NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KHÁNG THỂ QUA LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ ĐỂ PHÒNG CHỐNG TIÊU CHẢY VÀ SƯNG PHÙ ĐẦU DO E. coli Ở LỢN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KHÁNG THỂ QUA LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ ĐỂ PHÒNG CHỐNG TIÊU CHẢY VÀ SƯNG PHÙ ĐẦU DO E. coli Ở LỢN

Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh Mở đầu Theo số liệu từ Tổng cục Thống kê năm 2008, nớc có 26,7 triệu lợn, sản lợng thịt lợn đạt 2.771.000 tấn, chiếm tỷ lệ 73,9% tổng sản lợng thịt gia súc, gia cầm [20] Ngành chăn nuôi lợn nớc ta đà khẳng định đợc tầm quan trọng đòi hỏi phát triển mạnh mẽ tơng lai Xuất phát từ nhu cầu ấy, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn đà đề kế hoạch đến năm 2010 phải đạt bình quân đầu ngời 35 kg thịt lợn Cả nớc có 30 triệu lợn với chất lợng đàn lợn thịt có tỷ lệ nạc cao đáp ứng nhu cầu tiêu dùng nớc xuất [20] Tuy nhiên, việc phát triển đàn lợn làm xuất loại bệnh, ảnh hởng không nhỏ tới suất hiệu chăn nuôi Trở ngại lớn nay, đặc biệt sở chăn nuôi lợn sinh sản bệnh tiêu chảy lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi phù đầu lợn từ 22 đến 60 ngày tuổi Bệnh không phổ biến nớc ta mà xuất khắp giới, gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi lợn sinh sản Bệnh xuất lúc ạt, lúc lẻ tẻ tùy thuộc vào thời tiết, khí hậu, điều kiện chăm sóc, quản lý Tỷ lệ lợn mắc bệnh cao, từ 70 - 85%, có nơi 100%, tỷ lệ chết tới 18 20% [3] Đặc biệt, trại chăn nuôi lợn tập trung, bệnh gây thiệt hại đáng kể [21] Để chống lại bệnh E coli, nhà chăn nuôi đà sử dụng nhiều phơng thuốc, từ cổ truyền đông y đến liệu pháp kháng sinh đại, kể phơng pháp hoá sinh hay dinh dìng kü tht cao, nhng cịng chØ khèng chế đợc phần Việt Nam nhiều biện pháp áp dụng đà mang lại kết quả, tác dụng cao dùng thuốc kháng sinh Mấy thập kỷ qua, thuốc kháng sinh đà giảm bớt đáng kể tổn thất dịch bệnh Tuy nhiên, nhà khoa học nớc khẳng định E coli đà kháng thuốc với tỷ lệ cao kháng nhiều loại thuốc kháng sinh khác [8], [19] Bên cạnh mặt trái thuốc kháng sinh ngày lộ rõ, việc dùng thuốc kháng sinh kéo dài đà tiêu diệt vi khuẩn có lợi đờng ruột Hậu lợn còi cọc, chậm lớn, lông xù, thịt lợn bị tồn d kháng sinh, ảnh hởng xấu đến sức khoẻ cộng đồng giảm giá trị thịt lợn xuất Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh Xu hớng dùng chế phẩm sinh học chăn nuôi liệu pháp đắn mà giới yêu cầu phát triển Không giới hạn mục đích phòng trị bệnh, nâng cao suất chăn nuôi, viƯc sư dơng chÕ phÈm sinh häc cßn cã ý nghĩa quan trọng môi trờng sức khoẻ cộng đồng tạo sản xuất thực phẩm an toàn, đảm bảo ổn định trạng thái cân môi trờng sinh thái Muốn đạt đợc yêu cầu đó, việc nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học an toàn để phòng chữa bệnh cho vật nuôi đòi hỏi cấp bách Dựa sở miễn dịch học phản ứng kháng nguyên - kháng thể ngời ta đà sản xuất đợc nhiều loại kháng thể đặc hiệu từ huyết động vật để chữa bệnh, nhng giá thành cao, dùng dễ gây phản ứng huyết nên đợc sử dụng rộng rÃi Gần ngời ta phát rằng, gà đợc tiêm kháng nguyên, kháng thể máu đợc truyền sang lòng đỏ trứng tới 80%, đặc biệt thành phần IgG Kháng thể đặc hiệu chế từ lòng đỏ trứng gà đợc miễn dịch có nhiều u hẳn so với kháng thể đặc hiệu chế từ huyết động vật, ứng dụng vào sản xuất sản xuất với số lợng lớn, giá thành sản xuất thấp, giết động vật dùng không xảy phản ứng phụ Cho đến đà có nhiều công trình nớc nh: Đức, Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc công bố việc chế tạo sử dụng kháng thể lòng đỏ để điều trị phòng nhiều bệnh vật nuôi có hiệu cao Qua gà, ngời ta đà thu đợc nhiều loại kháng thể chống lại vi rút, vi khuẩn, độc tố, nọc rắn, hoá chất để dùng cho xét nghiệm chẩn đoán y học [36] Để sớm tạo loại thuốc phòng chữa trị hiệu quả, an toàn bệnh tiêu chảy sng phù đầu E coli gây lợn, tiến hành đề tài: "Nghiên cứu chế tạo kháng thể qua lòng đỏ trứng gà để phòng chống tiêu chảy sng phù đầu E coli lợn", với hai mục tiêu sau: Phân lập, tuyển chọn xác định chủng E coli gây bệnh điển hình có độc lực, có tính kháng nguyên mạnh để làm giống Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học đặc hiệu kháng thể phòng chữa bệnh tiêu chảy sng phù đầu lợn E coli Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh Chơng 1: Tổng Quan 1.1 Tình hình nghiên cứu E coli gây bệnh tiêu chảy phù đầu lợn 1.1.1 Tình hình nghiên cứu nớc Hiện tợng vi khuẩn Escherichia coli (E coli) gây bệnh tiêu chảy phù đầu lợn đà có từ lâu ngày phổ biến trại chăn nuôi tập trung nông hộ Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật, bệnh tiêu chảy phù đầu lợn đà đợc khống chế phần nào, nhng việc loại trừ chăn nuôi hầu hết nhà nghiên cứu cho nhiều khó khăn nớc ta mà nớc có trình độ khoa học tiên tiến giới [2], [5], [9] Chính mà nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Cù Hữu Phú cs [13] đà phân lập đợc 60 chủng vi khuẩn E coli lợn mắc bệnh tiêu chảy từ 35 ngày đến tháng tuổi, có 42 chủng gây dung huyết Lý Liên Khai [9] phân lập E coli từ phân lợn bị tiêu chảy phân lợn khỏe mạnh đà cho biết: Các chủng E coli mang K88, K99 987P nguyên nhân gây tiêu chảy cho lợn từ đến tuần tuổi Vi khuẩn E coli thờng xuyên c trú ruột lợn chúng gây bệnh gặp điều kiện thuận lợi nh: tác động stress làm giảm sức đề kháng lợn, làm tăng số lợng vi khuẩn sinh độc tố Nguyễn Khả Ngự cs [12] xác định khả dung huyết kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn E coli phân lập từ lợn trớc sau cai sữa bị phù đầu đồng sông Cửu Long Víi 21 chđng vi khn E coli ph©n lËp tõ lợn chết, tác giả cho biết 100% số chủng ngng kết với kháng huyết K88, 40% gây dung huyết mạnh, chủng có khả kháng nhiều loại thuốc kháng sinh thông thờng Cũng nghiên cứu khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn E coli gây tiêu chảy lợn, Bùi Thị Tho cs [8] sau kiểm tra khả kháng thuốc kháng sinh 183 chủng E coli phân lập từ phân lợn bị phân trắng, đà nhận định: tính kháng thuốc E coli sở có khác biệt rõ rệt tùy theo trình sử dụng có khác biệt chủng E coli gây bệnh lứa tuổi lợn khác Các chủng E Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh coli tạo khuẩn lạc dạng nhám có tính kháng thuốc cao chủng tạo khuẩn lạc trơn Qua 20 năm kiểm tra tính kháng thuốc kháng sinh E coli phân lập từ lợn bị bệnh phân trắng, tác giả nhận thấy tính kháng thuốc chúng số thuốc kháng sinh thờng dùng tăng lên nhanh Tỷ lệ chủng kháng nhiều loại thuốc kháng sinh phát triển nhanh, số chủng đà kháng với hầu hết loại thuốc thờng dùng [8] Đỗ Ngọc Thúy cs [19] cho biÕt tû lƯ kh¸ng kh¸ng sinh cđa 106 chđng E coli đợc phân lập từ lợn theo mẹ bị tiêu chảy có xu hớng kháng mạnh với loại thuốc kháng sinh thờng dùng để điều trị bệnh nh amoxicillin, cloramphenicol, streptomycin Đỗ Trung Cứ cs [4] sử dụng chế phẩm Biosubtyl để phòng bệnh tiêu chảy cho lợn đà làm giảm đợc 42% số lợn tiêu chảy lợn giai đoạn từ đến 60 ngày tuổi 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nớc ngoµi Cox vµ cs [34] cho r»ng, E coli céng sinh có mặt thờng trực đờng ruột ngời động vật, trình sống vi khuẩn có khả tiếp nhận yếu tố gây bệnh nh yÕu tè b¸m dÝnh (K88, K99), yÕu tè dung huyÕt (Hly), yếu tố cạnh tranh (Colv), yếu tố kháng thuốc kháng sinh độc tố đờng ruột Các yếu tố gây bệnh không đợc di truyền qua ADN nhiễm sắc thể mà đợc di truyền qua ADN nằm plasmid Những yếu tố gây bệnh giúp cho E coli bám dính vào tế bào nhung mao ruột non, xâm nhập vào thành ruột, phát triển với số lợng lớn Sau vi khuẩn thực trình gây bệnh cách sản sinh độc tố, gây triệu chứng tiêu chảy, phá hủy tế bào niêm mạc ruột vµ tÕ bµo nhung mao ruét non Fairbrother vµ cs [37] nghiên cứu yếu tố gây bệnh chủng E coli phân lập đợc từ thể bệnh khác nhau, đà đặt tên vi khuẩn theo yếu tố gây bệnh mà chúng có khả sinh nh: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) vµ Adherencia Enteropathogenic Escherichia coli (AEEC) E coli gây bệnh tiêu chảy phù đầu lợn có mặt hầu hết nớc giới nên đà có nhiều tác giả nghiên cứu chúng Simon cs [62] đà làm rõ vai Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh trò ba loại kháng nguyên bám dính K88 E coli K88ab, K88ac K88ad cho biết: chủng E coli sản sinh độc tố đờng ruột (ETEC) mang kháng nguyên bám dính gây tiêu chảy nặng dẫn đến tử vong số lợn Sự cảm nhiễm bệnh tiêu chảy phù đầu lợn có liên quan mật thiết đến khả bám dính E coli Smith thông báo có hai loại độc tố thành phần Enterotoxin đợc tìm thấy chủng E coli gây bệnh tiêu chảy Sự khác biệt hai loại độc tố nằm khả chịu nhiệt Độc tố chịu nhiệt (Heat stable toxin -ST) chịu đợc nhiệt độ 1000C 15 phút, độc tố không chịu nhiệt (Heat labile toxin -LT) bị bất hoạt 600C vòng 15 phút [63] Cùng với việc phân lập nghiên cứu yếu tố gây bệnh E coli, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm phòng bệnh tiêu chảy lợn đà đợc nhà khoa học giới đặc biệt quan tâm 1.2 Vi khuẩn Escherichia coli Trùc khuÈn ruét giµ Escherichia coli thuéc hä Enterobacteriaceae Trong vi khuẩn đờng ruột, E coli loài phổ biến E coli có tên Bacterium coli commune, Bacillus coli communis Escherich ph©n lËp năm 1885 từ phân trẻ em E coli thờng xuất sớm đờng ruột ngời động vật, sau đẻ hai tồn cho ®Õn vËt chđ chÕt Chóng thêng ®Þnh c ë phần sau ruột, gặp dày hay ruột non Trong nhiều trờng hợp tìm thấy chúng niêm mạc nhiều phận khác thể Từ đờng tiêu hóa, E coli đợc thải theo phân môi trờng Việc tìm số E coli môi trờng giúp đánh giá môi trờng ®ã tèt hay xÊu vỊ mỈt vƯ sinh [6], [18] điều kiện bình thờng, chủng E coli không gây bệnh, điều kiện chăm sóc, nuôi dỡng, vệ sinh thú y kém, điều