguy hiểm cho những người sử dụng

sản phẩm phomat bị nhiễm penicilium roqueforti.

Hình: phân tích chất độc bằng phương pháp HPLC sự hoạt động của độc

tính trong Penicilium roqueforti.

Kể từ khi phát hiện và cô lập PR độc tố , nó làm sáng tỏ độc tố nấm mốccon đường tổng hợp sinh học của các độc tố khác có liên quan và chuyển hóa qualại lẫn nhau.

Cấu trúc của PR :

2.Oxy hoá các acib béo

Khả năng của nấm để ôxi hóa của các axit béo chuỗi trung bình được thu

Ketones methyl lần đầu tiên được ghi nhận, người đã cho thấy Penicilliumroqueforti và hai loài của chi Aspergillus sản xuất Ketones methyl khi nuôi vi nấm

trong vài tuần trong môi trường acid béo Năng lực của các bào tử của P.

roqueforti để tạo Ketones methyl nhanh chóng biến mất dần dần khi bào tử nảy

mầm.Tỷ lệ sự hình thành của 1-2-heptan trong những axít octanoic do sự không

hoạt động P.roqueforti đã được tăng lên đáng kể bằng cách thêm những axít amin

và đường khi kích thích nảy mầm của các bào tử

Phương pháp:

Gehrig & Knight (1963) đã tăng trưởng của khuẩn ty thể Penicillium roquefortitrên phương diện hóa học trong đó có cả acetate và oleate Ban đầu ở pH 4,0 thểkhuẩn ty ở pH 4,0 lần ít hoạt động trong ôxi hóa axít béo hơn khoảng 5 sự pháttriển ở pH 6,5

Công thức một số loại chất độc do Penicilium roqueforti sinh tổng hợp

Môi trường

Ammonium nitrate, 2 g ; Magiê sulfat (MgSO, 7H, O), 0,1 5 g ; Kali clorua, 0,25 g ; Sắt sulfat (FeSO, 7H20), 0,0125 g

Tăng trưởng của khuẩn ty thể:

Bào tử của Penicillium roqueforti đã được nhân giống trên môi trường Dox agar (Oxoid) Sau 5-6 ngày các bào tử đã được chuyển giao cho 100 ml củatrung bình trong 500 ml trong Erlenmeyer Flasks Việc nhân giống được ủ quađêm, để cho phép bào tử nảy mầm trong 24 giờ Nồng độ của khuẩn ty thể phatrộn đã được điều chỉnh để khoảng 10 mg / ml Wt khô, nồng độ chính xác được xác định bằng cách đo lường trọng lượng khô

Czapek-Hình 1: Sự hấp thu oxy ở pH 5,2 do khuẩn ty thể của roqueforti Penicillium

3.Độc tính:

Penicilium roqueforti sinh độc tố roquefortine Độ độc thấp của roquefortine C đã

được tìm thấy trong pho mát xanh nhưng nồng độ chính xác đã không báo cáo Scott và Kennedy (1976) tìm thấy nồng độ roquefortine lên đến 6,8 mg / kg trong các mẫu phó mát xanh trên thị trường mà họ kiểm tra Trong thực tế,độc tính

roquefortine tạo ra bởi hầu hết các chủng của P roqueforti được phân lập từ phô

mai xanh Một tỷ lệ nhỏ các chủng tìm thấy từ thịt cũng tạo ra roquefortine

Khả năng gây bệnh của Penicillium roqueforti là rất thấp, thậm chí là ít cơ

hội gây bệnh Giá trị LD50 của roquefortine khoảng 10 mg / kg được thử nghiệm

trên chuột Cho bò ăn ngô bị nhiễm P roqueforti làm bò biếng ăn, và viêm

đường ruột

Con người tiếp xúc độc tính đó qua da và đường hô hấp và tiêu hoá Một trường hợp được Campbell et al (1983) mô tả về một bệnh nhân làm việc tại

một nhà máy, nơi pho mai xanh được sản xuất bằng cách sử dụng Penicillium

roqueforti Triệu chứng là ho, khó thở, khó chịu, thể tích phổi giảm Penicillium

Roqueforti có thể gây ra phản ứng dị ứng như sổ mũi, ho, hắt hơi, nổi mề đay,

hoặc bệnh suyễn Không có bằng chứng để kết luận độc tính roquefortine có khả năng gây ung thư.

V ỨNG DỤNG

Sản xuất poliscchacarides, sản xuất hợp chất thứ cấp,….

1.Sản xuất Exo-polygalacturonase (Exo-p):

Dựa trên môi trường kem dầu bí ngô (PuOC ) kết hợp bổ sung lúa mì, cám

(WB), và vi nấm mốc Penicilium roqueforti, nhằm thực hiện quá trình lên men bề

mặt bán rắn SSF.

