Lược khảo tài liệu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bảo quản rượu nếp than sản xuất bằng công nghệ enzyme và nấm men thuần chủng

Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Gạo nếp than Gạo nếp than loại gạo đặc biệt trồng nhiều Nam Bộ Vì rượu nếp than sản xuất chủ yếu vùng Nam Bộ Gạo nếp than gồm loại: - Nếp cẩm Đức Hòa - Nếp đen Khánh Vĩnh - Nếp than Long Đất - Lúa lức nếp cẩm Hình 1: Gạo nếp than Các loại lúa có suất khơng cao, thường đạt 2,8 – 3,3 tấn/ha Hiện dân vùng Đồng Nam phân loại nếp than theo màu sắc hạt gạo Theo cách nếp than chia thành loại: - Nếp than đen huyền - Nếp than hồng đỏ Màu nếp than màu anthocyanin Anthocyanin tinh khiết dạng tinh thể vơ định hình hợp chất phân cực nên tan tốt dung môi phân cực Màu sắc anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào pH, chất màu có mặt nhiều yếu tố khác, nhiên màu sắc anthocyanin thay đổi mạnh phụ thuộc vào pH môi trường pH thấp anthocyanin thường có màu đỏ, trở thành khơng màu pH cao thành xanh pH cao Tuy khác màu sắc bên ngoài, thành phần hoá học loại nếp than khơng khác nhiều Bảng 1: Thành phần hóa học gạo nếp than Thành phần Nước Protein Lipid Glucid Acid hữu Tro Hàm lượng 14 8,2 1,5 74,9 0,6 0,8 Nguyễn Đức Lượng,2003 Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ 2.1.2 Enzyme Hệ enzyme thủy phân tinh bột thành đường hệ enzyme amylase Hệ tồn nước bọt, dịch tiêu hoá, hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm mem … Có nhiều loại enzyme amylase: α-amylase, β-amylase, γ-amylase số tìm từ nguồn gốc vi sinh vật là: pullutanase, isoamylase … Có nhiều nguồn cung cấp amylase khác nhau, tuỳ thuộc vào nguồn mà enzyme có điều kiện phát triển riêng Đề tài đề cập đến việc sử dụng enzyme amylase thương mại để thực q trình đường hố α-amylase α-amylase bị kìm hãm ion kim loại nặng Cu2+, Hg2+ α-amylase bền môi trường acid bền nhiệt Nhiệt độ tối thích α amylase 72 – 760C, pH hoạt động tối thích 5,3 – 5,8 α-amylase bị vơ hoạt 800C α-amylase có khả phân cắt liên kết α - 1,4 Glucozit vị trí mạch tinh bột hồ hóa Do gọi enzyme nội phân (endoenzyme) Amylose bị phân cắt nhanh tạo thành oligoshaccaride gồm -7 gốc glucose, sau mạch bị phân cắt bị phân giải chậm thành maltose Sản phẩm thủy phân amylose bao gồm: 87% maltose, 13% glucose Amylosepectin bị phân giải nhanh α-amylase không phân cắt liên kết α 1,6 glucozit nên sản phẩm thủy phân có khoảng 72% maltose, 19% glucose, dextrin phân tử thấp 8% izomaltose β-amylase β-amylase bền khơng có ion Ca2+, bị kìm hãm ion kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+, urê, iodo, acetanic, iod, ozon pH tối thích dung dịch nấu 5-5.6 Nhiệt độ tối thích dung dịch nấu 60-65oC bị vô hoạt 70oC β-amylase xúc tác thủy phân liên kết α-1,4 glucozid tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loại Phân cắt gốc maltose đầu không khử β-amylase gọi enzyme ngoại phân (exo-enzyme) β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose Phân giải 54-58% amylopectin thành maltose, phần lại dextrin Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ γ-amylase Hoạt động tốt 50oC, hoạt lực tối đa vùng pH = 3,5-5,5 γ-amylase có khả xúc tác thủy phân liên kết α -1,4; 1,6 glucozid tinh bột, glycogen, polysaccharide kiểu maltose Là enzyme ngoại phân exo-enzyme Nó thủy phân polysaccharide từ đầu khơng khử gốc glucose một, không thủy phân dextrin vòng Sản phẩm tạo thành: Glucose dextrin vòng 2.1.3 Nấm men Cấu tạo sinh sản nấm men Nấm men có cấu tạo đơn bào thường sinh sản cách nẩy chồi phân cắt Tế bào nấm men có hình trứng (men bia), hình elip (men rượu vang), hình cầu (Torulopsis), hình gậy (Candida), hình chanh Kích thước tế bào nấm men khoảng - 15µm Nấm men sinh sản chủ yếu hình thức nảy chồi Tế bào mẹ nảy sinh thành chồi nhỏ lớn dần lên tách Quá trình xảy khoảng Ở số giống nấm men, tế bào không tách rời mà kết thành chuỗi Đặc tính có nấm men tạo màng Hình 2: Saccharomyces cerevisiae Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Thành phần hóa học nấm men Thành phần hóa học tế bào nấm men thể bảng sau: Bảng 2: Thành phần hóa học nấm men Thành phần Hàm lượng (% chất khô) Cacbon 49,8 CaO 12,4 Nitro 6,7 Hydro 3,54 P2O5 2,34 K2 O 0,04 SO3 0,42 MgO 0,38 Fe2O3 0,035 SiO 0,09 “Nguyễn Đức Lượng, 1996” Nấm men sản xuất rượu từ tinh bột Saccharomyces Cerevisiae Rasse II: Chủng sinh sản môi trường nước đường, thường tụ lại thành đám, sau thời gian ngắn lắng xuống Đặc điểm lồi tế bào có nhiều hạt glycogen, khơng bào lớn hình thành bào tử nội sinh chậm, sinh bọt nhiều thích nghi với độ acid thấp, có sức kháng cồn cao, khơng lên men lactose, kích thước tế bào từ 5-7 μ m Saccharomyces Cerevisiae Rasse XII: Phân lập Đức năm 1902 Tốc độ phát triển nhanh, sau 24 từ tế bào phát triển thành 55 tế bào lồi khơng bào nhỏ, sinh bọt, tế bào hình trứng hình trịn, kích thước vào khoảng 5-8 μ m, lên men nhiệt độ cao lên men đường glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose 1/3 đường rafinose, không lên men đường lactose, lên men đến 13% rượu Nấm men Saccharomyces Cerevisiae Rasse XII thuộc loại men nổi, phân bố dịch lên men không tạo thành đám trắng Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ R211 Loại nấm men phân lập từ men thuốc bắc nhà máy rượu Hà Nội Tế bào hình ovan có kích thước (3-5) x (5-8) μ m, lên men đường glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose Được dùng sản xuất rượu từ nguyên liệu chứa tinh bột như: gạo, ngô, khoai, sắn Sinh sản nhanh sau cấy từ 12 đến 16 giờ, lên men tốt dịch đường 120-140g/l 160-180g/l lên men hiệu suất chuyển hóa thấp Nồng độ rượu tạo thành mơi trường lên men 10- 12 % Nhiệt độ lên men thích hợp 28 đến 300C, đến 380C lên men Chúng có khả chịu chất sát trùng Na2SiF6, nồng độ 0,02% (nồng độ vi khuẩn bị ức chế) “Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002” 2.1.4 Nước dùng sản xuất rượu nếp than Độ cứng không mg đương lượng / lit phải suốt không màu không mùi, hàm lượng muối không giới hạn Bảng 3: Hàm lượng muối nước sử dụng sản xuất rượu bia Ion - Cl SO42As Pb NO3 Hàm lượng (mg/l) Ion Hàm lượng (mg/l) 0,5 80 0,05 0,1 40 F Zn Cu Fe 3 0,3 (Bùi Thị Quỳnh Hoa , 2002) Khả oxy hóa lit nước khơng 2ml dd KMnO4 (0,01N) Chất cặn không vượt 1000ml/l Hàm lượng chất hữu không vượt 4mg/l Vi sinh vật khơng có pH kiềm khơng thích hợp cho q trình nấu ngun liệu, có khả tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển thúc đẩy trình tạo thành glyceryl trình lên men Ecoli < 20 tế bào/ lit Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ 2.2 Cơ sở lý thuyết trình lên men 2.2.1 Quy trình sản xuất rượu vang nếp than - Sơ đồ quy trình Gạo nếp than Nghiền Enzyme amylase Nấu Lọc Thanh trùng Nấm men (1%) Làm nguội (33oC) Lên men (4 ngày) Hãm cồn (20%V) Lên men phụ (6 tháng) Chiết Sản phẩm Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 - Trường Đại học Cần Thơ Thuyết minh số cơng đoạn qui trình Nghiền Gạo nếp than sau làm đem nghiền mịn nhằm giúp cho tinh bột số chất khô khác dễ hịa tan q trình nấu Nấu Hình 3: Bột nếp than Mục đích q trình nấu phá vỡ màng tế bào tinh bột, chuyển hạt tinh bột từ trạng thái không tan thành trạng thái hoà tan nước nhằm tạo điều kiện cho enzyme amylase dễ dàng công vào hạt tinh bột Cho khoảng 10% enzyme vào nếp than nghiền pha lỗng sẵn, sau nâng nhiệt lên đến 72oC giữ nhiệt độ 15 phút enzyme dịch hoá Tiếp tục đun cho dịch cháo đến sôi giữ nhiệt độ sôi 10 phút cho tinh bột hồ hố hồn tồn Làm nguội dịch cháo đến nhiệt độ cần khảo sát (65 – 75oC) cho hết lượng enzyme vào Giữ nhiệt độ khoảng 30 phút q