NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KHÁNG THỂ QUA LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ ĐỂ PHÒNG CHỐNG TIÊU CHẢY VÀ SƯNG PHÙ ĐẦU DO E. coli Ở LỢN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KHÁNG THỂ QUA LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ ĐỂ PHÒNG CHỐNG TIÊU CHẢY VÀ SƯNG PHÙ ĐẦU DO E. coli Ở LỢN

Mở đầu

Theo số liệu từ Tổng cục Thống kê năm 2008, cả nớc có 26,7 triệu con lợn,sản lợng thịt lợn hơi đạt 2.771.000 tấn, chiếm tỷ lệ 73,9% tổng sản lợng thịt gia súc,gia cầm [20].Ngành chăn nuôi lợn ở nớc ta đã khẳng định đợc tầm quan trọng và đòihỏi sự phát triển mạnh mẽ trong tơng lai Xuất phát từ nhu cầu ấy, Bộ Nông nghiệpvà Phát triển Nông thôn đã đề ra kế hoạch đến năm 2010 phải đạt bình quân đầu ngời35 kg thịt lợn hơi Cả nớc sẽ có 30 triệu con lợn với chất lợng đàn lợn thịt có tỷ lệnạc cao đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nớc và xuất khẩu [20].

Tuy nhiên, việc phát triển đàn lợn cũng làm xuất hiện các loại bệnh, ảnh hởngkhông nhỏ tới năng suất và hiệu quả chăn nuôi Trở ngại lớn nhất hiện nay, đặc biệttrong các cơ sở chăn nuôi lợn sinh sản là bệnh tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 21 ngàytuổi và phù đầu ở lợn từ 22 đến 60 ngày tuổi Bệnh không chỉ phổ biến ở nớc ta mà cònxuất hiện khắp thế giới, gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi lợn sinh sản.Bệnh xuất hiện lúc ồ ạt, lúc lẻ tẻ tùy thuộc vào thời tiết, khí hậu, điều kiện chăm sóc,quản lý Tỷ lệ lợn mắc bệnh cao, từ 70 - 85%, có những nơi 100%, tỷ lệ chết tới 18 -20% [3] Đặc biệt, tại các trại chăn nuôi lợn tập trung, bệnh càng gây thiệt hại đángkể [21]

Để chống lại bệnh do E coli, các nhà chăn nuôi đã sử dụng nhiều phơng

thuốc, từ cổ truyền đông y đến các liệu pháp kháng sinh hiện đại, kể cả các phơngpháp hoá sinh hay dinh dỡng kỹ thuật cao, nhng cũng chỉ khống chế đợc một phần.ở Việt Nam nhiều biện pháp áp dụng đã mang lại kết quả, trong đó tác dụng caonhất là dùng thuốc kháng sinh Mấy thập kỷ qua, thuốc kháng sinh đã giảm bớt đáng

kể tổn thất do dịch bệnh Tuy nhiên, các nhà khoa học trong nớc khẳng định E coli

đã kháng thuốc với tỷ lệ cao và kháng nhiều loại thuốc kháng sinh khác nhau [8],[19] Bên cạnh đó mặt trái của thuốc kháng sinh ngày càng lộ rõ, việc dùng thuốckháng sinh kéo dài đã tiêu diệt cả vi khuẩn có lợi trong đờng ruột Hậu quả là lợncon còi cọc, chậm lớn, lông xù, thịt lợn bị tồn d kháng sinh, ảnh hởng xấu đến sứckhoẻ cộng đồng và giảm giá trị thịt lợn xuất khẩu.

Xu hớng dùng các chế phẩm sinh học trong chăn nuôi là liệu pháp đúng đắnmà thế giới đang yêu cầu và phát triển Không chỉ giới hạn trong mục đích phòng trịbệnh, nâng cao năng suất chăn nuôi, việc sử dụng chế phẩm sinh học còn có ý nghĩaquan trọng đối với môi trờng và sức khoẻ cộng đồng vì nó tạo ra một nền sản xuấtthực phẩm an toàn, đảm bảo sự ổn định trạng thái cân bằng của môi trờng sinh thái.

Muốn đạt đợc yêu cầu đó, việc nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học antoàn để phòng và chữa bệnh cho vật nuôi đang đòi hỏi cấp bách Dựa trên cơ sở miễndịch học và phản ứng kháng nguyên - kháng thể ngời ta đã sản xuất đợc nhiều loại

kháng thể đặc hiệu từ huyết thanh động vật để chữa bệnh, nhng giá thành cao, khidùng dễ gây phản ứng huyết thanh nên ít đợc sử dụng rộng rãi.