Hình trên cho thấy : Khả năng tổng hợp của Penicilium roqueforti sản sinh

Exo- P, trên môi trường PuoC Exo-P tăng từ đầu quá trình và đạt những giá trị tối đa là 1452U/g.d.w

2.Sản xuất protease trong sản xuất phomat xanh, Roquefort,Stilton

Khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa và protein

2.1 Phomat xanh(Stilton):

Stilton là một pho mát kem với làn vân màu xanh, và nó có một hương vịđặc trưng, với khả năng chống oxy hoá Stilton là một loại phomat làm từ sữa tiệttrùng Sữa được bổ sung nấm mốc roqueforti, thêm muối và không ép khuôn đểsản phẩm có kết cấu lỏng lẽo, để nấm mốc phát triển tự nhiên ăn lan thành cácđường vân trước khi thành phẩm.

2.2 Roquefort

Roquefort là sản phẩm lên men từ sữa cừu hoà với nước nóng ở 32o C , sảnphẩm đông tụ nhờ các enzyme protease( trong đó một là pepsin), giai đoạn này

người ta bổ sung vi nấm Penicilium roqueforti

Phô mai này sau đó tăng trưởng và phát triển ở nhiệt độ thích hợp là 8oC,với điều kiện nhiệt độ Roquefort sinh trưởng thoát hơi CO2 trong quá trình lênmen.

Phomat xanh

Sản phẩm sau đó được đóng gói và bảo quản trong điều kiện thiếu O2.

Hình ảnh sản phẩm Roquefort

PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNHI XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG

1.Phân tích định tính

- Môi trường sử dụng:

SDB: Sabouraud’s Dextrose Broth Thành phần môi trường gồm có:

Polypeptone hoặc neopeptone :10g Dextrone: 40 g

Nước cất: 1000ml ph= 5,8

SDA: như môi trường SDB trên nhưng thêm 15- 20g agar Phân phối vào

đĩa petri sau khi hấp khử trùng.

MEA: malt extract agar

Cao malt 30gAgar 20g

Nước cất 1000ml

Hấp khử trùng, phân phối vào đĩa petri pH= 5,5

Hình ảnh:a) khuẩn lạc sau một tuần trên Hình c,d: miếng phó mát Roquefort trongđó khuôn được thấy như tĩnh mạch sẫm màu (màu xanh) trong phô mai.

PDA: Potato Dextrose Agar Thành phần:

Potato infusion 200gDextrone 20 gAgar 20g

Nước cất 1000ml.

Môi trường trên chỉ xác định nấm mốc, muốn định danh Peniciliumroqueforti cần môi trường CYA(môi trường thạch Czapek Yeast Autolysate),YES Khuẩn lạc phát triển trên môi trường CYA: làm môi trường chuyển từ màuvàng kem sang màu nâu nhạt Khuẩn lạc có màu xanh nhạt.Trên môi trường YES:khuẩn lạc làm môi trường từ vàng nhạt sang màu nâu Khuẩn lạc có màu xanh lục.

2.Phân tích định lượng:

Quy trình:

Penicilium roqueforti trên YESPenicilium roqueforti trên CYA

Đồng nhất và pha loãng mẫu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4….↓

Trãi 0,1 ml mẫu lên đĩa DRBC hoặc DG18, ủ ngữa đĩa ở 25oC, 5-7 ngày↓

Đếm khuẩn lạc nấm mốc, tính mật độ(CFU/g)↓

Cấy lên môi trường ống thạch nghiêng SDA, ủ 30 độ, 7 ngày↓

Định danh( môi trường CYA, YES)Môi trường:

DGBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol agar Thành phần

gồm có:

Glucose 10gPeptone 5gKH2PO4 1gMgSO4 0,5g

Rose bengal( dung dich5 5%, w/w trong ethanol) 1ml

Dichloran (0,2%(w/w) trong ethanol) 1ml(2,6- nitroaniline)

dichhloro-4-Chloramphenicol 0,1gAgar 15g

Nước cất 1000ml

Ph= 5,6 Môi trường đỗ đĩa petri.

Môi trường DG18: dichloran 18% glycerol agar Thành phần:

Glucose 10gPetone 5gKH2PO4 1g

Dichloran (0,2%(w/w) trong ethanol) 1ml(2,6- nitroaniline)

dichhloro-4-MgSO4 0,5g

Chloramphenicol 0,1gGlycerol 220g

Nước cất 800mlAgar 15g

Hai môi trường trên pha lẫn các chất trừ chloramphenicol, hấp khử trùng,để nguội 50 độ sau đó thêm chloramphenicol(1ml/100ml môi trường), Glycerol220g.

Tiến hành định danh cho loài nấm mốc Penicilium roqueforti bằng môi

trường CYA,YES.