trình đường hóa kết thúc đem lọc Nấu cịn có tác dụng tiêu diệt hầu hết vi sinh vật gây hại cho trình lên men sau Thanh trùng Tiêu diệt vi sinh vật không mong muốn phát triển cạnh tranh với nấm men Làm nguội Hỗn hợp sau thủy phân tinh bột có nhiệt độ cao Trong nấm men phát triển tốt nhiệt độ khoảng 30 – 33oC Vì ta phải làm nguội hỗn hợp xuống để tạo môi trường thuận lợi cho nấm men phát triển Lên men Tiến hành lên men nhiệt độ thường, thời gian có hai trình xảy song song với mức độ khác nhau, q trình tăng sinh khối nấm men q trình rượu hóa Ổn định Rượu vang nếp than lên men nhiệt độ cao lại không qua chưng cất, nên sau lên men xong nhiều rượu bậc cao aldehyde gây độc cho thể người Vì vậy, cần có thời gian dài sản phẩm phụ chuyển hóa ổn định rượu, làm cho chất lượng rượu tốt Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ 2.2.2 Khái quát trình lên men rượu Lên men rượu trinh trao đổi chất nhờ tác dụng enzyme tương ứng gọi chất xúc tác sinh học (được sinh từ trao đổi chất để trì sống nấm men) Tùy theo sản phẩm tích tụ sau trình lên men người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác Tuy nhiên, có hai hình thức lên men chính: lên men yếm khí lên men hiếu khí - Lên men yếm khí: phân hủy đường khơng có diện oxy trình lên men lactic, len men rượu, butylic… - Lên men hiếu khí: phân hủy đường có diện O2 trình lên men axit acetic, citric… Lên men rượu, bia trình lên men yếm khí với có mặt nấm men (Yeast) Nấm men chuyển hóa đường lên men thành rượu etylic CO2 Nguời ta cịn gọi q trình cồn hóa, rượu hóa Trong q trình lên men rượu người ta chia làm hai thời kì chính: - Thời kì phát triển sinh khối: giai đoạn với có mặt O2 tế bào nấm men phát triển sinh khối (gia tăng kích thước số lượng) - Thời kì lên men chuyển đường thành rượu CO2: giai đoạn này, nấm men hấp thụ chất dinh dưỡng sử dụng enzyme sẵn có để thực xúc tác sinh hóa q trình trao đổi chất để trì sống tạo thành rượu CO2 2.2.3 Cơ chế trình lên men Để lên men, người ta cho vào môi trường lượng tế bào nấm men định Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác Thông thường lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt > 100 triệu tế bào ml dung dịch lên men Do diện tích bề mặt tế bào nấm men lớn nên khả hấp thụ chất dinh dưỡng mạnh Đuờng lên men chất dinh dưỡng khác môi trường lên men trước tiên hấp thụ bề mặt nấm men sau khuếch tán qua màng tế bào vào bên tế bào nấm men, rượu CO2 tạo thành Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Rượu ethylic tạo thành khuếch tán môi truờng bên ngồi qua màng tế bào nấm men Rượu hịa tan vô hạn nước nên khuếch tán nhanh vào mơi trường CO2 hịa tan vào mơi trường hịa tan khơng lớn Ở áp suất 800mmHg, nhiệt độ 25 – 300C 0,857 – 0,837 lít CO2 lít nước Vì thế, CO2 sinh trình lên men khuếch tán vào mơi trường nhanh chóng đạt trạng thái bão hòa Khi bão hòa, CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành bọt khí Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ngày nhiều lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc có chênh lệch khối lượng riêng môi trường tế bào nấm men lên bề mặt Khi đến bề mặt, có thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ làm cho khí CO2 bị phóng thích bên ngồi Lúc khối lượng riêng nấm men đủ lớn trở lại nên chúng bị chìm xuống Qúa trình diễn liên tục nên tế bào nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái động, làm gia tăng khả tiếp xúc tế bào nấm men mơi trường điều làm cho q trình trao đổi chất diễn nhanh hơn, làm tăng nhanh q trình lên men Khí CO2 ức chế q trình lên men, q trình khí CO2 làm tăng khả lên men nấm men Kích thước, vật liệu chế tạo thiết bị lên men, chất hịa tan mang điện tích, vật lơ lửng khác diện dịch lên men điều ảnh hưởng đến khí CO2 nên ảnh hưởng đến trình lên