Gần đây ngời ta phát hiện ra rằng, khi gà đợc tiêm kháng nguyên, kháng thể ởmáu đợc truyền sang lòng đỏ trứng tới 80%, đặc biệt là thành phần IgG Kháng thểđặc hiệu chế từ lòng đỏ trứng gà đợc miễn dịch sẽ có nhiều u thế hơn hẳn so vớikháng thể đặc hiệu chế từ huyết thanh động vật, vì khi ứng dụng vào sản xuất nó cóthể sản xuất với số lợng lớn, giá thành sản xuất thấp, không phải giết động vật và khidùng không xảy ra phản ứng phụ Cho đến nay đã có nhiều công trình ở các nớc nh:Đức, Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc công bố về việc chế tạo và sử dụng kháng thể ở lòngđỏ để điều trị và phòng nhiều bệnh vật nuôi có hiệu quả cao Qua gà, ngời ta đã thuđợc nhiều loại kháng thể chống lại các vi rút, vi khuẩn, độc tố, nọc rắn, các hoáchất để dùng cho các xét nghiệm chẩn đoán y học [36]

Để có thể sớm tạo ra một loại thuốc phòng và chữa trị hiệu quả, an toàn bệnh

tiêu chảy và sng phù đầu do E coli gây ra ở lợn, chúng tôi tiến hành đề tài: "Nghiêncứu chế tạo kháng thể qua lòng đỏ trứng gà để phòng chống tiêu chảy và sng phùđầu do E coli ở lợn", với hai mục tiêu sau:

 Phân lập, tuyển chọn và xác định các chủng E coli gây bệnh điển hình có độc

lực, có tính kháng nguyên mạnh để làm giống.

 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học đặc hiệu – kháng thể phòng và chữa

bệnh tiêu chảy và sng phù đầu của lợn do E coli.

Chơng 1: Tổng Quan

lợn

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nớc

Hiện tợng vi khuẩn Escherichia coli (E coli) gây bệnh tiêu chảy và phù đầu ở

lợn con đã có từ rất lâu và ngày càng phổ biến ở các trại chăn nuôi tập trung và trongnông hộ Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, bệnh tiêu chảy và phùđầu ở lợn con đã đợc khống chế phần nào, nhng việc loại trừ nó trong chăn nuôi thìhầu hết các nhà nghiên cứu đều cho rằng còn rất nhiều khó khăn không những ở nớcta mà còn ở cả các nớc có trình độ khoa học tiên tiến trên thế giới [2], [5], [9] Chínhvì vậy mà nhiều nhà khoa học vẫn quan tâm nghiên cứu.

Cù Hữu Phú và cs [13] đã phân lập đợc 60 chủng vi khuẩn E coli ở lợn mắc

bệnh tiêu chảy từ 35 ngày đến 4 tháng tuổi, trong đó có 42 chủng gây dung huyết

Lý Liên Khai [9] khi phân lập E coli từ phân lợn con bị tiêu chảy và phân lợncon khỏe mạnh đã cho biết: Các chủng E coli mang K88, K99 và 987P là nguyênnhân chính gây tiêu chảy cho lợn con từ 1 đến 2 tuần tuổi Vi khuẩn E coli thờng

xuyên c trú trong ruột lợn và chúng chỉ gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi nh : tácđộng stress làm giảm sức đề kháng của lợn, làm tăng số lợng vi khuẩn và sinh độc tố.Nguyễn Khả Ngự và cs [12] xác định khả năng dung huyết và kháng thuốc

kháng sinh của vi khuẩn E coli phân lập từ lợn con trớc và sau cai sữa bị phù đầu ởđồng bằng sông Cửu Long Với 21 chủng vi khuẩn E coli phân lập từ lợn chết, tác giả

cho biết 100% số chủng ngng kết với kháng huyết thanh K88, 40% gây dung huyếtmạnh, các chủng này đều có khả năng kháng nhiều loại thuốc kháng sinh thông th-

ờng Cũng nghiên cứu về khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E coli gây

tiêu chảy trên lợn, Bùi Thị Tho và cs [8] sau khi kiểm tra khả năng kháng thuốc kháng

sinh của 183 chủng E coli phân lập từ phân của lợn con bị phân trắng, đã nhận định:tính kháng thuốc của E coli ở mỗi cơ sở có sự khác biệt rõ rệt tùy theo quá trình sửdụng và có sự khác biệt về chủng E coli gây bệnh ở các lứa tuổi lợn khác nhau Cácchủng E coli tạo khuẩn lạc dạng nhám có tính kháng thuốc cao hơn các chủng tạokhuẩn lạc trơn Qua 20 năm kiểm tra tính kháng thuốc kháng sinh của E coli phân

lập từ lợn con bị bệnh phân trắng, các tác giả nhận thấy tính kháng thuốc của chúngđối với một số thuốc kháng sinh thờng dùng tăng lên rất nhanh Tỷ lệ các chủngkháng nhiều loại thuốc kháng sinh cũng phát triển nhanh, một số chủng đã kháng vớihầu hết các loại thuốc thờng dùng [8].

