Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bảo quản rượu nếp than sản xuất bằng công nghệ enzyme và nấm men thuần chủng

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bảo quản rượu nếp than sản xuất bằng công nghệ enzyme và nấm men thuần chủng

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

quá trình bảo quản rượu nếp than sản xuất bằng công nghệ enzyme và nấm men thuần chủng” do Trần Thị Hồng Chúc thực hiện và báo cáo, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

Cán bộ hướng dẫn Hội đồng phản biện

Nguyễn Công Hà

LỜI CẢM TẠ

Em xingởi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô trong phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài này, các thầy cô đã tận tình và hỗ trợ đến mức có thể nhằm giúp em hoàn thành tốt luận văn này

Đặc biệt, em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến thầy Nguyễn Công Hà đã tận tình chỉ dạy, giúp em tích lũy được những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian qua

Cuối cùng xin gởi đến quí Thầy Cô và tất cả ban bè lời chúc tốt đẹp nhất

Sinh viên thực hiện

Trần Thị Hồng Chúc

TÓM TẮT

Kết quả của mục tiêu nghiên cứu đề tài này sản phẩm sau khi lên men có chất lượng và đạt yêu cầu, đồng thời tìm ra điều kiện bảo quản thích hợp cho sản phẩm ruợu nếp than nhằm cải tiến chất lượng của rượu

Đề tài nghiên cứu này đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α- amylase đến hàm lượng đường khử, độ Brix theo thời gian trong quá trình đường hóa và khảo sát ảnh hưởng của chất bảo quản, bao bì, nhiệt độ đến chất lượng của sản phẩm rượu nếp than theo thời gian

Trong quá trình nghiên cứu và thực hiện thí nghiệm chúng tôi thu được kết quả sau: Nồng độ khi sử dụng α- amylase và glucoamylase trong quá trình đường hóa lần lượt là 0,3% và 0,4%, thời gian thích hợp nhất trong quá trình thủy phân bằng α- amylase và glucoamylase là 30 phút tương ứng

Trong quá trình bảo quản sản phẩm rượu nếp than ta thấy: nhiệt độ 100C giữ màu của sản phẩm tốt hơn nhiệt độ 280C

Màu chai không ảnh hưởng đến chất lượng rượu trong thời gian bảo quản 12 ngày Sử dụng acid sorbic sẽ giữ màu anthocyanin tốt hơn so với acid ascorbic

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Nguyên liệu 2

2.1.1 Gạo nếp than 2

2.1.2 Enzyme 3

2.1.3 Nấm men 4

2.1.4 Nước dùng trong sản xuất rượu nếp than 6

2.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men 7

2.2.1 Quy trình sản xuất rượu vang nếp than 7

2.2.2 Khái quát về quá trình lên men rượu 9

2.2.3 Cơ chế của quá trình lên men 9

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 10

2.2.5 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men 12

2.3 Sắc tố anthocyanin trong rượu vang nếp than 14

2.3.1 Sắc tố anthocyanin 14

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến anthocyanin 15

2.4 Vi sinh vật trong rượu 16

2.4.1 Hư hỏng do vi khuẩn acetic 16

2.4.2 Hư hỏng do vi khuẩn acid lactic 17

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 20

3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α - amylase đến

hàm lượng đường khử, độ Brix theo thời gian trong quá trình đường hóa 21

3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, chất bảo quản, bao bì đến chất lượng của sản phẩm rượu nếp than theo thời gian 22

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α - amylase đến hàm lượng đường khử, độ Brix theo thời gian trong quá trình đường hóa 25

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, chất bảo quản, bao bì đến chất lượng của sản phẩm rượu nếp than theo thời gian 30

4.2.1 Khi bảo quản bằng acid ascorbic 30

4.2.2 Khi bảo quản bằng acid sorbic 34

1 Các phương pháp phân tích vii

2 Phương pháp cảm quan xiii

3 Tiêu chuẩn Việt Nam xv

4 Kết quả thống kê xix

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Thành phần hóa học của gạo nếp than 2

Bảng 2: Thành phần hóa học của nấm men 5

Bảng 3: Hàm lượng muối của nước sử dụng trong sản xuất rượu bia 6

Bảng 4: Kết quả thống kê độ Brix và hàm lượng đường khử theo thời gian 26

Bảng 5: Kết quả thống kê độ Brix và hàm lượng đường khử theo nồng độ enzyme 26

Bảng 6: Kết quả thống kê hàm lượng đường khử theo thời gian và nồng độ enzyme glucoamylase 27

Bảng 7: Kết quả thống kê màu theo mẫu 29

Bảng 8: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo nồng độ acid ascorbic 30

Bảng 9: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo màu chai 32

Bảng 10: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo nhiệt độ 32

Bảng 11: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo thời gian 33

Bảng 12: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo nồng độ acid sorbic 34

Bảng 13: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo màu chai 35

Bảng 14: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo nhiệt độ 36

Bảng 15: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo thời gian 37

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Gạo nếp than 2

Hình 2: Saccharomyces cerevisiae 4

Hình 3: Bột nếp than 8

Hình 4:Công thức cấu tạo của anthocyanidin 15

Hình 5: Đồ thị biểu diễn độ Brix và hàm lượng đường khử theo thời gian 25

Hình 6: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử ở các nồng độ khác nhau theo thời gian khi sử dụng enzyme glucoamylase 27

Hình 7: Sản phẩm rượu nếp than 29

Hình 8: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo nồng độ acid ascorbic 31

Hình 9: Đồ thị biểu diễn màu rượu theo nồng độ acid ascorbic 31

Hình 10: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo màu chai 32

Hình 11: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo nhiệt độ 33

Hình 12: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo thời gian 34

Hình 13: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo nồng độ acid sorbic 35

Hình 14: Đồ thị biểu diễn màu rượu theo nồng độ acid sorbic 35

Hình 15: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo màu chai 36

Hình 16: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo nhiệt độ 36

Hình 17: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo thời gian 37

Hình 18: Đồ thị biểu diễn màu rượu khi sử dụng acid ascorbic và acid sorbic theo thời gian 38

Hình 19: Qui trình sản xuất đề nghị 40

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Do xã hội ngày càng phát triển, nhu cầu của con người ngày càng cao do đó trên thị trường đã xuất hiện nhiều sản phẩm bánh kẹo, đồ hộp, rượu bia, nước giải khát… không những đáp ứng cho nhu cầu cảm quan về mẫu mã, màu sắc mà còn cung cấp cho người những sản phẩm thực phẩm có chất lượng cũng như an toàn trong thực phẩm Một trong những sản phẩm quen thuộc và phổ biến được khá nhiều người biết đến đó là các sản phẩm lên men, có rất nhiều sản phẩm lên men trên thị trường nhưng sản phẩm lên men quen thuộc nhất và được nhiều người biết đến đó là rượu Sản phẩm rượu hiện nay rất đa dạng có loại đục, trong, không màu, có màu… Một sản phẩm khá phổ biến cũng góp phần vào sự đa dạng đó chính là sản phẩm rượu nếp than- với công nghệ lên men bằng enzyme và nấm men thuần chủng thì đã rút ngắn được thời gian, tăng hiệu suất lên men Nhưng để có được chất lượng rượu và giá trị cảm quan cao nhằm thu hút nhiều hơn đến gần với sản phẩm hấp dẫn này cần phải có những nghiên cứu các yếu tố tác động đến chất lượng của rượu để từ đó tìm ra những điều kiện thích hợp để bảo quản rượu Chính vì lẽ đó mà chúng tôi nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bảo quản rượu nếp than sản xuất bằng công nghệ enzyme và nấm men thuần chủng”