men “Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002” 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men Có năm yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men rượu sau: - Nồng độ đường Nấm men có khả lên men đường thành rượu khoảng nồng độ thích hợp từ 10 – 18%, nồng độ đường cao ức chế nấm men khả lên men rượu giảm nồng độ đường 30 – 35%, nồng độ đường thấp làm giảm lực lên men - Ảnh hưởng nhiệt độ Để thấy rõ ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động sống nấm men cụ thể nấm men Saccharomyces Cerevisiae Rasse XII trình lên men rượu Nấm men chủng XII phát triển tốt nhiệt độ 30 – 330C, nhiệt độ tối đa 380C, tối thiểu 50C Nấm men nuôi cấy nhiệt độ thấp nhiệt độ tối ưu 17 – 220C có lực lên men lớn Đối với trình lên men nấm men chịu giới hạn nhiệt độ rộng từ – 450C Nếu nhịêt độ 500C nấm men chết Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 10 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ - Ảnh hưởng acid (pH) Nấm men phát triển mơi trường có số pH = – thích hợp – 4,5 Vi khuẩn bắt đầu phát triển pH = 4,2 cao hơn, pH < 4,2 có nấm men phát triển Vì vậy, lên men rượu để ngăn ngừa khả nhiễm khuẩn người ta thực giới hạn pH = 3,8 – 4,0 Tuy nhiên thực tế có lồi vi khuẩn quen dần ( hoá) với độ pH thấp nên việc ứng dụng điều chỉnh pH thích hợp cịn phải kết hợp sử dụng chất sát trùng Khi pH = nấm men phát triển kém, ngược lại vi khuẩn phát triển mạnh Ở pH = 3,8 nấm men phát triển mạnh vi khuẩn chưa phát triển Để tạo pH thích hợp mơi trường ni cấy nấm men (kể lên men) người ta bổ sung vào môi trường loại acid nào, miễn anion acid không gây ảnh hưởng mạnh đến trung tâm hoạt động nấm men - Ảnh hưởng nồng độ rượu Nồng độ rượu sinh có ảnh hưởng đến tốc độ khả phát triển nấm men Nồng độ rượu ảnh hưởng đến tốc độ phát triển riêng nấm men phù thuộc vào thời gian, số lượng tế bào nguyên liệu chuẩn bị cho môi trường nuôi cấy Cùng môi trường nuôi cấy, số lượng nấm men cho vào nhau, điều kiện ni cấy giống nồng độ rượu ban đầu 1% chưa có ảnh hưởng đến tốc độ khả phát triển nấm men, từ – 6% có ảnh hưởng xấu - Ảnh hưởng oxy Nấm men loại vi sinh vật kỵ khí khơng bắt buộc Trong điều kiện khơng có oxy nấm men lên men đường tạo thành rượu CO2, điều kiện đầy đủ oxy nấm men có khả oxy hóa đường thành rượu CO2 tăng sinh khối “Hiệu ứng Pastuer” kìm hãm lên men rượu O2 Oxy thành phần thiếu giai đoạn phát triển sinh khối Tùy nhiên nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu giai đoạn chế biến lại Với có mặt O2 nấm men lên men khơng hồn tồn chúng phát triển sinh khối Trong giai đoạn bảo quản chúng làm cho sản phẩm có nhiều aldehyt, sản phẩm dễ bị biến màu phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu gây tối màu cho sản phẩm, làm chua sản phẩm hình thành acid hữu (vi khuẩn lactic, acetic…) gây thối cho sản phẩm rượu theo thời gian bảo quản (do rượu bia môi trường giàu chất dinh dưỡng cho vi khuẩn gây thối phát triển Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 11 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Một số trình lên men giai đoạn đầu diễn chậm không đủ lượng O2 cho phát triển sinh khối, không đủ lượng tế bào lên men ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm dây chuyền sản xuất Tuy nhiên lại có số nấm men phát triển nhanh tạo hàm lượng rượu nhiều môi trường không khí, chủng thường ni cấy phát triển mơi trường ban đầu có đầy đủ oxy “Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002” 2.2.5 Các sản phẩm phụ sản phẩm trung gian trình lên men - Sự tạo thành acid Trong q trình lên men rượu ln tạo acid hữu bao gồm: acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyrovic acid succinic nhiều acid acetic acid latic Acid acetic tạo thành từ phản ứng oxy hố khử hai aldehyde acetic – phân