Đỗ Ngọc Thúy và cs [19] cho biết tỷ lệ kháng kháng sinh của 106 chủng

E coli đợc phân lập từ lợn con theo mẹ bị tiêu chảy có xu hớng kháng mạnh với các

loại thuốc kháng sinh thờng dùng để điều trị bệnh nh amoxicillin, cloramphenicol,streptomycin

Đỗ Trung Cứ và cs [4] khi sử dụng chế phẩm Biosubtyl để phòng bệnh tiêuchảy cho lợn con đã làm giảm đợc 42% số lợn tiêu chảy ở lợn con giai đoạn từ 1 đến60 ngày tuổi

1.1.2 Tình hình nghiên cứu ở nớc ngoài

Cox và cs [34] cho rằng, E coli cộng sinh có mặt thờng trực trong đờng ruột

của ngời và động vật, trong quá trình sống vi khuẩn có khả năng tiếp nhận các yếu tốgây bệnh nh yếu tố bám dính (K88, K99), yếu tố dung huyết (Hly), yếu tố cạnh tranh(Colv), yếu tố kháng thuốc kháng sinh và độc tố đờng ruột Các yếu tố gây bệnh nàykhông đợc di truyền qua ADN của nhiễm sắc thể mà đợc di truyền qua ADN nằm trên

plasmid Những yếu tố gây bệnh này giúp cho E coli bám dính vào tế bào nhung mao

ruột non, xâm nhập vào thành ruột, phát triển với số lợng lớn Sau đó vi khuẩn thực hiệnquá trình gây bệnh bằng cách sản sinh độc tố, gây triệu chứng tiêu chảy, phá hủy tế bàoniêm mạc ruột và tế bào nhung mao ruột non

Fairbrother và cs [37] khi nghiên cứu các yếu tố gây bệnh ở từng chủng

E coli phân lập đợc từ các thể bệnh khác nhau, đã đặt tên vi khuẩn theo những yếu tốgây bệnh mà chúng có khả năng sinh ra nh: Enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC), Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), Verotoxigenic Escherichia coli(VTEC) và Adherencia Enteropathogenic Escherichia coli (AEEC).

E coli gây bệnh tiêu chảy và phù đầu ở lợn con có mặt ở hầu hết các nớc trên

thế giới nên đã có nhiều tác giả nghiên cứu về chúng Simon và cs [62] đã làm rõ vai

trò của ba loại kháng nguyên bám dính K88 trong E coli là K88ab, K88ac và K88advà cho biết: các chủng E coli sản sinh độc tố đờng ruột (ETEC) mang những kháng

nguyên bám dính này đều gây tiêu chảy nặng dẫn đến tử vong ở một số lợn con Sựcảm nhiễm bệnh tiêu chảy và phù đầu ở lợn con có liên quan mật thiết đến khả năng

bám dính của E coli

Smith thông báo có hai loại độc tố là thành phần chính của Enterotoxin đợc tìm

thấy ở các chủng E coli gây bệnh tiêu chảy Sự khác biệt của hai loại độc tố này nằm ở

khả năng chịu nhiệt Độc tố chịu nhiệt (Heat stable toxin -ST) chịu đợc nhiệt độ 1000Ctrong 15 phút, độc tố không chịu nhiệt (Heat labile toxin -LT) bị bất hoạt ở 600Ctrong vòng 15 phút [63]

Cùng với việc phân lập và nghiên cứu các yếu tố gây bệnh của E coli, việc

nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm phòng bệnh tiêu chảy ở lợn cũng đã đợc cácnhà khoa học trên thế giới đặc biệt quan tâm.

1.2 Vi khuẩn Escherichia coli

Trực khuẩn ruột già Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae Trong các vikhuẩn đờng ruột, E coli là loài phổ biến nhất E coli còn có tên là Bacterium colicommune, Bacillus coli communis do Escherich phân lập năm 1885 từ phân trẻ em

E coli thờng xuất hiện rất sớm ở đờng ruột ngời và động vật, ngay sau khi đẻ

hai giờ và tồn tại cho đến khi vật chủ chết Chúng thờng định c ở phần sau của ruột,ít khi gặp ở dạ dày hay ruột non Trong nhiều trờng hợp còn tìm thấy chúng ở niêmmạc của nhiều bộ phận khác trong cơ thể.

Từ đờng tiêu hóa, E coli đợc thải theo phân ra môi trờng ngoài Việc tìm chỉsố E coli ở môi trờng giúp đánh giá môi trờng đó tốt hay xấu về mặt vệ sinh [6], [18].

ở điều kiện bình thờng, các chủng E coli không gây bệnh, khi các điều kiện chămsóc, nuôi dỡng, vệ sinh thú y kém, điều kiện ngoại cảnh bất lợi dẫn đến sức chống đỡ

của con vật suy giảm thì E coli trở nên độc và có khả năng gây bệnh [18].