kiện ngoại cảnh bất lợi dẫn đến sức chống đỡ vật suy giảm E coli trở nên độc có khả gây bệnh [18] 1.2.1 Đặc tính sinh vật hóa học E coli 1.2.1.1 Đặc tính hình thái Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh E coli trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, kích thớc 2-3 x 0,6 àm Trên tiêu nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram âm, bắt màu sẫm hai đầu, đứng tụ lại thành đám, xếp - vi khuẩn thành chuỗi dài Trong môi trờng nuôi cấy lâu ngày có thấy trực khuẩn dài - àm E coli di động nhờ có lông xung quanh thân, nhng nuôi cấy điều kiện bất lợi lông, không di động Vi khuẩn không sinh bào tử, lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày để nhuộm thấy màng giáp, soi tơi không thấy đợc [39] Dới kính hiển vi điện tử, phát đợc pili, yếu tố bám dính E coli [18] 1.2.1.2 Đặc tính nuôi cÊy E coli lµ trùc khuÈn hiÕu khÝ vµ yÕm khÝ tïy tiƯn, cã thĨ sinh trëng ë nhiƯt ®é từ - 400C, nhiệt độ thích hợp 370C, pH thích hợp 7,2 - 7,4, nhng phát triển đợc pH từ 5,5 8,0 [18] E coli phát triển dễ dàng môi trờng nuôi cấy thông thờng, số chủng phát triển đợc môi trờng tổng hợp đơn giản [13] - Trên môi trờng thạch thờng: Sau nuôi cấy 370C/24 giờ, E coli hình thành khuẩn lạc tròn ớt, bóng láng, màu tro nhạt, lồi, đờng kính 2-3 mm Có thể quan sát thấy khuẩn lạc dạng nhày (mucous) dạng nhám (rough) - Trong môi trờng nớc thịt: Sau nuôi cấy 370C/24 giờ, E coli phát triển nhanh, môi trờng đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, hình thành màng mỏng xám nhạt bề mặt môi trờng, môi trờng có mùi phân thối - Trên môi trờng thạch máu: Sau 24 nuôi cấy 370C hình thành khuẩn lạc to, ớt, lồi, viền không gọn, màu sáng, kích thớc từ -2 mm Có gây dung huyết - Trên môi trờng thạch Mac Conkey: Sau nuôi cấy 24 370C hình thành khuẩn lạc màu đỏ cánh sen, tròn nhỏ, lồi, không nhày, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trờng - Trên môi trờng Endo: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chín, có ánh kim ánh kim - Trên môi trờng EMB (Eosin Methyl Blue): Hình thành khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh Không mọc môi trờng lục Malachite Miiller Kauffmann Bị ức chế nuôi môi trờng Wilson Blair 1.2.1.3 Đặc tính hóa sinh - Lên men sinh loại đờng: E coli có khả lên men sinh loại đờng glucose, fructose, galactose, lactose, maniton, mannit, levulose, xylose, không lên men andonit innozit, lên men không ổn định loại đờng dulciton, saccarose, salixin [18] E coli lên men sinh nhanh đờng lactose, Salmonella spp đặc tính này, đặc điểm quan trọng để phân biệt E coli với Salmonella spp - Các phản ứng khác: Sữa Đông sau 24 đến 72 370C Genlatin Không tan chảy Indol + Catalase + Oxidase - Urease - Di ®éng + MR + VP - H2S - 1.2.1.4 Sức đề kháng E coli có sức đề kháng yếu, bị diệt nhiệt độ 550C 600C 30 phút, đun sôi 1000C chết Những chủng E coli phân có xu hớng đề kháng với nhiệt cao chủng phân lập môi trờng bên môi trờng bên chủng E coli gây bệnh tồn đến tháng Các chất sát trùng nh axit phenic 3%, clorua thđy ng©n (HgCl2) 0,1%, formol 0,2% cã thĨ diƯt E coli sau E coli ®Ị kháng với điều kiện khô hun khói [18] 1.2.2 Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn E coli Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh E coli đợc chia thành nhóm huyết (serogroup) kiĨu hut (serotype) kh¸c dùa theo cÊu tróc kháng nguyên O, K, H F Theo phản ứng ngng kết có 250 kiểu kháng nguyên O, 89 kháng nguyên K, 56 kháng nguyên H số kháng nguyên F [17], [25] 1.2.2.1 Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân - Ohne Hauch) Kháng nguyên O E coli có chất lipopolysaccharide, độc Chỉ cần 1/20 mg kháng nguyên O đủ giết chết chuột bạch sau 24 Kháng nguyên O đợc coi nh yếu tố độc lực tìm thấy thành tế bào vi khuẩn Cấu trúc phân tử polysaccharide kháng nguyên O gồm hai phần: phần polysaccharide nằm chứa nhóm hydro có chức tạo tính đặc trng serogroup Phần polysaccharide bên không chứa nhóm hydro có chức phân biệt dạng khuẩn lạc: d¹ng S (Smooth), d¹ng R (Rough), d¹ng M (Mucous) Khi làm dần đơn vị đờng chuỗi polisaccharide làm thay đổi vị trí đơn vị dẫn đến thay đổi độc lực vi khuẩn Kháng nguyên O chịu đợc nhiệt, không bị phá hủy đun nóng 1000C Dới tác động cồn, axít HCl nồng độ 1N vi khuẩn chịu đợc 20 giờ, nhng lại bị phá hủy formol 0,5% Kháng nguyên O đợc cấu trúc phân tử lớn, thành phần phân tử gồm có: + Polyosit: tạo tính đặc hiệu kháng nguyên + Protein: làm cho phức hợp có tính kháng nguyên + Lipit: kết hợp với polyosit sở độc tính Tất kháng nguyên O c trú bề mặt, liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết tơng ứng sÏ x¶y ph¶n øng ngng kÕt Ph¶n øng ngng kết kháng nguyên O tạo thành hạt nhỏ, lắc khó tan 1.2.2.2 Kháng nguyên H (kháng nguyên lông - Hauch) Kháng nguyên H thành phần