tử bị oxy hoá, phân tử thứ hai bị khử: CH3CHO + CH3CHO + H2O = CH3COOH + C2H5OH Acid lactic tạo pyrovat dehydronase theo phản ứng: CH3CO-COOH + NAD.H2 = CH3CHOHCOOH + NAD Hoặc CH2O(H2PO3)CHOHCHO + H2O = CH3CHOHCOOH + H3PO4 Acid citric theo Laphon tạo từ aldehyde acetic Phản ứng biểu diễn tổng quát sau: 9CH3CHO + 4H2O = (CH2COOH)2C(OH)COOH + 6CH3CH2OH Acid succinic tạo thành theo hai đường: dehydro trùng hợp hai phân tử acid acetic với phân tử aldehyde acetic: 2CH3-COOH + CH3CHO COOHCH2CH2COOH + C2H5OH Hoặc tạo thành deamin acid glutamic Trường hợp aldehyde glyceric tiếp nhận hydro tạo glycerin Phương trình tổng quát tạo acid succinic với glycerin từ acid glutamic biểu diễn sau: C6H12O6 + COOH-CH2-CH2-CHNH2COOH + 2H2O = COOH-CH2CH2COOH + 2C3H8O3 +NH3 + CO2 Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 12 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Glycerin aldehyde sản phẩm trung gian lên men rượu Trong điều kiện lên men nhằm mục đích thu rượu etylic, người ta khống chế pH dịch lên men giới hạn 4,5 – 5,2 Với điều kiện lượng glycerin tạo thành chiếm 0,3 – 0,45% dịch giấm chín, tương ứng tiêu tốn đường – 3% so với lượng đưa vào Nếu tăng pH tới kiềm lượng đường tham gia tạo glycerin tăng tới 23,4% đường tạo aldehyde chưa chuyển thành rượu đạt 11,9% Lên men đường xảy theo phương trình: 2C6H12O6 + H2O = 2C3H8O3 + CO2 + CH3COOH + CH3CH2OH “Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng 2005” - Sự tạo thành rượu bậc cao Một sản phẩm phụ quan trọng tạo thành trình lên men rượu, rượu có số ngun tử carbon lớn hai Các alcol lẫn vào etylic gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm Đó alcol propylic, izobutylic, izoamylic, amylic v.v…Hàm lượng chúng khoảng 0,4 – 0,5% so với cồn etylic gây cho sản phẩm có mùi khó chịu Các alcol có tên chung dầu fusel nấm men sử dụng nitơ acid amin Phương trình tổng quát trình tạo thành alcol có phân tử cao đơn giản theo phản ứng: R-CH(NH2)-COOH + H2O RCH2OH + NH3 + CO2 Như việc tạo thành alcol cao phân tử gắn liền với biến đổi acid amin xảy điều kiện yếm khí đồng thời với lên men rượu, tạo thành alcol cao phân tử lên men axit amin bị NH3, sau CO2 cuối aldehyt bị khử để tạo alcol Bằng đường tương tự, nhiều acid amin tạo thành valin izolơxin … chúng tiền đề để tạo alcol bậc cao sau Thực trình amin hố acid pyrovic xảy phức tạp, qua nhiều giai đoạn có liên hệ chặt chẽ với Acid acetic tạo thành có hoạt tính cao lại tác động cho trình khác - Sự tạo thành ester sản phẩm phụ khác Sự tạo thành ester Song song với việc tạo acid alcol, tác dụng enzyme nấm men, acid alcol tác dụng lẫn để tạo ester tương ứng Phương trình tổng quát: R1CH2OH + R2COOH R2COO-CH2R1 + H2O Este etylic tạo thành alcol etylic kết hợp với axit axetic tham gia phản ứng aldehyde Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 13 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Sự tạo thành metanol Trong trình nấu nguyên liệu, chất pectin este axit polygalacturovic bị thủy phân tạo thành axit pectic alcol metylic Sự tạo thành fufurol Đường chứa nguyên liệu chủ yếu saccaroza, glucoza, fructoza maltoza tạo thành thời gian nấu Ở nhiệt độ cao đường bị phân hủy nước để tạo thành caramen, fufurol, oxymetyl fufurol melanoidin Đường pentoza bị ba phân tử nước tạo thành fufurol Sự tạo thành aldehyde Là sản phẩm trình trao đổi chất nấm men tạo thành qua đường oxy hóa loại rượu Chủ yếu hàm lượng acetaldehyde Decacboxyl hóa Acid pyruvic accetaldehyde Lượng sản phẩm phụ sản phẩm trung gian tạo thành trình lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố Chúng thay đổi theo nhiệt độ, pH, mức độ sục khí chủng giống nấm men nguồn nguyên liệu 2.3 Sắc tố anthocyanin rượu vang nếp than 2.3.1 Sắc tố anthocyanin Cấu tạo Anthocyanin sắc tố tan