Nhưng một vấn đề gặp phải tồn tại trong thí nghiệm trước là kết quả nghiên cứu của anh Lê Minh Châu đã sử dụng α – amylase trong quá trình đường hóa để lên men nên hiệu quả lên men chưa cao, bên cạnh đó kết quả nghiên cứu của anh Nguyễn Thanh Vũ chưa khảo sát hàm lượng đường khử trong quá trình đường hóa để nấm men sử dụng lên men đạt hiệu quả Cho nên, một vấn đề đặt ra trước tiên của đề tài này là xác định lại giai đoạn đường hóa nhằm tăng hiệu quả lên men

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Để làm rõ hơn hiệu quả của quá trình lên men thì mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là:

 Tối ưu hóa các quá trình thủy phân bằng enzyme

 Tìm ra được điều kiện chế biến và bảo quản rượu nếp than ở quy mô phòng thí nghiệm tốt nhất

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Gạo nếp than

Gạo nếp than là một loại gạo đặc biệt được trồng nhiều ở Nam Bộ Vì thế rượu nếp than được sản xuất chủ yếu ở vùng Nam Bộ

Gạo nếp than gồm 4 loại: - Nếp cẩm Đức Hòa.- Nếp đen Khánh Vĩnh - Nếp than Long Đất - Lúa lức nếp cẩm

Các loại lúa này có năng suất không cao, thường chỉ đạt 2,8 – 3,3 tấn/ha

Hiện nay dân vùng Đồng bằng Nam bộ phân loại nếp than theo màu sắc hạt gạo Theo cách này nếp than được chia thành 2 loại:

- Nếp than đen huyền - Nếp than hồng đỏ

Màu của nếp than là màu của anthocyanin Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực Màu sắc của anthocyanin luôn thay đổi phụ thuộc vào pH, các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác, tuy nhiên màu sắc của anthocyanin thay đổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH môi trường

pH thấp anthocyanin thường có màu đỏ, trở thành không màu ở pH cao rồi thành xanh ở pH cao hơn nữa

Tuy khác nhau về màu sắc bên ngoài, nhưng thành phần hoá học của các loại nếp than không khác nhiều

Bảng 1: Thành phần hóa học của gạo nếp than

Nước Protein Lipid Glucid Acid hữu cơ

Tro

14 8,2 1,5 74,9 0,6

0,8

Nguyễn Đức Lượng,2003

Hình 1: Gạo nếp than

2.1.2 Enzyme

Hệ enzyme thủy phân tinh bột thành đường là hệ enzyme amylase Hệ này tồn tại trong nước bọt, trong dịch tiêu hoá, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm mem … Có nhiều loại enzyme amylase: α-amylase, β-amylase, γ-amylase và một số mới tìm ra từ nguồn gốc vi sinh vật là: pullutanase, isoamylase …

Có nhiều nguồn cung cấp amylase khác nhau, cho nên tuỳ thuộc vào nguồn ra mà enzyme sẽ có điều kiện phát triển riêng Đề tài này sẽ đề cập đến việc sử dụng enzyme amylase thương mại để thực hiện quá trình đường hoá

 α-amylase

α-amylase bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+

α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt

Nhiệt độ tối thích của α amylase là 72 – 760C, pH hoạt động tối thích là 5,3 – 5,8

α-amylase bị vô hoạt ở 800C

α-amylase có khả năng phân cắt liên kết α- 1,4 Glucozit ở bất kỳ vị trí nào trên

mạch tinh bột đã được hồ hóa Do đó được gọi là enzyme nội phân (endoenzyme)

Amylose bị phân cắt khá nhanh tạo thành oligoshaccaride gồm 6 -7 gốc glucose, sau này các mạch này bị phân cắt và bị phân giải chậm thành maltose Sản phẩm thủy phân amylose bao gồm: 87% maltose, 13% glucose

Amylosepectin bị phân giải khá nhanh nhưng α-amylase không phân cắt liên kết α1,6 glucozit nên sản phẩm thủy phân có khoảng 72% maltose, 19% glucose, dextrin

-phân tử thấp và 8% izomaltose

 β-amylase

β-amylase rất bền khi không có ion Ca2+, bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+, urê, iodo, acetanic, iod, ozon

pH tối thích trong dung dịch nấu là 5-5.6

Nhiệt độ tối thích trong dung dịch nấu là 60-65oC và bị vô hoạt ở 70oC

β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucozid trong tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loại Phân cắt tuần tự từng gốc maltose một ở đầu không khử

β-amylase được gọi là enzyme ngoại phân (exo-enzyme)

β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose

Phân giải 54-58% amylopectin thành maltose, phần còn lại là dextrin

 γ-amylase

Hoạt động tốt ở 50oC, hoạt lực tối đa trong vùng pH = 3,5-5,5

γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4; 1,6 glucozid trong tinh bột, glycogen, polysaccharide kiểu maltose Là enzyme ngoại phân exo-enzyme Nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử tuần tự từng gốc glucose một, không thủy phân các dextrin vòng

Sản phẩm tạo thành: Glucose và dextrin vòng

2.1.3 Nấm men

Cấu tạo và sinh sản của nấm men

Nấm men có cấu tạo đơn bào và thường sinh sản bằng cách nẩy chồi và phân cắt Tế bào nấm men có thể có hình trứng (men

bia), hình elip (men rượu vang), hình cầu (Torulopsis), hình gậy (Candida), hình quả chanh Kích thước của tế bào nấm men khoảng

8 - 15µm

Nấm men sinh sản chủ yếu bằng hình thức nảy chồi Tế bào mẹ nảy sinh ra thành một chồi nhỏ rồi lớn dần lên và sẽ tách ra Quá trình này xảy ra khoảng 2 giờ Ở một số giống nấm men, tế bào con không tách rời mà kết thành chuỗi Đặc tính này có ở các nấm men tạo màng

Hình 2: Saccharomyces cerevisiae

Thành phần hóa học của nấm men

Thành phần hóa học của tế bào nấm men được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 2: Thành phần hóa học của nấm men

Thành phần Hàm lượng (% chất khô) Cacbon

CaO Nitro Hydro

P2O5K2O SO3MgO Fe2O3SiO

49,8 12,4 6,7 3,54 2,34 0,04 0,42 0,38 0,035

0,09

“Nguyễn Đức Lượng, 1996”

 Nấm men trong sản xuất rượu từ tinh bột

Saccharomyces Cerevisiae Rasse II:

Chủng này sinh sản trong môi trường nước đường, thường tụ lại thành đám, sau thời gian ngắn lắng xuống Đặc điểm của loài này trong tế bào có nhiều hạt glycogen, không bào lớn hình thành bào tử nội sinh ít và chậm, sinh bọt nhiều và thích nghi với độ acid thấp, có sức kháng cồn cao, không lên men được lactose, kích thước tế bào từ 5-7μm

Saccharomyces Cerevisiae Rasse XII:

Phân lập được ở Đức năm 1902 Tốc độ phát triển nhanh, sau 24 giờ từ một tế bào có thể phát triển thành 55 tế bào mới ở loài này không bào nhỏ, ít sinh bọt, tế bào hình trứng hoặc hình tròn, kích thước vào khoảng 5-8μm, lên men ở nhiệt độ cao và lên men được đường glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose và 1/3 đường rafinose, không lên men đường lactose, có thể lên men đến 13% rượu Nấm men

Saccharomyces Cerevisiae Rasse XII thuộc loại men nổi, phân bố rất đều trong dịch

lên men không tạo thành đám trắng

R211

Loại nấm men này được phân lập từ men thuốc bắc ở nhà máy rượu Hà Nội Tế bào hình ovan có kích thước (3-5) x (5-8) μm, nó có thể lên men được ở đường glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose Được dùng trong sản xuất rượu từ nguyên liệu chứa tinh bột như: gạo, ngô, khoai, sắn Sinh sản nhanh sau khi cấy từ 12 đến 16 giờ, lên men tốt trong dịch đường 120-140g/l và ở 160-180g/l vẫn có thể lên men được nhưng hiệu suất chuyển hóa thấp Nồng độ rượu tạo thành trong môi trường lên men là 10- 12 % Nhiệt độ lên men thích hợp là 28 đến 300C, nhưng đến 380C thì vẫn có thể lên men được Chúng có khả năng chịu được chất sát trùng Na2SiF6, nồng độ 0,02% (nồng độ này vi khuẩn bị ức chế)

“Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002”

2.1.4 Nước dùng trong sản xuất rượu nếp than

Độ cứng không quá 7 mg đương lượng / lit phải trong suốt không màu không mùi, hàm lượng muối không được quá giới hạn

Bảng 3: Hàm lượng muối của nước sử dụng trong sản xuất rượu bia

Ion Hàm lượng (mg/l) Ion Hàm lượng (mg/l) Cl-

SO4As Pb NO3

2-0,5 80 0,05 0,1 40

F Zn Cu Fe

3 3 5 0,3

(Bùi Thị Quỳnh Hoa , 2002)

Khả năng oxy hóa một lit nước không quá 2ml dd KMnO4 (0,01N) Chất cặn không vượt quá 1000ml/l

Hàm lượng các chất hữu cơ không vượt quá 4mg/l Vi sinh vật hầu như không có pH kiềm không thích hợp cho quá trình nấu nguyên liệu, có khả năng tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển và thúc đẩy quá trình tạo thành glyceryl trong quá trình lên men

Ecoli < 20 tế bào/ lit

2.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men

2.2.1 Quy trình sản xuất rượu vang nếp than

- Sơ đồ quy trình

Nấm men (1%) Enzyme amylase

Hãm cồn (20%V) Lên men phụ (6 tháng)

- Thuyết minh một số công đoạn của qui trình

Gạo nếp than sau khi được làm sạch sẽ đem đi nghiền mịn nhằm giúp cho tinh bột và một số chất khô khác dễ hòa tan hơn trong quá trình nấu

Nấu

Mục đích của quá trình nấu là phá vỡ màng tế bào tinh bột, chuyển hạt tinh bột từ trạng thái không tan thành trạng thái hoà tan trong nước nhằm tạo điều kiện cho enzyme amylase dễ dàng tấn công vào hạt tinh bột

Cho khoảng 10% enzyme vào nếp than đã được nghiền và pha loãng sẵn, sau đó nâng nhiệt lên đến 72oC thì giữ ở nhiệt độ này 15 phút để cho enzyme dịch hoá Tiếp tục đun cho dịch cháo đến sôi và giữ ở nhiệt độ sôi 10 phút cho tinh bột hồ hoá hoàn toàn Làm nguội dịch cháo đến nhiệt độ cần khảo sát (65 – 75oC) rồi cho hết lượng enzyme vào Giữ ở nhiệt độ này khoảng 30 phút cho đến khi quá trình đường hóa kết thúc rồi đem lọc

Nấu còn có tác dụng tiêu diệt hầu hết các vi sinh vật gây hại cho quá trình lên men về sau

Lên men

Tiến hành lên men ở nhiệt độ thường, thời gian này có hai quá trình xảy ra song song với các mức độ khác nhau, đó là quá trình tăng sinh khối của nấm men và quá trình rượu hóa

Ổn định

Rượu vang nếp than được lên men ở nhiệt độ cao lại không qua chưng cất, nên sau khi lên men xong sẽ còn nhiều rượu bậc cao và các aldehyde gây độc cho cơ thể người Vì vậy, cần có thời gian dài để cho các sản phẩm phụ này chuyển hóa và ổn định rượu, làm cho chất lượng rượu được tốt hơn

Hình 3: Bột nếp than

2.2.2 Khái quát về quá trình lên men rượu

Lên men rượu là một quá trinh trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì sự sống của nấm men) Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau Tuy nhiên, có hai hình thức lên men chính: lên men yếm khí và lên men hiếu khí

- Lên men yếm khí: là sự phân hủy đường không có sự hiện diện của oxy như quá trình lên men lactic, len men rượu, butylic…

- Lên men hiếu khí: là sự phân hủy đường có sự hiện diện của O2 như quá trình lên men axit acetic, citric…

Lên men rượu, bia đều là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men (Yeast) Nấm men chuyển hóa đường lên men thành rượu etylic và CO2 Nguời ta còn có thể gọi là quá trình cồn hóa, rượu hóa

Trong quá trình lên men rượu người ta chia làm hai thời kì chính:

- Thời kì phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của O2 tế bào nấm men phát triển sinh khối (gia tăng kích thước và số lượng)

- Thời kì lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này, nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình để thực hiện xúc tác sinh hóa trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống tạo thành rượu và CO2

2.2.3 Cơ chế của quá trình lên men

Để lên men, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt được > 100 triệu tế bào trong 1 ml dung dịch lên men Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh Đuờng lên men và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm men sau đó khuếch tán qua màng tế bào vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽ được tạo thành

Rượu ethylic tạo thành khuếch tán ra môi truờng bên ngoài qua màng tế bào nấm men Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất nhanh vào trong môi trường CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn Ở áp suất 800mmHg, nhiệt độ 25 – 300C là 0,857 – 0,837 lít CO2 trong 1 lít nước Vì thế, CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuếch tán vào trong môi trường và nhanh chóng đạt được trạng thái bão hòa Khi bão hòa, CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra bên ngoài Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống Qúa trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, khi đó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men Kích thước, vật liệu chế tạo của thiết bị lên men, các chất hòa tan mang điện tích, các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men điều ảnh hưởng đến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng đến quá trình lên men

“Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002”

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

Có năm yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu như sau:

- Nồng độ đường

Nấm men chỉ có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng nồng độ thích hợp từ 10 – 18%, nồng độ đường quá cao sẽ ức chế nấm men và khả năng lên men rượu giảm khi nồng độ đường 30 – 35%, nồng độ đường thấp quá cũng làm giảm năng lực lên men

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

Để thấy rõ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động sống của nấm men cụ thể nấm

men Saccharomyces Cerevisiae Rasse XII trong quá trình lên men rượu Nấm men chủng XIIphát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 330C, nhiệt độ tối đa là 380C, tối thiểu là 50C Nấm men được nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu ở 17 – 220C có năng lực lên men rất lớn Đối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 1 – 450C Nếu nhịêt độ quá 500C nấm men sẽ chết

- Ảnh hưởng của acid (pH)

Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH = 2 – 8 nhưng thích hợp nhất là 4 – 4,5 Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển Vì vậy, trong lên men rượu để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn pH = 3,8 – 4,0 Tuy nhiên trong thực tế có những loài vi khuẩn do quen dần ( thuần hoá) với độ pH thấp nên ngoài việc ứng dụng điều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng Khi pH = 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh Ở pH = 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển

Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta có thể bổ sung vào môi trường bất cứ một loại acid nào, miễn là anion của acid không gây ảnh hưởng mạnh đến trung tâm hoạt động của nấm men

- Ảnh hưởng của nồng độ rượu

Nồng độ rượu sinh ra có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men Nồng độ rượu ảnh hưởng đến tốc độ phát triển riêng của nấm men còn phù thuộc vào thời gian, số lượng tế bào và nguyên liệu chuẩn bị cho môi trường nuôi cấy Cùng một môi trường nuôi cấy, số lượng nấm men cho vào bằng nhau, điều kiện nuôi cấy giống nhau thì nồng độ rượu ban đầu 1% chưa có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men, từ 4 – 6% đã có ảnh hưởng xấu

- Ảnh hưởng của oxy

Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc Trong điều kiện không có oxy nấm men sẽ lên men đường tạo thành rượu và CO2, còn trong điều kiện đầy đủ oxy nấm men có khả năng oxy hóa đường thành rượu và CO2 và tăng sinh khối “Hiệu ứng Pastuer” kìm hãm sự lên men rượu bằng O2

Oxy là thành phần không thể thiếu được ở giai đoạn phát triển sinh khối Tùy nhiên nó là nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu trong giai đoạn chế biến còn lại Với sự có mặt của O2 nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng sẽ phát triển sinh khối Trong giai đoạn bảo quản thì chúng sẽ làm cho sản phẩm có nhiều aldehyt, sản phẩm rất dễ bị biến màu do các phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu gây tối màu cho sản phẩm, làm chua sản phẩm do sự hình thành acid hữu cơ (vi khuẩn lactic, acetic…) gây thối cho sản phẩm rượu theo thời gian bảo quản (do rượu bia là môi trường rất giàu chất dinh dưỡng cho vi khuẩn gây thối phát triển

Một số quá trình lên men trong giai đoạn đầu diễn ra quá chậm do không đủ lượng O2 cho sự phát triển sinh khối, do vậy không đủ lượng tế bào lên men ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và dây chuyền sản xuất Tuy nhiên lại có một số nấm men phát triển nhanh và tạo ra hàm lượng rượu nhiều hơn trong môi trường không khí, chủng này thường nuôi cấy và phát triển trong môi trường ban đầu có đầy đủ oxy

“Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002”

2.2.5 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men

- Sự tạo thành acid

Trong quá trình lên men rượu luôn tạo các acid hữu cơ bao gồm: acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyrovic và acid succinic nhưng nhiều hơn cả là acid acetic và acid latic

Acid acetic có thể được tạo thành từ phản ứng oxy hoá khử giữa hai aldehyde acetic – 1 phân tử bị oxy hoá, phân tử thứ hai sẽ bị khử:

CH3CHO + CH3CHO + H2O = CH3COOH + C2H5OH Acid lactic được tạo bởi pyrovat dehydronase theo phản ứng:

CH3CO-COOH + NAD.H2 = CH3CHOHCOOH + NAD Hoặc

CH2O(H2PO3)CHOHCHO + H2O = CH3CHOHCOOH + H3PO4

Acid citric theo Laphon được tạo từ aldehyde acetic Phản ứng được biểu diễn tổng quát như sau:

9CH3CHO + 4H2O = (CH2COOH)2C(OH)COOH + 6CH3CH2OH Acid succinic được tạo thành có thể theo hai con đường: dehydro và trùng hợp hai phân tử acid acetic với một phân tử aldehyde acetic:

2CH3-COOH + CH3CHO Æ COOHCH2CH2COOH + C2H5OH

Hoặc được tạo thành do deamin acid glutamic Trường hợp này aldehyde glyceric tiếp nhận hydro và tạo ra cả glycerin Phương trình tổng quát tạo acid succinic cùng với glycerin từ acid glutamic được biểu diễn như sau:

C6H12O6 + COOH-CH2-CH2-CHNH2COOH + 2H2O = COOH-CH2CH2COOH + 2C3H8O3 +NH3 + CO2

Glycerin và aldehyde đều là sản phẩm trung gian của lên men rượu Trong điều kiện lên men nhằm mục đích chỉ thu rượu etylic, người ta khống chế pH dịch lên men trong giới hạn 4,5 – 5,2 Với điều kiện ấy lượng glycerin tạo thành chỉ chiếm 0,3 – 0,45% dịch giấm chín, tương ứng tiêu tốn đường 2 – 3% so với lượng đưa vào Nếu tăng pH tới kiềm thì lượng đường tham gia tạo glycerin tăng tới 23,4% và đường tạo aldehyde nhưng chưa chuyển thành rượu đạt 11,9%

Lên men đường xảy ra theo phương trình:

Phương trình tổng quát quá trình tạo thành alcol có phân tử cao được đơn giản theo phản ứng:

R-CH(NH2)-COOH + H2O Æ RCH2OH + NH3 + CO2

Như vậy việc tạo thành alcol cao phân tử gắn liền với sự biến đổi của acid amin xảy ra trong điều kiện yếm khí chỉ có thể đồng thời với lên men rượu, sự tạo thành alcol cao phân tử khi lên men là do axit amin bị mất NH3, sau đó mất CO2 và cuối cùng aldehyt bị khử để tạo ra alcol

Bằng con đường tương tự, nhiều acid amin cũng được tạo thành như valin và izolơxin … chúng là tiền đề để tạo ra các alcol bậc cao sau này Thực ra quá trình amin hoá acid pyrovic xảy ra rất phức tạp, qua nhiều giai đoạn có liên hệ chặt chẽ với nhau Acid acetic tạo thành có hoạt tính cao lại tác động cho các quá trình khác tiếp theo