lông cđa vi khn, cã b¶n chÊt protein, rÊt kÐm bỊn vững so với kháng nguyên O Kháng nguyên H không chịu nhiệt, bị phá Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh hủy 600C Bị cồn 50% enzym phân giải protein phá hủy Kháng nguyên H tồn đợc xử lý formol 0,5% Kháng nguyên H gặp kháng thể H tơng ứng tạo tợng ngng kết H, vi khuẩn đợc ngng kết lại với nhờ lông kháng thể H cố định lông cầu nối với lông bên cạnh Phản ứng xảy nhanh so với kháng nguyên O hạt ngng kết lớn hơn, giống nh cụm dễ tan lắc lông vi khuẩn nhỏ dƠ ®øt Vi khn di ®éng tiÕp xóc víi kháng thể H tơng ứng trở thành không di động Kháng nguyên H E coli tính độc ý nghĩa đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên đợc quan tâm nghiên cøu, nhng nã cã ý nghÜa rÊt lín viƯc xác định tên vi khuẩn [51] Các nhà khoa học đà dùng chủng E coli có lông lông serogroup O để gây cảm nhiễm cho chuột đờng miệng với lợng vi khuẩn Kết cho thấy khả gây bệnh cho chuột thí nghiệm hoàn toàn giống Kháng nguyên H bảo vệ cho vi khuẩn khỏi bị tiêu diệt tế bào đại thực bào, từ giúp vi khuẩn sống lâu tồn lâu đại thực bào 1.2.2.3 Kháng nguyên K (Kháng nguyên vỏ - Capsular) Kháng nguyên K đợc gọi kháng nguyên vá (Capsular), chóng bao quanh tÕ bµo vi khn vµ có chất hóa học polysaccharide Kháng nguyên ngăn cản ngng kết vi khuẩn huyết "O" tơng ứng Khi đun nóng 100 - 1210C kháng nguyên tác dụng ngăn cản Vai trò kháng nguyên K cha đợc thống Có nhiỊu ý kiÕn cho r»ng, nã kh«ng cã ý nghÜa độc lực vi khuẩn, thấy độc lực chủng E coli có kháng nguyên K giống độc lực chủng kháng nguyên K [33] Cã ý kiÕn kh¸c cho r»ng, nã cã ý nghÜa độc lực tham gia bảo vệ vi khuẩn trớc yếu tố phòng vệ vật chủ [47] Tuy vậy, phần lớn ý kiến thống kháng nguyên K có hai nhiệm vụ sau: - Hỗ trợ phản ứng ngng kết kháng nguyên O nên thờng ghi liền công thức serotype vi khuÈn lµ Ox: Ky nh E coli O139: K88, O149: K88 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh - Tạo hàng rào bảo vệ cho cho vi khuẩn chống lại tác động ngoại cảnh tợng thực bào, yếu tố phòng vệ vật chủ 1.2.2.4 Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae- Kháng nguyên bám dính) Hầu hết chủng E coli gây bệnh sản sinh nhiều kháng nguyên bám dính Các chủng không gây bệnh kháng nguyên bám dính Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào thụ thể đặc hiệu bề mặt tế bào biểu mô ruột lớp màng nhày, giúp vi khuẩn chống lại khả đào thải nhu động ruột Kháng nguyên bám dính E coli nằm cấu trúc pili (fimbriae), cấu trúc ngắn thẳng, xuất phát từ đĩa gốc màng nguyên sinh chất tế bào vi khuẩn Fimbriae có chất protein mọc bề mặt tế bào vi khuẩn với số lợng từ 10 - 40 fimbriae tế bào vi khuẩn Quan sát dới kính hiển vi điện tử, chúng giống nh áo lông bao bäc xung quanh vi khuÈn Fimbriae cña vi E coli khác lông chỗ cứng hơn, không lợn sóng không liên quan đến chuyển động Kháng nguyên bám dính đợc phân loại phản ứng huyết thanh, thụ thể đặc hiệu khả ngng kết với hồng cầu loài động vật khác phản ứng PCR [17], [51] Kháng nguyên có chức bám dính đặc trng ETEC (Enterotoxigenic E coli) gây bệnh cho lợn chủ yếu F4 (K88); F6 (987P); F107 có F5 (K99) Kháng nguyên có chức bám dính ETEC gây tiêu chảy nguyên phát trâu bò F5 (K99) thấy F4 (K88) với tỷ lệ E coli gây bệnh cho trẻ em thờng có kháng nguyên bám dính F41 [51], [67] 1.3 Các yếu tố gây bƯnh cđa E coli 1.3.1 Ỹu tè b¸m dÝnh cđa E coli Để gây bệnh, chủng ETEC phải bám dính đợc lên tế bào biểu mô ruột non Quá trình bám dính đợc thực qua ba giai đoạn: hấp thụ, gắn kết bám dính Hai trình trớc đợc thực nhờ tác động vật lý, hóa học, bớc bám dính đợc thực sợi bám dính chuyên biệt (pili) bề mặt vi khuẩn đảm nhiệm, trình liên kết kháng nguyên yếu tố bám dính với receptor tơng ứng bề mặt tế bào biểu mô Hầu hết chủng ETEC có yÕu tè b¸m dÝnh bao gåm: K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), F17, F18, F41, F42 vµ F165 Fimbriae lµ tập hợp đơn vị protein nhỏ, đợc xếp thành sợi dây nhỏ gắn vào tế bào 10 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh 3.3.1 Nghiên cứu phơng pháp làm bất hoạt giải độc Kế thừa nghiên cứu trớc E coli độc tố E coli, tiến hành thử nghiệm bất hoạt giải độc kháng nguyên phơng pháp sau: + Bất hoạt giải độc nhiệt độ 700C 30 phút + Bất hoạt giải độc formol 0/00 + Bất hoạt giải độc phenol 0/00 + Bất hoạt giải độc thiomersal 0,40/00 Môi trờng sau nuôi cấy đạt tiêu chuẩn đợc gọi dịch nuôi chứa độc tố, đợc bất hoạt giải độc phơng pháp Dịch nuôi sau xử lý, đợc đặt tủ ấm 370C 24h Sau tiến hành kiểm tra vô trùng theo thờng quy môi trờng khác để xem điều kiện có bất hoạt đợc vi khuẩn hay không Kết đợc trình bày bảng 16 Bảng 16: Kết kiểm tra vô trùng dịch nuôi chứa ®éc tè sau bÊt ho¹t Canh trïng xư lý 700C/30 Formol 0/00 Phenol 0/00 Thiomersal 0.4 0/00 Kết kiểm tra môi trờng NA NB BA SA Thio - (-): kh«ng cã vi khuÈn mäc Kết Đạt Đạt Đạt Đạt (+): có vi khuẩn mọc Bằng kết kiểm tra vô trùng nhận thấy phơng pháp vô hoạt giải độc có khả bất hoạt E coli Tiếp theo kiểm tra hiệu giải độc phơng pháp cách ly tâm dịch nuôi cấy sau bất hoạt, lấy nớc lọc qua màng 0,2 àm thu đợc dịch lọc gọi giải độc tố, sau tiêm giải độc tố cho chuột bạch 18 - 20 gam với liều tiêm 0,4 ml vào tĩnh mạch so sánh với tiêu chuẩn độc tố (tiêu chuẩn để đánh giá ®éc tè E coli ®ã lµ cø 0,4ml ®éc tè tiêm tĩnh mạch cho chuột 18 20g, phải gây chết 40% tổng số chuột đợc tiêm) Nếu giải độc tố gây 55 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh chết tới 40% số chuột thí nghiệm độc tố cha đợc giải độc, tức phơng pháp giải độc không đạt ngợc lại Kết đợc trình bày bảng 17 Bảng 17: Tính an toàn dịch nuôi chứa độc tố sau bất hoạt giải độc Phơng pháp bất Liều tiêm Đờng hoạt (ml) tiêm 700C/30 phút 0,4 TM Formol 0/00 0,4 Phenol 0/00 Thiomersal 0,40/00 Tỷ lệ chuột % chuột Hiệu chết giải độc 2/10 20% Đạt TM 1/10 10% Đạt 0,4 TM 6/10 60% Không đạt 0,4 TM 10/10 100% Không đạt chết/chuột tiêm Kết cho thấy: + Phơng pháp giải độc phenol thiomersal không mang lại hiệu giải độc mà làm tăng tính độc độc tố, dùng hai hóa chất để giải độc đợc + Phơng pháp giải độc formol 30/00 700C/30 phút có hiệu giải độc tơng đối tốt 3.3.2 Kiểm tra tính kháng nguyên dịch nuôi cấy sau bất hoạt Tiếp theo kiểm tra tính kháng nguyên dịch nuôi chứa độc tố sau bất hoạt giải độc formol 30/00 700C/30 phút Chúng dùng dịch nuôi chứa độc tố đà đựơc bất hoạt giải độc để tiêm miễn dịch cho chuột bạch 18 - 20 gam liỊu 0,4 ml/con vµo díi da Sau tiêm 21 ngày lấy máu chuột, chắt huyết kiểm tra hiệu giá ngng kết Kết trình bày bảng 18 Bảng 18: Tính kháng nguyên dịch nuôi cha độc tố sau đà bất hoạt giải độc Liều Số l- tiêm ợng (ml) (con) DD 0.4 1/128 1/64 1/64 1/256 1/128 1/128 DD 0.4 1/128 1/32 1/64 1/64 1/64 Phơng pháp Đờng bất hoạt tiêm Formol 30/00 700C/30 phút HGKT Hiệu giá ngng kết trung bình * DD: dới da 56 1/32 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh Qua bảng 18 thấy chuột tiêm dịch nuôi chứa độc tố đà ®ỵc xư lý b»ng formol nång ®é 30/00 cho hiƯu giá kháng thể cao (trung bình 1/128) Nh phơng pháp bất hoạt giải độc formol 30/00 37oC 24h có hiệu tốt Dịch nuôi chứa độc tố sau bất hoạt giải độc, độc lực giảm nhng có tính kháng nguyên 3.3.3 Xác định tính kháng nguyên giải độc tố Độc tố E coli yếu tố quan trọng tham gia vào trình gây bệnh tiêu chảy sng phù đầu lợn Vì vậy, sau đà chế tạo đợc dịch nuôi chứa giải độc tố nh trên, cần xác định tính kháng nguyên giải độc tố dịch nuôi chứa độc tố đà giải độc 3.3.3.1 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch giải độc tố Chúng tiến hành nghiên cứu đáp ứng miễn dịch giải độc tố đối tợng chuột bạch với phơng pháp nh sau: Chế tạo giải độc tố E coli (Kháng nguyên độc tố T2): dịch nuôi cấy chứa độc tố (hỗn hợp 10 chủng E coli) đợc gọi dịch nuôi chứa độc tố E coli đa giá đợc giải độc focmol 30/00 37oC/24h, ly tâm với tốc độ 7000g/15phút, lấy nớc lọc qua màng lọc có kích thớc lỗ lọc 0,2 m, thu dịch lọc, dịch lọc gọi giải độc tố E coli đa giá (hỗn hợp giải độc tố 10 chủng E coli) Nếu chế tạo với chủng E coli gọi giải độc tố T2 chủng E coli Chế tạo kháng huyết thanh: Chuột bạch đợc tối miễn dịch giải độc tố đa giá theo quy trình sau: Lần tiêm Đờng tiêm DD DD FX DD FX DD LiỊu tiªm (ml) 0.5 0.8 0.4 1.0 0.8 1.2 Mỗi mũi đợc tiêm cách tuần 21 ngày sau tiêm mũi cuối tiến hành lấy máu, chắt huyết Kiểm tra đáp ứng miễn dịch phơng pháp kiểm tra kháng thể huyết chuột miễn dịch phản ứng huyết học sau: 57 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh 3.3.3.2 Phản ứng kết tủa ống nghiệm giải độc tố với huyết chuột miễn dịch giải độc tố Huyết đợc ly tâm (tối thiểu 4500g/phút) loại hết cặn (nếu có) Huyết đợc pha loÃng theo cấp số nh thờng quy, bổ sung kháng nguyên độc tố vào huyết ®· pha lo·ng theo tû lƯ thĨ tÝch 1:1 HiƯu giá đợc xác định độ pha loÃng huyết cao nhÊt mµ vÉn thÊy kÕt tđa KÕt tđa xt hiƯn râ sau 36 – 48 giê vµ kÕt ln ë 72 giê sau ph¶n øng KÕt qu¶ cđa ph¶n ứng đợc trình bày bảng 18 Hình 3: Phản ứng kết tủa ống nghiệm độc tố T với kháng huyết Bảng 18: Phản ứng kết tủa ống nghiệm kháng nguyên độc tố đơn giá đa giá E coli với huyết chuột tiêm giải độc tố E coli đa giá (hiệu giá huyết đa giá kháng độc tố E coli) Kháng nguyªn T2Hanco T2Hanco T2Hanco T2Hanco T2Hanco T2Hanco T2Hanco Định tính Định lợng Đối chøng §èi chøng + + + + + + + 1/16 1/8 1/4 1/4 1/8 1/2 1/4 - - 58 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh T2Hanco T2Hanco T2Hanco 10 T2 Poli + + + + 1/8 1/4 1/16 1/16 - - §èi chøng 1: Huyết kháng E coli + Môi trờng Đối chứng 2: Huyết âm tính + Độc tố Qua bảng 18 thấy, phản ứng kháng nguyên độc tố đơn giá đa giá E coli với huyết chuột cho