nước, phổ biến thực vật, có màu đỏ, xanh da trời, màu phối hợp đỏ xanh (thành màu tím), có trái cây, hoa, mơ thực vật Đây chất màu có mặt rộng rãi thực vật khắp nơi giới Anthocyanin glycoside anthcyanidin với monosaccharide (glucose, galactose, rhamnose, xylose…), di trisaccharide Anthocyanidin tan nước anthocyanin không thấy tự tự nhiên Anthocyanin dẫn xuất polyhydroxy methoxy flavylium Trong thực phẩm có anthocyanidin phổ biến (pelargonnidin, cyaniding, delphinidin, peonidin, petunidin, malvidin), khác độ hydroxyl methoxyl hóa vịng B Chun ngành cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 14 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Tính chất Màu anthocyanin xác định cấu trúc hóa học mơi trường bên ngồi Có thể hai anthocyanin khác cho màu giống hay hai anthocyanin giống lại cho màu khác Khi tăng số nhóm hydroxyl vào phân tử làm cho chuyển từ màu đỏ sang màu xanh (blue) Khi thay nhóm hydroxyl nhóm methoxyl làm ngược lại khuynh hướng đổi màu pH thấp anthocyanin thường có màu đỏ, trở thành không màu pH cao thành xanh pH cao Sự biến đổi dạng anthocyanin theo pH: Hình 4:Cơng thức cấu tạo anthocyanidin - pH thấp, tồn dạng cation, màu đỏ - pH gần đẳng điện, không mang điện, không màu - pH cao, tồn dạng anion, màu xanh (blue).Ở pH cao hơn, anthocyanidin tự bị phân rã tạo thành aldehyde acid carboxylic 2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến anthocyanin Nhiệt độ: tăng nhiệt độ dẫn đến thay đổi độ hấp thu cực đại, màu anthocyanin giảm gia tăng nhiệt độ pH: pH cao thấp dẫn đến thối hóa màu anthocyanin, hiệu chất màu đạt cực đại pH = 3,5 Thời gian bảo quản ánh sáng: tăng thời gian bảo quản chất màu anthocyanin giảm bảo quản điều kiện môi trường khác ảnh hưởng đến sắc tố anthocyanin Thời gian bảo quản chiếu sáng trực tiếp ảnh hưởng lên ổn định anthocyanin Các nhà nghiên cứu cho giữ mẫu ngồi ánh sáng nồng độ chất màu giảm mạnh tối Các yếu tố khác ảnh hưởng đến màu anthocyanin nồng độ chất màu kết hợp với anthocyanin, tỉ lệ tương đối hỗn hợp anthocyanin, ảnh hưởng sắc tố khác carotenoid, chlorophyll Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 15 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ 2.4 Vi sinh vật rượu Vi khuẩn phát triển rượu vi khuẩn acid acetic acid lactic loại địi hỏi cần phải có oxi Vi khuẩn acetic cần có oxi để phát triển chuyển thành giấm vi khuẩn acid lactic phát triển tốt điều kiện hàm lượng oxi thấp Trong nước quả, men cịn có nhiều loại khuẩn, khuẩn khó nghiên cứu men kích thước nhỏ men nhiều: gần nhờ có kính hiển vi điện tử biết rõ thêm cấu trúc chúng Men chuyển đường thành rượu, gây thay đổi có ích, cịn khuẩn tác động đến nhiều thành phần nước hay rượu, chuyển thành chất có hại: khuẩn xêrin, làm cho rượu có vị chua, vị đắng, có mùi … 2.4.1 Hư hỏng vi khuẩn acetic Vi khuẩn acid acetic vi khuẩn thuộc giống Acetobater Chúng có khả oxi hóa mạnh pH = 4,5 ethanol chuyển thành axit axetic oxi hóa acid acetic thành CO2 nước Có lồi cơng nhận là: A aceti, A pasteurianus A peroxydans tìm thấy rượu Một số lồi khác quan trọng hư hỏng rượu A xylinum loài phụ A aceti Những giống A aceti sử dụng việc sản xuất giấm Rượu pha thêm rượu mạnh: Bobadilla đề nghị rượu sử dụng việc sản xuất rượu pha chứa tối thiểu 14,5% ethanol Tuy nhiên, Cruess thấy hóa giấm xảy nhanh rượu nguyên chất chứa 14,7% ethanol California Vaughn cho hầu hết vi khuẩn acetic chịu nồng độ ethanol tối đa nằm khoảng 14 – 15%; ông cho lồi giống Acetobacter tồn khơng phát triển 10% ethanol Rượu vang để tiếp xúc rộng rãi với khơng khí sau vài tuần bị màng trắng bao phủ: màng giấm Khuẩn giấm biến cồn êtilic thành axit axetic, rượu vang có mùi giấm Một phần nhỏ axit axetic lại hợp với cồn êtilic thành este, ethyl acetate chất có mùi chua gắt, khó chịu giấm