- Sự tạo thành ester và các sản phẩm phụ khác

Sự tạo thành ester

Song song với việc tạo ra acid và alcol, dưới tác dụng của enzyme trong nấm men, các acid và alcol sẽ tác dụng lẫn nhau để tạo ra những ester tương ứng Phương trình tổng quát:

R1CH2OH + R2COOH Æ R2COO-CH2R1 + H2O

Este etylic có thể được tạo thành do alcol etylic kết hợp với axit axetic hoặc là do sự tham gia phản ứng của các aldehyde

Sự tạo thành aldehyde

Là sản phẩm của quá trình trao đổi chất ở nấm men và cũng có thể được tạo thành qua con đường oxy hóa các loại rượu Chủ yếu là hàm lượng acetaldehyde

Acid pyruvic accetaldehyde

Lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo thành trong quá trình lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố Chúng thay đổi theo nhiệt độ, pH, mức độ sục khí cũng như chủng giống nấm men và cả nguồn nguyên liệu

2.3 Sắc tố anthocyanin trong rượu vang nếp than

2.3.1 Sắc tố anthocyanin Cấu tạo

Anthocyanin là sắc tố tan trong nước, rất phổ biến trong thực vật, có màu đỏ, xanh da trời, màu do sự phối hợp giữa đỏ và xanh (thành màu tím), có trong trái cây, hoa, và những mô thực vật Đây là chất màu có mặt rộng rãi trong thực vật ở khắp nơi trên thế giới

Anthocyanin là glycoside của các anthcyanidin với monosaccharide (glucose, galactose, rhamnose, xylose…), di và trisaccharide Anthocyanidin ít tan trong nước hơn anthocyanin và không thấy tự do trong tự nhiên

Anthocyanin là các dẫn xuất polyhydroxy và methoxy của flavylium Trong thực phẩm có 6 anthocyanidin phổ biến (pelargonnidin, cyaniding, delphinidin, peonidin, petunidin, malvidin), nó khác nhau do độ hydroxyl và methoxyl hóa vòng B

Decacboxyl hóa

Hình 4:Công thức cấu tạo của anthocyanidin

Tính chất

Màu của anthocyanin được xác định bởi cấu trúc hóa học và môi trường bên ngoài Có thể hai anthocyanin khác nhau cho màu giống nhau hay hai anthocyanin giống nhau lại cho màu khác nhau

Khi tăng số nhóm hydroxyl vào phân tử sẽ làm cho nó chuyển từ màu đỏ sang màu xanh (blue) Khi thay nhóm hydroxyl bằng nhóm methoxyl sẽ làm ngược lại khuynh hướng đổi màu

pH thấp anthocyanin thường có màu đỏ, trở thành không màu ở pH cao rồi thành xanh ở pH cao hơn nữa Sự biến đổi dạng anthocyanin theo pH:

- pH thấp, tồn tại dạng cation, màu đỏ

- pH gần đẳng điện, không mang điện, không màu

- pH cao, tồn tại dạng anion, màu xanh (blue).Ở pH cao hơn, các anthocyanidin tự do sẽ bị phân rã tạo thành aldehyde và acid carboxylic

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến anthocyanin

Nhiệt độ: khi tăng nhiệt độ sẽ dẫn đến sự thay đổi độ hấp thu cực đại, màu của anthocyanin cũng giảm khi gia tăng nhiệt độ

pH: pH quá cao hoặc quá thấp sẽ dẫn đến sự thoái hóa màu anthocyanin, hiệu quả của chất màu này đạt cực đại ở pH = 3,5

Thời gian bảo quản và ánh sáng: tăng thời gian bảo quản thì chất màu anthocyanin giảm và khi bảo quản ở các điều kiện môi trường khác nhau cũng ảnh hưởng đến sắc tố anthocyanin Thời gian bảo quản và chiếu sáng trực tiếp ảnh hưởng lên sự ổn định của anthocyanin Các nhà nghiên cứu đã cho rằng giữ mẫu ngoài ánh sáng thì nồng độ của chất màu giảm mạnh hơn trong tối

Các yếu tố khác cũng có thể ảnh hưởng đến màu anthocyanin như nồng độ của các chất màu kết hợp với anthocyanin, tỉ lệ tương đối trong hỗn hợp các anthocyanin, ảnh hưởng của các sắc tố khác như carotenoid, chlorophyll

2.4 Vi sinh vật trong rượu

Vi khuẩn có thể phát triển trong rượu là vi khuẩn acid acetic và acid lactic và 2 loại đòi hỏi cần phải có oxi Vi khuẩn acetic cần có oxi để phát triển và chuyển thành giấm trong khi vi khuẩn acid lactic phát triển tốt trong điều kiện hàm lượng oxi thấp Trong nước quả, ngoài men còn có nhiều loại khuẩn, khuẩn khó nghiên cứu hơn men vì kích thước nhỏ hơn men nhiều: chỉ gần đây nhờ có kính hiển vi điện tử mới biết rõ thêm về cấu trúc của chúng Men chuyển đường thành rượu, gây một sự thay đổi có ích, còn khuẩn thì tác động đến nhiều thành phần của nước quả hay của rượu, chuyển thành các chất có hại: khuẩn xêrin, làm cho rượu có vị chua, vị đắng, có mùi hôi …

2.4.1 Hư hỏng do vi khuẩn acetic

Vi khuẩn acid acetic là vi khuẩn thuộc giống Acetobater Chúng có khả năng oxi

hóa mạnh ở pH = 4,5 thì ethanol chuyển thành axit axetic và oxi hóa acid acetic thành CO2 và nước Có 3 loài được công nhận đó là: A aceti, A pasteurianus và A

peroxydans được tìm thấy trong rượu Một số loài khác ít quan trọng trong sự hư

hỏng của rượu A xylinum là một loài phụ của A aceti Những giống A aceti được

sử dụng trong việc sản xuất ra giấm

Rượu pha thêm rượu mạnh: Bobadilla đề nghị rằng rượu được sử dụng trong việc sản xuất rượu pha chứa tối thiểu 14,5% ethanol Tuy nhiên, Cruess thấy rằng sự hóa giấm xảy ra nhanh ở rượu nguyên chất chứa 14,7% ethanol ở California Vaughn cho rằng hầu hết vi khuẩn acetic chịu được nồng độ ethanol tối đa nằm trong

khoảng 14 – 15%; nhưng ông cho rằng loài và giống Acetobacter tồn tại nhưng

không phát triển trên 10% ethanol.