kết dơng tính, xác định đợc hiệu giá kháng độc tố, tức đà có kết hợp độc tố kháng thể đặc hiệu tơng ứng Điều chứng tỏ kháng nguyên độc tố E coli đà gây đáp ứng miễn dịch chuột bạch 3.3.3.3 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép thạch (ADP) kháng nguyên độc tố với huyết chuột đợc miễn dịch giải độc tố Để phân tích thêm độc tố E coli hỗn hợp độc tố, tiến hành phản ứng ADP theo kỹ thuật Owchterlony Thành phần tham gia phản ứng gồm có, kháng nguyên độc tố đợc bố trí giếng trung tâm, giếng xung quanh huyết chuột miễn dịch đợc pha loÃng theo cấp số Kết đợc trình bày bảng 19 Bảng 19: Phản ứng ADP kháng nguyên độc tố E coli đơn giá đa giá với huyết chuột miễn dịch giải độc tố E coli (hiệu giá huyết đa giá kháng độc tố E coli) Kháng nguyên T2Hanco Định tính Hiệu giá §èi chøng §èi chøng - - + kÕt tña 1/4 T2Hanco + 1/8 - - T2Hanco + 1/4 - - T2Hanco + 1/8 - - T2Hanco + 1/4 - - T2Hanco + 1/8 - - T2Hanco + 1/4 - - T2Hanco + 1/8 - - 59 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh T2Hanco + 1/4 - - T2Hanco 10 + 1/8 - - T2 Poli + 1/16 - - * Đối chứng 1: Huyết kháng E coli + Môi trờng Đối chứng 2: Huyết âm tính + Độc tố Hình Phản ứng ADP độc tố T với kháng huyết Phản ứng ADP dơng tính lần khẳng định chắn tính kháng nguyên độc tố, ta xác định đợc hiệu giá kết tủa, nghĩa kháng nguyên độc tố gây miễn dịch mạnh Kết phản ứng huyết cho thấy: + Giải độc tố E coli có tính kháng nguyên tốt, đà kích thích đáp ứng miễn dịch chuột bạch + Kháng độc tố huyết chuột đợc miễn dịch giải độc tố đợc phát qua phản ứng kết tủa với kháng nguyên độc tố E coli ống nghiệm, qua phản ứng ADP gel thạch Qua hai phản ứng xác định đợc hiệu giá kháng độc tố + Mỗi chủng E coli có khả sản sinh độc tố với hàm lợng khác Độc tố đa giá mạnh gây miễn dịch tốt độc tố đơn giá 3.4 Nghiên cứu chất bổ trợ làm tăng miễn dịch 60 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh Chúng sử dụng chất bổ trợ: ISA IMS hÃng Septic, Al(OH)3 alum SPI Pharma Mỗi chất bổ trợ đợc bổ sung vào dịch nuôi chứa độc tố đà đợc bất hoạt giải độc (gọi tắt kháng nguyên) với tỷ lệ thích hợp Trớc tiên tiến hành thử an toàn động vật thí nghiệm chuột bạch 18 20 gam Kết thu đợc trình bày bảng 20 Bảng 20: Tính an toàn kháng nguyên có chứa chất bổ trợ khác Kháng nguyên có Tỷ lệ chuột chết/tiêm theo đờng tiêm Kết luận chất bổ trỵ Díi da (1 ml) Phóc xoang (0,5) Nhị hãa ISA 6/10 7/10 Không đạt Nhũ hóa IMS 4/10 4/10 Không đạt AL(OH)3 0/10 0/10 Đạt Alum 0/10 0/10 Đạt Từ kết thử an toàn, nhận thấy sản phẩm có bổ trợ Al(OH)3 alum bổ sung vào kháng nguyên E coli an toàn so với sản phẩm có bổ trợ dầu khoáng ISA, IMS Từ sử dụng sản phẩm để tiếp tục nghiên cứu hiệu lực động vật thí nghiệm chuột bạch Chúng tiếp tục nghiên cứu hiệu lực hai sản phẩm cách miễn dịch liều 0,4ml/con theo đờng tiêm dới da chuột bạch so sánh với đối chứng (đối chứng chuột miễn dịch kháng nguyên chất bổ trợ) Sau tiêm 21 ngày, tiến hành lấy máu chuột, chắt huyết thanh, kiểm tra hiệu giá kháng thể phản ứng ngng kết nhanh phiến kính KÕt qu¶ thĨ nh sau: B¶ng 21: KiĨm tra tính miễn dịch kháng nguyên có bổ sung chất bổ trợ Chất bổ trợ Nồng độ Hiệu giá Hiệu giá trung bình 10/00 Al(OH)3 1/128 1/64 1/128 1/128 1/115,2 20/00 1/256 1/128 1/256 1/256 1/128 1/204,8 30/00 1/128 1/256 1/128 1/256 1/128 1/179,2 40/00 1/128 1/256 1/128 1/256 1/64 1/166,4 1/128 61 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh 0.50/00 1/128 1/128 1/64 1/102,4 10/00 1/256 1/128 1/128 1/256 1/128 1/179,2 20/00 1/128 1/512 1/128 1/256 1/128 1/230,4 30/00 Alum 1/128 1/256 1/128 1/256 1/64 1/166,4 1/128 1/64 1/128 1/102,4 Đối chứng (không có chất bổ trợ) 1/128 1/64 1/64 1/128 Nhìn chung chuột đợc miễn dịch kháng nguyên có chất bổ trợ có hiệu giá kháng thể cao so chuột đối chứng, cụ thể: Đối với chất bổ trợ Al(OH)3 nồng độ khác gây đáp ứng miễn dịch khác động vật thí nghiệm Trong ®ã nång ®é 0/00 cho kÕt qu¶ tèt nhÊt thĨ hiƯn qua hiƯu gi¸ kh¸ng thĨ cđa hut chuột cao (hiệu giá trung bình đạt 1/204,8) Nồng độ tối u chất bổ trợ alum 20/00 (hiệu giá trung bình đạt 1/230,4) Từ kết trên, định chọn alum bổ sung với nồng độ 0/00 làm chất bổ trợ cho kháng nguyên sử dụng cho nghiên cứu 3.5 Nghiên cứu tính an toàn kháng nguyên Sau đà chọn đợc chất bổ trợ thích hợp alum 20/00 sản xuất lô liên tục để khảo sát tính an toàn kháng nguyên nhiều loại động vật khác nhau: chuột lang 250 - 300 gam , thá 1800 - 2000 gam động vật gà hậu bị Mỗi loài động vật có liều lợng kháng nguyên khác nhau, đờng đa thuốc vào tiêm dới da, riêng gà đờng đa thuốc vào tiêm bắp Sau tiêm, tiến hành theo dõi phản ứng động vật thí nghiệm số lợng động vật bị chết tổng số động vật đợc tiêm Kết thí nghiệm đợc thống kê bảng 22 Qua bảng kết quả, thấy với công thức chế tạo kháng nguyên + alum 0/00, tiến hành thử an toàn