Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly tinh dầu từ lá trầu không piper betle l và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

ĐỒN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH BAN CHẤP HÀNH TP HỒ CHÍ MINH CƠNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC – EURÉKA LẦN THỨ XIX NĂM 2017 TÊN CƠNG TRÌNH: NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY TINH DẦU TỪ LÁ TRẦU KHƠNG (PIPER BETLE L.) VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU : Cơng nghệ Hóa – Dược CHUN NGÀNH : Cơng nghệ hóa học Mã số cơng trình: i MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Trầu Không 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Khái quát họ hồ tiêu 1.1.3 Sơ lược chi hồ tiêu .8 1.1.4 Nguồn gốc 1.1.5 Đặc điểm thực vật 1.1.6 Thành phần hóa học .9 1.2 Giới thiệu tinh dầu 11 1.2.1 Khái niệm tinh dầu .11 1.2.2 Phân bố tinh dầu tự nhiên 12 1.2.3 Q trình tích lũy tinh dầu 12 1.2.4 Tính chất vật lý tinh dầu 13 1.2.5 Tính chất hố học tinh dầu 14 1.2.6 Ảnh hưởng nhân tố khác đến thành phần tính chất tinh dầu trầu khơng 14 1.2.7 Ứng dụng tinh dầu trầu không .15 1.2.8 Nguyên tắc sản xuất tinh dầu từ nguyên liệu thiên nhiên 15 1.2.9 Nguyên tắc trích ly tinh dầu 15 1.2.10 Các phương pháp trích ly tinh dầu .16 1.3 Giới thiệu phương pháp chưng cất lôi nước 21 1.3.1 Nguyên lý hoạt động phương pháp chưng cất lôi nước 21 1.4 Khả kháng khuẩn chế kháng khuẩn hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật 22 ii 1.4.1 Khái niệm .22 1.4.2 Các chế kháng khuẩn .22 1.5 Giới thiệu chủng vi khuẩn gây bệnh .29 1.5.1 Staphylococcus aureus 29 1.5.2 Escherichia coli (E.coli) .31 1.5.3 Salmonella 32 1.5.4 Bacillus subtillis 34 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 36 2.1 Thời gian thực đề tài 36 2.2 Vật liệu 36 2.2.1 Nguyên liệu 36 2.2.2 Dụng cụ, thiết bị 36 2.2.3 Hóa chất 37 2.3 Phương pháp nghiên cứu .38 2.3.1 Tiến hành trích ly tinh dầu khảo sát yếu tố ảnh hưởng .40 2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước 44 2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng kích thước nguyên liệu (cắt nhỏ, xay nhuyễn) đến hàm lượng thu phương pháp chưng cất lôi nước 44 2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng tuổi nguyên liệu (lá non, bánh tẻ, già) đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước 44 2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước 44 2.3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm muối NaCl đến hàm lượng thu hồi tinh dầu 45 iii 2.3.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước .45 2.3.2.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng lượng nước chưng cất đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước 45 2.3.3 Xác định số vật lý, hoá học tinh dầu trầu không .46 2.3.3.1 Đánh giá cảm quan .46 2.3.3.2 Xác định số vật lý 47 2.3.3.3 Xác định số hoá học .48 2.3.3.4 Xác định thành phần hoá học tinh dầu 50 2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn 51 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .54 3.1 Ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước .54 3.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước trực tiếp 54 3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng tuổi nguyên liệu (lá non, bánh tẻ, già) đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 56 3.1.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng lượng nước đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước 58 3.1.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 60 3.1.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước .62 iv 3.1.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nuớc 64 3.2 Xác định số vật lý, hóa học tinh dầu trầu khơng 66 3.2.1 Đánh giá cảm quan .66 3.2.2 Định lượng tinh dầu trầu không 66 3.2.3 Kết đo tỷ trọng tinh dầu trầu không 66 3.2.4 Kết xác định độ hoà tan tinh dầu trầu không ethanol 67 3.2.5 Chỉ số hóa học tinh dầu trầu khơng .68 3.3 Kết xác định thành phần hoá học tinh dầu 68 3.4 Thử hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước .70 3.4.1 Hoạt tính kháng Salmonella tinh dầu trầu khơng thu phương pháp chưng cất lôi nước 70 3.4.2 Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước 73 3.4.3 Hoạt tính kháng E.coli tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước 75 3.4.4 Hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước 77 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .81 4.1 Kết luận 81 4.2 Kiến nghị .82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DĐVN : Dược điển Việt Nam DMSO : Dimethyl sulfoxyde DNA : Deoxyribonucleic Acid ĐC : Đối chứng E.Coli : Escherichia coli GC : Gas chromatography IA : Index acid IE : Index Ester IS : Index Savon MS : Mass spectrometry NA : Nutrient Agar NB : Nutrient Broth NXB : Nhà xuất RNA : Ribonucleic Acid TB : Trung bình TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TCVS : Tiêu chuẩn vệ sinh TSA : Trypticase Soy Agar TSB : Trypticase Soy Broth vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 54 Bảng 3.2 Ảnh hưởng tuổi nguyên liệu (lá già, bánh tẻ, non) đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp lôi nước .56 Bảng 3.3 Ảnh hưởng lượng nước đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 