Rượu vang để tiếp xúc rộng rãi với không khí chỉ sau vài tuần bị một màng trắng bao phủ: đó là màng giấm Khuẩn giấm biến cồn êtilic thành axit axetic, do đó rượu vang có mùi giấm Một phần nhỏ axit axetic lại hợp với cồn êtilic thành một este, ethyl acetate và chất này có mùi chua gắt, khó chịu hơn cả giấm Người ta nếm rượu căn cứ vào mùi ethyl acetate để đánh giá rượu có bị chua giấm hay không

Khuẩn giấm phát triển mạnh hay yếu, tùy thuộc các nhân tố sau đây:

- Số lượng khuẩn ban đầu, do đó phải tìm cách lọc, giữ vệ sinh để giảm lượng này và rất khó loại hoàn toàn

- Độ nhiệt ảnh hưởng lớn, thí dụ lượng axit axetic hình thành ở 280C cao gấp đôi ở 230C

- Độ pH cũng ảnh hưởng lớn, rượu càng chua khuẩn giấm càng khó sinh sản, thí dụ dưới pH 3,2 rất ít khi thấy xuất hiện khuẩn giấm

- Polifênola - tanin có tác dụng kiềm hãm (nhẹ)

- Các vitamin ảnh hưởng cũng như đối với khuẩn lactic, cần thiết nhất là axit pantothenic, nicotinamit, axit p - amino benzoic đôi khi thiamin (B1)

- Khuẩn giấm cần rất nhiều oxy Thí dụ muốn tăng axit bay hơi 0,8 g trong một lít rượu vang, khuẩn phải có tối thiểu 2 lít không khí Vậy giữ rượu vang trong chai, lọ nút kín, không cho tiếp xúc với không khí là cách tốt nhất để chống bệnh chua giấm

Vì có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của men giấm nên mặc dù có khuẩn, không nhất thiết rượu vang nào cũng bị bệnh chua giấm Vậy phải thử khả năng bị chua giấm như sau: cho rượu vang muốn thử vào chai đã vô trùng, nút bằng bông và chỉ đổ rượu đầy tới 3/5 chai thôi Để chống chua giấm nên đựng rượu vang trong các chai, lọ kín tuyệt đối và trong chai, rượu phải đầy lên sát nút, để lại trong chai càng ít không khí càng tốt

2.4.2 Hư hỏng do vi khuẩn acid lactic a Sinh thái khuẩn lactic

Khuẩn nhỏ hơn men, di chuyển dễ hơn men, dựa vào các môi giới như côn trùng, gió Nên có thể nghĩ rằng khuẩn cũng như men, xâm nhập vào nước quả nhờ đã có sẵn trên quả nho; nhưng chỉ ở những năm gần đây (khoảng 1960), người ta mới có bằng chứng chắc chắn nhờ có kỹ thuật phát hiện, phân lập tiến bộ hơn

Có thể hình dung ra như sau, quá trình hoạt động của các khuẩn lactic như sau: Trên quả đã có khuẩn lactic Trong xưởng rượu trên các dụng cụ chế rượu cũng có Vì vậy trong nước quả đã có sẵn nhiều loại khuẩn lactic Không phải tất cả các khuẩn này đều có thể tồn tại: một số không thể sinh sản được vì pH quá thấp, nhưng ở xác, ở hạt, ở những chổ chua và giàu chất khoáng thì khuẩn vẫn sống được; có độ cồn tăng lên dần thì khuẩn bị ức chế Cuối cùng chỉ có một tỉ lệ rất thấp các khuẩn có mặt ở quả lúc đầu sống sót và sau này gây lên men malôlactic (biến acid malic thành acid lactic), nhờ thích ứng được dần dần với điều kiện môi trường có cồn chúng sinh sản rất chậm sau một thời gian tiềm sinh Cần chú ý là trong quá trình lên men, điều kiện không thuận cho khuẩn lactic tăng dần, nhất là khi người ta cho thêm các men với số lượng lớn Tế bào men đông hơn, thích hợp với cồn, với pH

thấp hơn nên chiếm hết thức ăn của khuẩn; cho thêm SO2 vào lại thuận cho men hơn là cho khuẩn vì men chịu đựng giỏi hơn Như vậy lên men malôlactic bắt đầu không muộn hơn lên men rượu, nhưng bị kiềm hãm dần lại và chỉ diễn ra thực sự vài ngày hoặc vài tuần sau khi lên men rượu xong và là kết quả của sự thích nghi dần của một số tế bào khuẩn giỏi chịu đựng

b Hoạt động của khuẩn lactic

Trong tự nhiên, lên men lactic diễn ra như nói trên: sau khi cho nước quả vào bể lên men, ngay những giờ đầu sự lên men lactic bắt đầu nhưng sau đó ngừng lại vì khuẩn lactic bị cồn etylic hình thành ức chế Sau khi lên men rượu xong chỉ còn một số ít khuẩn, 2/3 số rượu thăm dò có khoảng trên 10 000 khuẩn/cc trong khi phải có khoảng 1.000.000 thì acid malic mới bị phân hủy đáng kể Sau một thời gian tiềm sinh từ vài ngày đến vài tuần lễ, số lượng khuẩn lactic tăng dần, quá trình lên men malôlactic mới bắt đầu Sau khi acid malic bị phân hủy hết thì số lượng khuẩn lactic lại giảm

- Độ pH có ảnh hưởng lớn, pH thích hợp cho khuẩn lactic là 4,2-4,5, nhưng ở độ pH này, khuẩn lactic thường là khuẩn que (lactobacillus) có khuynh hướng phân hủy không phải acid malic mà là đường, acid tatric làm hỏng rượu Nếu pH thấp 3,5-3,2 thì khuẩn hoạt động rất khó khăn và chỉ còn sống sót một số khuẩn cầu (Leuconostoc); pH thấp, cần tới tác động của khuẩn lactic làm cho rượu bớt chua, thì khuẩn lại khó sinh sống: đó là mâu thuẩn và cần phải có sự thích ứng dần của một số dòng khuẩn; khi số lượng đã nhiều mới có thể lên men malôlactic

- Độ nhiệt tác động đến khuẩn cũng giống như đối với men, thích hợp nhất là vào khoảng 25-30 0C Tuy nhiên độ nhiệt lên tới 300C khi lượng cồn etylic đã cao thì khuẩn lactic có thể bị diệt Vì vậy khi lên men malolactic giữ rượu ở 20-250thích hợp

- Yêu cầu đối với oxy Người ta thường cho khuẩn lactic yếm khí, trái với khuẩn giấm háo khí Thực ra khuẩn lactic có thể chịu được yếm khí nhưng nếu có oxy hòa tan trong nước thì hoạt động có phần tốt hơn khi hoàn toàn yếm khí

- Yêu cầu đối với acid amin Mỗi loài khuẩn có những yêu cầu nhất định đối với từng loại acid amin; yêu cầu của khuẩn cầu cao hơn khuẩn que về mặt này

- Yêu cầu đối với các vitamin Cũng như men, khuẩn cần có những vitamin nhất định ở trong môi trường và về mặt này yêu cầu của khuẩn que lại cao hơn khuẩn cầu Acid pantothenic và nicotinic nói chung cần thiết cho đa số khuẩn; Riboflavin (B2), acid folic và đôi khi thiamin (B1) hoặc cần thiết hoặc có tính chất kích thích tùy theo loại khuẩn

c Kết quả hoạt động của khuẩn lactic: lên men malôlactic và các bệnh rượu

- Lên men malolactic Khuẩn lactic gây nên những sự thay đổi trong rượu đa số là

có hại, chỉ có một sự thay đổi có ích: biến acid malic thành acid lactic Acid malic trong công thức có 2 nhóm COOH có hai chức acid: acid lactic có một nhóm COOH, một chức acid; nên khi biến acid malic thành acid lactic giảm độ chua được một nữa, rươu dịu đi, ngoài ra acid malic có vị chua gắt, khó chịu, còn acid lactic có vị mềm hơn