với ba lô sản xuất khác nhau, cho kết an toàn động vật thí nghiệm Cụ thể trờng hợp động vật thí nghiệm bị chết hoặc phản ứng với chế phẩm Bảng 22: Kết thử tính an toàn lô kháng nguyên động vật 62 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh Số chuột lang phản ứng /số Lô thí nghiệm Số thỏ phản ứng/ tiêm Liều dd (ml) 1,0 Liều dd (ml) Liều tiêm bắp (ml) 2,0 3,0 2,0 3,0 4,0 2,0 3,0 4,0 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/7 0/8 0/8 0/8 0/8 0/7 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/4 0/4 0/4 0/4 0/5 0/4 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/6 0/6 0/7 0/7 0/7 0/7 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/3 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/9 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 Tæng TN 0/30 0/30 0/30 0/30 0/30 0/30 0/21 0/22 Tỉng §C 0/15 0/15 0/15 0/15 0/15 0/15 0/11 0/12 0/12 0/12 0/13 0/12 ĐC lô Lô ĐC lô Lô ĐC lô 0/5 0/5 0/5 3,0 LiỊu dd (ml) 1,0 L« 2,0 Số gà phản ứng/số tiêm số tiêm 0/23 0/23 0/23 0/23 Ghi chú: Động vật phản ứng đợc tiêm chế phẩm Đối chứng:Môi trờng + formol 30/00 + alum 20/00 3.6 Nghiªn cøu tÝnh miƠn dịch kháng nguyên nghiên cứu thời gian sản sinh miễn dịch sau tiêm Để nghiên cứu tính miễn dịch thời gian tạo miễn dịch, tiến hành thí nghiệm chuột bạch 18-20 gam, với số lợng 40 cho lần thí nghiệm Cứ tuần sau miễn dịch, tiến hành lấy máu 10 để kiểm tra hiệu giá kháng thể máu chuột thí nghiệm Thí nghiệm đợc lặp lại lần Kết thí nghiệm cụ thể nh sau: Bảng 23: Tính miễn dịch thời gian tạo miễn dịch HGKT trung bình huyết Tiêm dới da 0,4ml/con chuột sau tiêm tuần tuần 1/32 1/218 HGKT thÝ nghiƯm lÇn 1 tn - HGKT thÝ nghiƯm lÇn - 1/34 1/230 1/230 HGKT thÝ nghiƯm lÇn - 1/28 1/205 1/218 63 tuần 1/230 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh HGKT chuột đối chứng (chuột tiêm - kháng nguyên chất bổ trợ) 1/28 1/128 1/115 Hiệu giá kháng thĨ 256 192 128 ThÝ nghiƯm 64 ThÝ nghiƯm Thí nghiệm Đối chứng 0 tuân tuần tuần tuần Thời gian Hình Sự biến đổi hàm lượng kháng thể theo thời gian Bảng 23 hình cho thấy sau miễn dịch tuần chuột thí nghiệm cha có đáp ứng miễn dịch, sang tuần thứ hai huyết chuột đà bắt đầu có kháng thể kháng lại kháng nguyên E coli nhng hiệu giá thấp (khoảng 1/32) tuần thứ ba thứ t hiệu giá kháng thể cao (khoảng 1/128 1/256) Kết cho thấy, kháng huyết động vật thí nghiệm đợc miễn dịch kháng nguyên có thêm chất bổ trợ alum 0/00 có hiệu giá cao so với huyết đối chứng (đợc miễn dịch kháng nguyên chất bổ trợ) Điều chứng tỏ kháng nguyên có bổ sung thêm chất bổ trợ alum 0/00 có khả kích thích đáp ứng miễn dịch tốt 3.7 chế tạo kháng nguyên thích hợp gây miễn dịch cho gà Với giống chuẩn đà đợc chọn lọc ổn định, tiến hành chế tạo kháng nguyên để miễn dịch cho gà Chúng tiến hành nuôi cấy E coli theo công thức môi trờng công thức nuôi cấy đà đợc nghiên cứu trên, để chế tạo kháng nguyên, phục vụ cho trình miễn dịch gà Có 15 lô kháng nguyên đà đợc chế tạo đợc kiểm tra tính chất về: đậm độ vi khuẩn, độ khiết, vô trùng an toàn Kết bảng 24 Bảng 24: Kiểm tra chất lợng lô kháng nguyên thử nghiệm 64 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh Lô Đậm độ vi kháng khuẩn nguyên Lô (CFU/ml) x108 Lô Kiểm tra Kiểm tra Độ an Đánh giá khiết vô trùng toàn chung Đạt Đạt Đạt Đạt 8.5 x108 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 1.5 x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 1x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô x109 Lô Lô Lô Lô 10 Đạt Đạt §¹t §¹t 1.5 x10 §¹t §¹t §¹t §¹t 2,5 x10 Đạt Đạt Đạt Đạt 1.5 x10 Đạt §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t §¹t x10 L« 11 3,5 x10 L« 12 9 x10 L« 13 8,5 x10 L« 14 x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Lô 15 x109 Đạt Đạt Đạt Đạt Theo kết bảng 24: 15 lô kháng nguyên đà sản xuất đạt tiêu chuẩn đợc đa vào sử dụng, gây miễn dịch cho gà 3.8 nghiên cứu quy trình miễn dịch cho gà Chúng chọn lô kháng nguyên đà chế tạo là: lô 6, lô 11 lô 14 để tiến hành thử nghiệm với qui trình miễn dịch đàn gà mái đẻ, đàn 10 Lấy máu gà kiểm tra HGKT huyết gà theo định kỳ Kết thử nghiệm miễn dịch đợc trình bày bảng 25 Bảng 25: Kết thử nghiệm qui trình miễn dịch gà Qui trình miễn dịch Qui trình 65 Qui trình Qui trình Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh Tuần 1/3,2 1/4,3 1/2 TuÇn 1/21,6 1/28,8 1/26,4 TuÇn 1/32 1/67,2 1/58,6 TuÇn 1/57,6 1/208 1/121,2 TuÇn 1/121,6 1/236,8 1/224 gà (sau Tuần 10 1/120,4 1/244,2 1/211,2 miễn dịch) Tuần 12 1/116,2 1/251,4 1/121 Tuần 15 1/56,8 1/121 1/62,4 Sau tiêm nhắc lại 1/57,2 1/265,6 1/112,2 Gà bắt đầu Gà bắt đầu Gà bắt đầu mệt, giảm ăn mệt, giảm ăn mệt, giảm ăn vòng 05 vòng vòng 04 ngày 02 ngày Gà mệt mỏi, ngày 3% gà bị chết, giảm ăn, sau đàn mệt ngày khoẻ mỏi, giảm ăn lại bình th- Gà mệt mỏi, ờng Gà mệt