II XÁC ĐỊNH P.ROQUEFORTI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI

1. Xác định bào tử Penicilium roqueforti bằng phương pháp PCR

Phương pháp lấy mẫu không khí tích hợp và phân tích DNA để phát hiện

các bào tử nấm Penicilium roqueforti

Tóm tắt:

Bào tử P.roqueforti được thu thập trực tiếp vào ống Eppendorf sau đó

ngâm huyền phù trong dung dịch 0,1% Nonidet P-40 và được tính bằng cách sửdụng kính hiển vi, dung dịch sẽ pha loãng mẫu với các nồng độ pha loãng khácnhau tuỳ theo số bào tử đếm được Ba phương pháp đã được sử dụng sản xuấtDNA để thử nghiệm PCR: thêm các bào tử chưa bất hoạt để PCRs, ) sử dụng cáchạt Ballotini phá vỡ các bào tử (khe nứt của bức tường bào tử để phát phản ứng),và phá vỡ các bào tử DNA sau tinh chế Số lượng thêm các bào tử bất hoạt vàokhông được nhỏ hơn 1000 Sau đó bằng cách phá vỡ các bào tử, có hoặc không có

tinh chế DNA, Penicilium roqueforti đã có thể phát hiện DNA từ một bào tử duynhất P roqueforti bào tử được thêm vào từ không khí các mẫu nồng độ cao củacác bào tử nấm không rõ nguồn gốc: phấn hoa, bụi đã làm giảm độ nhạy phát điện.

Tuy nhiên, bằng cách sử dụng DNA tinh khiết, nó đã có thể phát hiện 10 loại bào

tử P Đối với tất cả các phương pháp tách chiết DNA, PCR lồng nhau được nhạy

cảm hơn so với bước đơn PCR hoặc PCR theo sau phương pháp Southern blotting.

Vật liệu và phương pháp:

Kết quả và định lượng P roqueforti spores roqueforti bào tử: phản ứngxác định số lượng bào tử trên chủng P roqueforti C2709 cô lập từ hạt lúa mì tại

Rothamsted(Anh), Nó được cấy trên bông thấm bấc ngâm trong dextrose agarkhoai tây (Oxoid Ltd, Basingstoke, Vương quốc Anh) và ủ ở 25 ° C Các bào tửđã được ngâm điều chỉnh để 2 × 10 4 bào tử / ml, pha loãng với cơ số log 10

Chuẩn bị mẫu Air spiked( mẫu trong dịch huyền phù) để kiểm tra hiệu quảcủa chất nền: sử dụng cơn bão thu nhỏ lấy mẫu không khí đã được sử dụng để thuthập mẫu từ không khí xung quanh thành ống Eppendorf khoảng 1,5 ml( mẫukhông khí đã được lưu giữ khô ở nhiệt độ phòng cho đến khi sử dụng) Các mẫuthu thập được treo huyền phù trong 1 ml 0,1% Nonidet P-40 của vortexing trong 2phút Các mẫu pha loãng ở nồng độ khoảng 9 × 10 5 / ml

Tinh sạch DNA P.roqueforti và hệ sợi của nó:

Bốn phương pháp chuẩn bị mẫu được sử dụng cho phân tích PCR : 5 μm Hạt bào tử đính trong cột lỏng lẻo,hình cầu, màuL của dịch huyền phù bào tử được thêm vào ống PCR

 200 μm Hạt bào tử đính trong cột lỏng lẻo,hình cầu, màuL của dịch huyền phù được phá vỡ và 5 μm Hạt bào tử đính trong cột lỏng lẻo,hình cầu, màuL bào tử đã được thêm vàoống PCR

 DNA được chiết xuất từ 50 μm Hạt bào tử đính trong cột lỏng lẻo,hình cầu, màuL của các mẫu bào tử bị phá vỡ, một phần đãđược hòa tan trong 50 μm Hạt bào tử đính trong cột lỏng lẻo,hình cầu, màuL của nước cất vô trùng, và 5μm Hạt bào tử đính trong cột lỏng lẻo,hình cầu, màuL của dịch huyền phù, kếtquả DNA đã được thêm vào ống PCR

50 μm Hạt bào tử đính trong cột lỏng lẻo,hình cầu, màuL của dịch huyền phù được phá vỡ bào tử, DNA được tách ra và hòatan trong 5μm Hạt bào tử đính trong cột lỏng lẻo,hình cầu, màuL của nước cất vô trùng, và toàn bộ các mẫu đã được thêm vào ốngPCR

Cách 3 được gọi là chiết xuất DNA quy mô lớn, và cách 4 được gọi là chiếtxuất DNA quy mô nhỏ.

Sự phá vỡ các bào tử bằng cách lắc treo bào tử với 0,2 g acid-rửa hạtBallotini (8,5point, đường kính 400-455 μm Hạt bào tử đính trong cột lỏng lẻo,hình cầu, màum) cho 8 phút trong một máy nghiền.