Lên men malôlactic không cung cấp năng lượng cho khuẩn lactic cho nên khuẩn lại phải phân hủy các thành phần khác của rượu để lấy năng lượng Vì vậy không có khuẩn lactic nào hoàn toàn có ích cả Thực ra người ta phân biệt hai nhóm khuẩn lactic: một nhóm bao giờ cũng nguy hiểm vì phân hủy các thành khác của rượu nhiều hơn là phân hủy acid malic, một nhóm thứ hai thường chỉ quen phân tích acid malic và là khuẩn có ích và chỉ có hại trong những điều kiện đặc biệt

Trong quá trình chế rượu, khi theo dõi lên men rượu, đồng thời cũng phải theo dõi lên men malôlactic Phải phân tích định kỳ đều đặn độ chua tổng cộng, acid bay hơi, lượng acid malic Khi nào hết axit malic thì gạn cặn, lọc để loại bớt khuẩn - nếu cần tiệt trùng

- Bệnh rượu vang Chỉ có lên men malôlactic là tăng chất lượng của vang Những biến đổi khác do khuẩn lactic gây ra đều có hại vì phá hủy các thành phần cơ bản của vang, làm cho vang bị bệnh

Bệnh vang dính (vins filants): khi rót rượu ra cốc vang không chảy đều, lỏng như

nước mà dính như có hồ nếp

Đó là do khuẩn lactic nhất là loại Leuconostoc, trong những điều kiện nhất định, tiết ra quanh mình một loại đường riêng gọi là dextran Bệnh này thường kéo theo bệnh chua tatric và bệnh vang đắng

Bệnh chua lactic (piqure lactique) Xảy ra khi trong rượu vang còn lại đường khử,

chưa chuyển hết thành rượu Đường khử bị khuẩn lactic phá hủy chuyển thành đường manit và acid bay hơi, gây một mùi chua khó chịu Là một bệnh phổ biến của rượu vang, xảy ra khi quả quá ngọt hoặc cho thêm quá nhiều đường, kỹ thuật lên men thấp, làm cho "con men" ngừng hoạt động nửa chừng, cấy men Saccharomyces chưa đủ, lượng nhiệt quá cao, thiếu oxi

Bệnh chua tatric (tourne) Xảy ra khi khuẩn lactic phá hủy axit tatric làm cho rượu

đục, tiết nhiều CO2, rượu chuyển màu nâu, có vị nhạt Chỉ khi pH cao hơn 3,5 -3,6 mới có bệnh này vì vậy rượu cũ, rượu ngon hay bị bệnh

Bệnh đắng Xảy ra khi men lactic phá hủy glixerin Rượu trở thành chua, có vị đắng

do các chất acrolêin hình thành

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

- Enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ Aspergillus niger mua tại Công ty

TNHH TM-DV Nam Giang (133/11, Hồ Văn Huê, P9,Q Phú Nhuận, TP HCM)

Dung dịch H2SO4 đậm đặc 98%, H2SO4 0,1N, H2SO4 1N Dung dịch iôt 0,1N, dung dịch tinh bột 1%

KI tinh thể, Na2S2O3

3.1.3 Trang thiết bị

- Chiết quang kế - Cồn kế

B1 = 20 ; B2 = 25; B3 = 30; B4 = 35 Tổng nghiệm thức: 4 x 5 = 20 Tổng đơn vị thí nghiệm: 20 x 2 = 40

Bảng sơ đồ thí nghiệm

Thời gian Nồng độ

Kết quả ghi nhận

Hàm lượng đường khử còn lại Độ brix theo thời gian

3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, chất bảo quản, bao bì đến chất lượng của sản phẩm rượu nếp than theo thời gian

Enzyme amylase

Nghiền Nấu

Lọc

Làm nguội (33oC) Thanh trùng

Tiến hành thí nghiệm

Tiến hành như sơ đồ bố trí thí nghiệm Sau khi lên men xong tiến hành bảo quản với các nồng độ chất bảo quản khác nhau (C1,C2, C3, D1, D2, D3), hai loại bao bì và nhiệt độ khác nhau, sau đó đo các chỉ tiêu theo thời gian

Các chỉ tiêu đánh giá

Đánh giá cảm quan về màu sắc, độ trong, mùi vị

Đo màu sắc, xác định hàm lượng este, acid tổng số, aldehyde, fufurol

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α - amylase đến hàm lượng đường khử, độ Brix theo thời gian trong quá trình đường hóa

Dựa vào kết quả của Lê Thanh Vũ chúng tôi cố định quá trình dịch hóa là sử dụng 0,08 % enzyme α – amylase theo thể tích với nhiệt độ và pH tối thích là 850C và 6,5

(Nguyễn Thị Giang Thanh) trong 15 phút Enzyme α – amylase làm giảm độ nhớt

của dịch nếp, enzyme này sử dụng với nồng độ cao thì độ nhớt giảm nhanh và ngược lại Tuy nhiên, độ nhớt của dịch nếp giảm đến một giá trị nào đó thì mức độ giảm không đáng kể Thời gian dịch hóa càng dài thì độ nhớt của dịch nếp càng giảm và không đều Độ nhớt giảm mạnh ở giai đoạn đầu nhưng giảm không đáng kể

ở giai đoạn sau Như vậy, thời gian dịch hóa hiệu quả nhất là 15 phút (Võ Văn

Tuấn)

Từ kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thanh Vũ và Lê Minh Châu quá trình đường hóa chỉ sử dụng enzyme α – amylase do đó hiệu suất lên men không cao, độ rượu là 5 (% thể tích) Nguyên nhân có thể là do nghiên cứu này chưa phân tích hàm lượng đường khử trước khi lên men để lên men đạt độ rượu yêu cầu Chính vì lẽ đó, ở thí nghiệm này chúng tôi đã phân tích lại lượng đường khử và độ Brix trong quá trình đường hóa khi sử dụng enzyme α – amylase theo thời gian Kết quả cho thấy:

Hình 5: Đồ thị biểu diễn độ Brix và hàm lượng đường khử theo thời gian

Bảng 4: Kết quả thống kê độ Brix và hàm lượng đường khử theo thời gian

Thời gian Brix Đường khử

15 17,1a 3,626a20 18,45b 4,47b25 19,13c 5,64c

Bảng 5: Kết quả thống kê độ Brix và hàm lượng đường khử theo nồng độ enzyme

Nồng độ enzyme Brix Đường khử

thấp và 8% izomaltose (Bùi Thị Quỳnh Hoa, Nguyễn Thị Hiền)