mỏi, giảm đẻ đến giảm đẻ đến 90% 02 30% 01 50% 02 HGKT trung b×nh huyÕt 4-5 sau lần tiêm miễn dịch sở Mức độ phản Sau tiêm ứng gà miễn dịch cao độ Sau tiêm nhắc lại ngày, giảm ăn ngày Gà mệt mỏi, giảm ăn, sau ngày khoẻ lại bình thờng Gà mệt mỏi, giảm đẻ đến ngày Qua kết thử qui trình thấy qui trình cho kết miễn dịch cao ổn định nên qui trình đợc chọn làm qui trình miễn dịch thức Qui trình miễn dịch kèm theo phụ lục (phụ lục 01) 66 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh 3.9 xác định hàm lợng kháng thể huyết lòng đỏ trứng gà Sau chọn đợc qui trình miễn dịch thích hợp, tiến hành tiêm miễn dịch cho đàn gà đẻ trứng dùng làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm kháng thể lòng đỏ trứng Chúng chọn lô kháng nguyên đà chế tạo là: lô 4, lô 6, lô 8, lô 11 lô 14 để miễn dịch cho đàn gà mái đẻ Theo dõi hàm lợng kháng thể huyết lòng đỏ trứng gà Sử dụng hai phản ứng ngng kết nhanh phiến kính ADP để xác định hàm lợng kháng thể (phản ứng ngng kết nhanh xác định hàm lợng kháng thể kháng với kháng nguyên thân E coli, phản ứng ADP xác định hàm lợng kháng thể kháng độc tố E coli) Kết định lợng hàm lợng kháng thể huyết lòng đỏ trứng gà tơng ứng với lô kháng nguyên miễn dịch đợc trình bày bảng 26 Nh vậy, với lô kháng nguyên khác nhau, sau miễn dịch cho gà giai đoạn thu hoạch trứng làm nguyên liệu, hiệu giá kháng thể ngng kết huyết gà có hàm lợng ổn định 1/128 đến 1/281,6; hiệu giá ADP dao động từ 1/8 đến 1/16 Hàm lợng kháng thể huyết lòng đỏ trứng gà không chênh lệch nhiều (hiệu giá kháng thể ngng kết trung bình lòng đỏ trứng dao động từ 1/118,2 đến 1/243,2; hiệu giá ADP dao ®éng tõ 1/8 ®Õn 1/16 ) §iỊu ®ã chøng tá kháng thể gà sau đáp ứng miễn dịch đợc truyền nhiều vào lòng đỏ trứng Đó điều kỳ diệu u việt lòng đỏ trứng gà Bảng 26: Hàm lợng kháng thể huyết lòng đỏ trứng gà Lô kháng nguyên HGKT trung bình huyết HGKT trung bình lòng ®á trøng Ngng kÕt nhanh ADP Ngng kÕt nhanh ADP L« 1/ 281,6 1/16 1/243,2 1/8 L« 1/128 1/8 1/118,4 1/8 L« 1/230,4 1/16 1/192 1/16 L« 11 1/256 1/8 1/217,6 1/16 L« 14 1/268,8 1/8 1/243,2 1/8 67 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh 3.10 nghiên cứu qui trình sản xuất Trứng thu hoạch từ gà miễn dịch đợc chế thử sản phẩm theo quy trình sản xuất khác nhau, chọn đợc QTSX4 tối u, đạt yêu cầu tiêu chuẩn: vật lý, vô trùng, HGKT xác định phản ứng ngng kết đạt từ 1/80-1/100, HGKT xác định phản ứng ADP đạt từ 1/8 - 1/16 Quy trình sản xuất kèm theo phụ lục (phụ lục 02) 3.11 Nghiên cứu qui trình kiểm nghiệm bảo quản chế phẩm 3.11.1 Khảo sát tiêu cảm quan sản phẩm Theo dõi tiêu cảm quan 03 lô sản phẩm; lô 20 mẫu vòng 06 tháng, thấy có khác biệt rõ rệt mẫu sản phẩm điều kiện bảo quản khác điều kiện nhiệt độ phòng khoảng 25oC, tất mẫu sản phẩm sau 01tháng đà chuyển màu từ vàng sang trắng ngà, có tợng phân lớp, sau 02 tháng có lắng cặn nhiệt độ bảo quản 2-8oC 06 tháng tất mẫu sản phẩm đạt yêu cầu cảm quan, không thay đổi màu sắc sản phẩm, độ đồng nhất, không váng, không cặn Vậy, sản phẩm bảo quản 2-8oC đạt yêu cầu 3.11.2 Khảo sát độ vô trùng sản phẩm Dùng lô sản phẩm, lô 20 mẫu để kiểm tra vô trùng theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCN) (Dợc điển Việt Nam II, Tập 3, NXB Y học, trang 498) Sản phẩm đợc kiểm tra môi trờng sau: NA (nutrient agar), NB (nutrient broth), BA (blood agar), SA (sabouraud agar), Thioglycolat Các môi trờng kiểm tra sản phẩm đợc để tủ ấm 370C, theo dõi ngày, riêng thạch nấm SA để nhiệt độ phòng với thời gian theo dõi ngày Sản phẩm đợc bảo quản 2-80C sau tháng kiểm tra vô trùng 01 lần, khảo sát 06 tháng Kết trình bày bảng 27 3.11.3 Khảo sát hiệu giá kháng thể sản phẩm Xác định phản ứng ngng kết nhanh phiến kính phản ứng ADP sản phẩm đợc bảo quản 2-80C với kháng nguyên độc tố E coli thời 68 Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh điểm khác nhau, khảo sát tháng Kết khảo sát độ vô trùng hiệu giá kháng thể bảng 27 Từ bảng 27 ta thấy điều kiện bảo quản 2-80C, độ vô trùng sản phẩm đợc bảo đảm 05 tháng Sau 05 tháng có 04 mẫu tổng số 60 mẫu hai lô có tạp trùng nhng không phát có nấm sản phẩm Hiệu giá kháng thể sản phẩm không thay đổi suốt thời gian bảo quản 69 ... [36] Để sớm tạo loại thuốc phòng chữa trị hiệu quả, an toàn bệnh tiêu chảy sng phù đầu E coli gây lợn, tiến hành đề tài: "Nghiên cứu chế tạo kháng thể qua lòng đỏ trứng gà để phòng chống tiêu chảy. .. đặc hiệu kháng thể phòng chữa bệnh tiêu chảy sng phù đầu lợn E coli Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh Chơng 1: Tổng Quan 1.1 Tình hình nghiên cứu E coli gây bệnh tiêu chảy phù đầu lợn 1.1.1... 3.2 Nghiên cứu khả sản sinh độc tố Của chủng E coli Nh đà trình bày, độc tố E coli thành phần gây bệnh tiêu chảy sng phù đầu lợn Vì vậy, mục tiêu nghiên cứu việc chế tạo kháng thể chống lại kháng