Người ta nếm rượu vào mùi ethyl acetate để đánh giá rượu có bị chua giấm hay không Phản ứng tạo thành giấm C2H5OH + O2 → CH3COOH + H2O Tuy nhiên, Peynaud cho mùi chua giấm ethyl acetate, este hình thành vi khuẩn acetic C2H5OH + CH3COOH → CH3COOC2H5 + H2O Một số vi khuẩn lên men giấm sản xuất nhiều ethyl acetate sản phẩm khác, ethyl acetate bị bay trước lên men hòa vào rượu Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 16 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Khuẩn giấm phát triển mạnh hay yếu, tùy thuộc nhân tố sau đây: - Số lượng khuẩn ban đầu, phải tìm cách lọc, giữ vệ sinh để giảm lượng khó loại hồn tồn - Độ nhiệt ảnh hưởng lớn, thí dụ lượng axit axetic hình thành 280C cao gấp đôi 230C - Độ pH ảnh hưởng lớn, rượu chua khuẩn giấm khó sinh sản, thí dụ pH 3,2 thấy xuất khuẩn giấm - Polifênola - tanin có tác dụng kiềm hãm (nhẹ) - Các vitamin ảnh hưởng khuẩn lactic, cần thiết axit pantothenic, nicotinamit, axit p - amino benzoic thiamin (B1) - Khuẩn giấm cần nhiều oxy Thí dụ muốn tăng axit bay 0,8 g lít rượu vang, khuẩn phải có tối thiểu lít khơng khí Vậy giữ rượu vang chai, lọ nút kín, khơng cho tiếp xúc với khơng khí cách tốt để chống bệnh chua giấm Vì có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động men giấm nên có khuẩn, khơng thiết rượu vang bị bệnh chua giấm Vậy phải thử khả bị chua giấm sau: cho rượu vang muốn thử vào chai vô trùng, nút đổ rượu đầy tới 3/5 chai Để chống chua giấm nên đựng rượu vang chai, lọ kín tuyệt đối chai, rượu phải đầy lên sát nút, để lại chai khơng khí tốt 2.4.2 Hư hỏng vi khuẩn acid lactic a Sinh thái khuẩn lactic Khuẩn nhỏ men, di chuyển dễ men, dựa vào môi giới trùng, gió Nên nghĩ khuẩn men, xâm nhập vào nước nhờ có sẵn nho; năm gần (khoảng 1960), người ta có chứng chắn nhờ có kỹ thuật phát hiện, phân lập tiến Có thể hình dung sau, q trình hoạt động khuẩn lactic sau: Trên có khuẩn lactic Trong xưởng rượu dụng cụ chế rượu có Vì nước có sẵn nhiều loại khuẩn lactic Khơng phải tất khuẩn tồn tại: số khơng thể sinh sản pH q thấp, xác, hạt, chổ chua giàu chất khống khuẩn sống được; có độ cồn tăng lên dần khuẩn bị ức chế Cuối có tỉ lệ thấp khuẩn có mặt lúc đầu sống sót sau gây lên men malôlactic (biến acid malic thành acid lactic), nhờ thích ứng với điều kiện mơi trường có cồn chúng sinh sản chậm sau thời gian tiềm sinh Cần ý q trình lên men, điều kiện khơng thuận cho khuẩn lactic tăng dần, người ta cho thêm men với số lượng lớn Tế bào men đơng hơn, thích hợp với cồn, với pH Chun ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 17 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ thấp nên chiếm hết thức ăn khuẩn; cho thêm SO2 vào lại thuận cho men cho khuẩn men chịu đựng giỏi Như lên men malôlactic bắt đầu không muộn lên men rượu, bị kiềm hãm dần lại diễn thực vài ngày vài tuần sau lên men rượu xong kết thích nghi dần số tế bào khuẩn giỏi chịu đựng b Hoạt động khuẩn lactic Trong tự nhiên, lên men lactic diễn nói trên: sau cho nước vào bể lên men, đầu lên men lactic bắt đầu sau ngừng lại khuẩn lactic bị cồn etylic hình thành ức chế Sau lên men rượu xong cịn số khuẩn, 2/3 số rượu thăm dị có khoảng 10 000 khuẩn/cc phải có khoảng 1.000.000 acid malic bị phân hủy đáng kể Sau thời gian tiềm sinh từ vài ngày đến vài tuần lễ, số lượng khuẩn lactic tăng dần, trình lên men malôlactic bắt đầu Sau acid malic bị phân hủy hết số lượng khuẩn lactic lại giảm - Độ pH có ảnh hưởng lớn, pH thích hợp cho khuẩn lactic 4,2-4,5, độ pH này, khuẩn lactic thường khuẩn que (lactobacillus) có khuynh hướng phân hủy acid malic mà đường, acid tatric làm hỏng rượu Nếu pH thấp 3,5-3,2 khuẩn hoạt động khó khăn cịn sống sót số khuẩn cầu (Leuconostoc); pH thấp, cần tới tác động khuẩn lactic làm cho rượu bớt chua, khuẩn lại khó sinh