Quá trình lên men khi sử dụng enzyme α – amylase trong quá trình đường hóa thì hàm lượng đường khử không đủ để lên men rượu đạt nồng độ theo yêu cầu và thí nghiệm của Lê Thanh Vũ chưa khảo sát hàm lượng đường khử trong quá trình đường hóa khi bổ sung glucoamylase cho nên chúng tôi thực hiện thí nghiệm này với nhiệt độ tối thích của enzyme glucoamylase là 650C và do quá trình khảo sát động học của giá trị pH ở thời điểm này chưa có nên chúng tôi sử dụng giá trị pH

của α – amylase trong quá trình đường hóa để sử dụng cho thí nghiệm này

 Khảo sát hàm lượng đường khử theo nồng độ enzyme và thời gian thủy phân

trong quá trình đường hóa

Bổ sung enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa thì hàm lượng đường khử tăng lên đáng kể Kết quả như sau:

Bảng 6: Kết quả thống kê hàm lượng đường khử theo thời gian và nồng độ enzyme glucoamylase

Nồng độ

Thời gian 0,1% 0,2% 0,3% 0,4% 0,5% Trung bình

30 8 9,68 11 13,51 13,28 11,09b

40 8,43 10,34 12,85 13,73 13,96 11,86bTrung bình 7,6a9b 11,01c 12,97d 13,29d

Từ đồ thị cho thấy khi tăng thời gian và nồng độ enzyme thì lượng đường khử tăng Xét về mặt ý nghĩa thống kê (Bảng 6) ta thấy hàm lượng đường khử thu nhận được khi thủy phân bằng enzyme glucoamylase ở nồng độ 0,4% và 0,5% không có sự khác biệt ý nghĩa ở mức 5%, hàm lượng đường khử thu nhận được khi thủy phân ở các nồng độ enzyme còn lại có sự khác biệt ý nghĩa ở mức 5% và lượng đường khử khi thủy phân ở mức thời gian 30 phút, 40 phút thấy không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê Khi tăng thời gian thì lượng đường khử tăng nhưng đến một lúc

nào đó hàm lượng đường khử tăng không đáng kể

Kết quả khảo sát nồng độ và thời gian thủy phân của enzyme này trên nguyên liệu nếp trắng cho thấy với nồng độ enzyme là 0,3% thủy phân trong thời gian 30 phút là

thích hợp nhất (Võ Văn Tuấn) Do đó, từ kết quả (Bảng 6) chúng tôi chọn nồng độ

enzyme là 0,4% và thời gian 30 phút để tiến hành cho thí nghiệm sau Nồng độ enzyme glucoamylase thủy phân trên nguyên liệu nếp than nhiều hơn nếp trắng có lẽ là do hàm lượng chất chống oxi hóa (anthocyanin) trên nguyên liệu nếp than nhiều nên quá trình động học xảy ra chậm hơn so với nếp trắng

Sau khi khảo sát thăm dò nồng độ và thời gian thủy phân của enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa chúng tôi tiến hành lên men với quá trình dịch hóa sử dụng 0,08 % α – amylase trong 15 phút và 0,3 % α – amylase trong 30 phút kết hợp với 0,4 % glucoamylase trong 30 phút cho quá trình đường hóa Khi đó sản phẩm lên men đạt yêu cầu về độ rượu (7-9%v/v) và mùi vị Điều này được giải thích là do glucoamylase cắt liên kết 1, 4 glucosit và cả 1,6 glucosit sản phẩm chủ yếu tạo

thành là glucose (Bùi Thị Quỳnh Hoa) Do đó lượng đường khử tạo thành nhiều

thuận lợi cho nấm men sử dụng để lên men được nồng độ rượu cao

Để so sánh quá trình lên men của Lê Minh Châu với quá trình lên men khi bổ sung glucoamylase trong quá trình đường hóa.Chúng tôi lên men hai mẫu trong giai đoạn đường hóa có bổ sung glucoamylase và không bổ sung glucoamylase đồng thời tiến hành đánh giá cảm quan để chọn ra mẫu có giá trị cảm quan tốt hơn để tiến hành cho thí nghiệm bảo quản

 Kết quả cảm quan giữa hai mẫu khi thủy phân có và không có bổ sung

glucoamylase

Bảng 7: Kết quả thống kê màu sắc, độ trong, mùi, vị theo mẫu

Điểm trung bình Mẫu

Hình 7: Sản phẩm rượu nếp than

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, chất bảo quản, bao bì đến chất lượng của sản phẩm rượu nếp than theo thời gian

Sau quá trình lên men chính, muốn biết được chất lượng của sản phẩm có thay đổi như thế nào trong quá trình lên men phụ chúng tôi tiến hành khảo sát những tác động ảnh hưởng đến chất lượng và giá trị cảm quan của sản phẩm đồng thời tiến hành đo các chỉ tiêu ethanol, acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu và fufurol Kết quả như sau:

4.2.1 Khi bảo quản bằng acid ascorbic

Kết quả định tính fufurol: không có

Bảng 8: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo nồng độ acid ascorbic

Acid ascorbic

(mg/kg sp) Độ rượu (%v/v) (mg/l) Acid (mg/l) Ester Aldehyde (mg/l) Màu rượu 0 7,33a 1787,88a 2303,4a 142,45a 0,49a 100 7,3a 1680,5b 2310a 165,48ab 0,41b 200 7,15a 1616c 2349a 172,76b 0,38b

Ghi chú:

Các số liệu có cùng chữ cái đi kèm thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ ý nghĩa 5%.Giá trị trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại

Từ (Hình 7) kết quả cho thấy acid giảm, este tăng, aldehyde tăng khi nồng độ acid ascorbic tăng Nhưng xét về mặt thống kê (Bảng 7) ta thấy este không có sự khác biệt ý nghĩa giữa 3 mức nồng độ này, acid và aldehyde có sự khác biệt ý nghĩa với mức ý nghĩa 5% Acid giảm là do trong giai đoạn lên men phụ rượu bậc cao phản

ứng với acid hữu cơ được tạo thành trong dịch lên men và sinh ra este Ngoài ra

acid acetic tạo thành ở giai đoạn đầu lên men và về cuối giảm đi do một số chủng

nấm men có thể đồng hóa được acid acetic như là nguồn cacbon (Lương Đức

Phẩm) Aldehyde tăng là do trong quá trình bảo quản rượu sẽ bị oxi hóa thành

aldehyde

Kết quả thống kê (Bảng 7) cho thấy độ rượu không có sự khác biệt ý nghĩa ở mức ý nghĩa 5%, màu rượu giảm và có sự khác biệt ý nghĩa là do acid ascorbic là chất chống oxi hóa, nó oxi hóa thế cho các hợp chất phenol nhưng sản phẩm của sự oxi hóa acid ascorbic là tạo ra H2O2 chính chất này lại làm giảm màu của anthocyanin do chất này không bền và phóng thích oxi nguyên tử chính oxi nguyên tử này sẽ làm giảm màu anthocyanin

Hình 8: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo nồng độ acid ascorbic

Hình 9: Đồ thị biểu diễn màu rượu theo nồng độ acid ascorbic

00.20.40.60.81