58 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 60 Bảng 3.5 Ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 62 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nuớc 64 Bảng 3.7 Kết định lượng tinh dầu trầu không 66 Bảng 3.8 Kết xác định tỷ trọng tinh dầu trầu không .67 Bảng 3.9 Kết xác định độ hoà tan tinh dầu trầu không phương pháp chưng cất nước ethanol 67 Bảng 3.10 Kết khảo sát số hóa học tinh dầu trầu không 68 Bảng 3.11 Kết phân tích thành phần hàm lượng tương đối hợp chất mẫu tinh dầu trầu không phương pháp GC – MS 69 Bảng 3.12 Kết kháng Salmonella tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước 71 Bảng 3.13 Kết kháng Staphylococcus aureus tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước 73 Bảng 3.14 Kết kháng E.coli tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước 75 vii Bảng 3.15 Kết kháng Bacillus subtilis tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước 78 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Một số lồi thuộc họ hồ tiêu Hình 1.2 Hình 3-Allyl-6 methoxyphenyl acetate 11 Hình 1.3 Hệ thống chưng cất nước .16 Hình 1.4 Máy ép tinh dầu .17 Hình 1.5 Hệ thống chưng cất nước hỗ trợ vi sóng .19 Hình 1.6 Những vị trí vi khuẩn bị tác động hợp chất thực vật 23 Hình 1.7 Cấu trúc Morphine 24 Hình 1.8 Quinine trích ly từ Cinchona officinalis 25 Hình 1.9 Sơ đồ phân loại saponin 27 Hình 1.10 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 30 Hình 1.11 Vi khuẩn E.coli 31 Hình 1.12 Vi khuẩn Salmonella 33 Hình 1.13 Vi khuẩn Bacillus subtilis 35 Hình 2.1 Lá trầu Piper betle L 36 Hình 2.2 Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh dầu trầu không phương pháp chưng cất lôi nước 39 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình chưng cất thu nhận tinh dầu trầu khơng 40 Hình 2.4 Hình dạng trầu không (Piper betle) 41 Hình 2.5 Lá trầu khơng sau xay nhuyễn chuyển vào bình cầu 42 Hình 2.6 Bộ chưng cất lôi nước sử dụng để trích ly tinh dầu trầu 43 Hình 2.7 Quy trình đánh giá hoạt lực kháng khuẩn tinh dầu trầu khơng .51 Hình 3.1 Đồ thị ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước .55 Hình 3.2 Đồ thị ảnh hưởng tuổi nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu trầu không thu phương pháp chưng cất lôi nước .57 ix Hình 3.3 Đồ thị ảnh hưởng lượng nước đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 59 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước 61 Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian ngâm NaCl mẫu đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lôi nước .63 Hình 3.6 Ảnh hưởng thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh dầu thu phương pháp chưng cất lơi nuớc 65 Hình 3.7 Kết kháng Salmonella tinh dầu trầu không 72 Hình 3.8 Kết kháng Salmonella thuốc kháng sinh 72 Hình 3.9 Kết kháng Staphylococcus aureus tinh dầu trầu khơng 75 Hình 3.10 Kết kháng Staphylococcus aureus thuốc kháng sinh .75 Hình 3.11 Kết kháng E.coli tinh dầu trầu không 77 Hình 3.12 Kết kháng E.coli thuốc kháng sinh 77 Hình 3.13 Kết kháng Bacillus subtilis tinh dầu trầu không 79 Hình 3.14 Kết kháng Bacillus subtilis thuốc kháng sinh 79 13 Source F Value Pr > F 334.27 THOIGIANCHUNG F DF Sum of Squares Mean Square Model 0.0003 217.0666667 54.2666667 Error 10 34.6666667 3.4666667 Corrected Total 14 251.7333333 15.65 Value F R-Square Coeff Var Root MSE DKINH Mean 0.862288 12.81123 1.861899 14.53333 Source Pr > F DF Anova SS Mean Square F PLOANG 217.0666667 54.2666667 15.65 0.0003 HOAT TINH KHANG SALMONELLA CUA TRAU KHONG;RUN;DATA;INPUT PLOANG $ DKINH; CARDS;10^1 2010^- 01:11 Friday, July 24, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DKINH NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 3.466667 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 3.3873 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N PLOANG A 20.000 10^1 A 16.667 10^-1 B 16 B C 14.667 10^-2 C 12.667 10^-3 D 8.667 10^-4 HOAT TINH KHANG SALMONELLA CUA TRAU KHONG;RUN;DATA;INPUT PLOANG $ DKINH; CARDS;10^1 2010^- 01:11 Friday, July 24, 2017 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for DKINH NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 3.466667 Critical Value of t 3.16927 Least Significant Difference 4.818 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N PLOANG A 20.000 10^1 A 16.667 10^-1 14.667 10^-2 C 12.667 10^-3 C 8.667 10^-4 B B B Xử lý thống kê kết mức độ kháng khuẩn tinh dầu trầu không vi sinh vật Staphylococcus aureus HOAT TINH KHANG STAPHYLOCOCCUS AUREAUS CUA TRAU KHONG; RUN;DATA;INPUT PLOANG $ DKINH; CARDS;10 01:16 Friday, July 24, 2017 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values 17 PLOANG 10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^1 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 HOAT TINH KHANG STAPHYLOCOCCUS AUREAUS CUA TRAU KHONG;RUN;DATA;INPUT PLOANG $ DKINH; CARDS;10 01:16 Friday, July 24, 2017 The ANOVA Procedure Dependent Variable: DKINH DF Sum of Squares Mean Square 923.7333333 230.9333333 Error 10 16.6666667 1.6666667 Corrected Total 14 940.4000000 Source F Value Pr > F 138.56 Model F DF Anova SS Mean Square PLOANG 923.7333333 230.9333333 138.56 F 19.86 Model F 19.86 PLOANG F 31.20 Model F 31.20 NONGDO