sống: mâu thuẩn cần phải có thích ứng dần số dịng khuẩn; số lượng nhiều lên men malôlactic - Độ nhiệt tác động đến khuẩn giống men, thích hợp vào khoảng 25-30 0C Tuy nhiên độ nhiệt lên tới 300C lượng cồn etylic cao khuẩn lactic bị diệt Vì lên men malolactic giữ rượu 20-250 thích hợp - Yêu cầu oxy Người ta thường cho khuẩn lactic yếm khí, trái với khuẩn giấm háo khí Thực khuẩn lactic chịu yếm khí có oxy hịa tan nước hoạt động có phần tốt hồn tồn yếm khí - u cầu acid amin Mỗi lồi khuẩn có u cầu định loại acid amin; yêu cầu khuẩn cầu cao khuẩn que mặt - Yêu cầu vitamin Cũng men, khuẩn cần có vitamin định mơi trường mặt yêu cầu khuẩn que lại cao khuẩn cầu Acid pantothenic nicotinic nói chung cần thiết cho đa số khuẩn; Riboflavin (B2), acid folic đơi thiamin (B1) cần thiết có tính chất kích thích tùy theo loại khuẩn Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 18 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ c Kết hoạt động khuẩn lactic: lên men malôlactic bệnh rượu - Lên men malolactic Khuẩn lactic gây nên thay đổi rượu đa số có hại, có thay đổi có ích: biến acid malic thành acid lactic Acid malic công thức có nhóm COOH có hai chức acid: acid lactic có nhóm COOH, chức acid; nên biến acid malic thành acid lactic giảm độ chua nữa, rươu dịu đi, ngồi acid malic có vị chua gắt, khó chịu, cịn acid lactic có vị mềm Lên men malôlactic không cung cấp lượng cho khuẩn lactic khuẩn lại phải phân hủy thành phần khác rượu để lấy lượng Vì khơng có khuẩn lactic hồn tồn có ích Thực người ta phân biệt hai nhóm khuẩn lactic: nhóm nguy hiểm phân hủy thành khác rượu nhiều phân hủy acid malic, nhóm thứ hai thường quen phân tích acid malic khuẩn có ích có hại điều kiện đặc biệt Trong trình chế rượu, theo dõi lên men rượu, đồng thời phải theo dõi lên men malôlactic Phải phân tích định kỳ đặn độ chua tổng cộng, acid bay hơi, lượng acid malic Khi hết axit malic gạn cặn, lọc để loại bớt khuẩn cần tiệt trùng - Bệnh rượu vang Chỉ có lên men malôlactic tăng chất lượng vang Những biến đổi khác khuẩn lactic gây có hại phá hủy thành phần vang, làm cho vang bị bệnh Bệnh vang dính (vins filants): rót rượu cốc vang khơng chảy đều, lỏng nước mà dính có hồ nếp Đó khuẩn lactic loại Leuconostoc, điều kiện định, tiết quanh loại đường riêng gọi dextran Bệnh thường kéo theo bệnh chua tatric bệnh vang đắng Bệnh chua lactic (piqure lactique) Xảy rượu vang lại đường khử, chưa chuyển hết thành rượu Đường khử bị khuẩn lactic phá hủy chuyển thành đường manit acid bay hơi, gây mùi chua khó chịu Là bệnh phổ biến rượu vang, xảy cho thêm nhiều đường, kỹ thuật lên men thấp, làm cho "con men" ngừng hoạt động nửa chừng, cấy men Saccharomyces chưa đủ, lượng nhiệt cao, thiếu oxi Bệnh chua tatric (tourne) Xảy khuẩn lactic phá hủy axit tatric làm cho rượu đục, tiết nhiều CO2, rượu chuyển màu nâu, có vị nhạt Chỉ pH cao 3,5 -3,6 có bệnh rượu cũ, rượu ngon hay bị bệnh Bệnh đắng Xảy men lactic phá hủy glixerin Rượu trở thành chua, có vị đắng chất acrolêin hình thành Chun ngành cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 19 ... dịch lên men điều ảnh hưởng đến khí CO2 nên ảnh hưởng đến trình lên men “Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002” 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men Có năm yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men rượu sau:... lực lên men - Ảnh hưởng nhiệt độ Để thấy rõ ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động sống nấm men cụ thể nấm men Saccharomyces Cerevisiae Rasse XII trình lên men rượu Nấm men chủng XII phát triển tốt nhiệt... sung vào môi trường loại acid nào, miễn anion acid không gây ảnh hưởng mạnh đến trung tâm hoạt động nấm men - Ảnh hưởng nồng độ rượu Nồng độ rượu sinh có ảnh hưởng đến tốc độ khả phát triển nấm men