1.2.1 Đặc tính sinh vật hóa học của E coli

1.2.1.1 Đặc tính hình thái

E coli là trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, kích thớc 2-3 x 0,6 m Trên tiêu bản

nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu,đứng tụ lại thành từng đám, đôi khi xếp 2 - 3 vi khuẩn thành một chuỗi dài Trong

môi trờng nuôi cấy lâu ngày có khi thấy những trực khuẩn dài 4 - 8 m E coli di

động nhờ có lông ở xung quanh thân, nhng khi nuôi cấy trong điều kiện bất lợi sẽmất lông, không di động Vi khuẩn không sinh bào tử, nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạcnhày để nhuộm có thể thấy màng giáp, còn khi soi tơi sẽ không thấy đợc [39] Dới

kính hiển vi điện tử, còn phát hiện đợc các pili, yếu tố bám dính của E coli [18].

1.2.1.2 Đặc tính nuôi cấy

E coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sinh trởng ở nhiệt độ

từ 5 - 400C, nhiệt độ thích hợp là 370C, pH thích hợp là 7,2 - 7,4, nhng có thể phát triểnđợc ở pH từ 5,5 – 8,0 [18].

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trờng nuôi cấy thông thờng, một số

chủng có thể phát triển đợc ở môi trờng tổng hợp đơn giản [13].

- Trên môi trờng thạch thờng: Sau khi nuôi cấy 370C/24 giờ, E coli hình thành

khuẩn lạc tròn ớt, bóng láng, màu tro nhạt, hơi lồi, đờng kính 2-3 mm Có thể quansát thấy cả những khuẩn lạc dạng nhày (mucous) và dạng nhám (rough).

- Trong môi trờng nớc thịt: Sau khi nuôi cấy 370C/24 giờ, E coli phát triển rất

nhanh, môi trờng rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi hìnhthành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trờng, môi trờng có mùi phân thối.

- Trên môi trờng thạch máu: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C hình thành khuẩn lạc to, ớt,lồi, viền không gọn, màu sáng, kích thớc từ 1 -2 mm Có khi gây dung huyết.

- Trên môi trờng thạch Mac Conkey: Sau khi nuôi cấy 24 giờ ở 370C hình thànhkhuẩn lạc màu đỏ cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhày, rìa gọn, không làmchuyển màu môi trờng.

- Trên môi trờng Endo: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chín, có ánh

kim hoặc không có ánh kim.

- Trên môi trờng EMB (Eosin Methyl Blue): Hình thành khuẩn lạc màu tím đen có

ánh kim.

Không mọc trên các môi trờng lục Malachite và Miiller Kauffmann Bị ức chếkhi nuôi trong các môi trờng Wilson Blair.

1.2.1.3 Đặc tính hóa sinh

- Lên men sinh hơi các loại đờng:

E coli có khả năng lên men sinh hơi các loại đờng glucose, fructose,

galactose, lactose, maniton, mannit, levulose, xylose, không lên men andonit vàinnozit, lên men không ổn định các loại đờng dulciton, saccarose, salixin [18]

E coli lên men sinh hơi nhanh đờng lactose, còn Salmonella spp thì không cóđặc tính này, đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt E coli với Salmonella spp.- Các phản ứng khác:

Sữa Đông sau 24 giờ đến 72 giờ ở 370C

ớng đề kháng với nhiệt cao hơn những chủng phân lập ở môi trờng bên ngoài ở môi

trờng bên ngoài các chủng E coli gây bệnh có thể tồn tại đến 4 tháng Các chất sát

trùng nh axit phenic 3%, clorua thủy ngân (HgCl2) 0,1%, formol 0,2% có thể diệt E.coli sau 5 phút E coli đề kháng với điều kiện khô và hun khói [18]

1.2.2 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E coli

E coli đợc chia thành các nhóm huyết thanh (serogroup) và kiểu huyết thanh

(serotype) khác nhau dựa theo cấu trúc kháng nguyên O, K, H và F Theo phản ứng

ngng kết có 250 kiểu kháng nguyên O, 89 kháng nguyên K, 56 kháng nguyên H và mộtsố kháng nguyên F [17], [25].

1.2.2.1 Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân - Ohne Hauch)

Kháng nguyên O của E coli có bản chất lipopolysaccharide, rất độc Chỉ cần

1/20 mg kháng nguyên O đủ giết chết chuột bạch sau 24 giờ Kháng nguyên O đợccoi nh một yếu tố độc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào vi khuẩn

Cấu trúc phân tử polysaccharide của kháng nguyên O gồm hai phần: phầnpolysaccharide nằm ngoài chứa nhóm hydro có chức năng tạo ra tính đặc trng vềserogroup Phần polysaccharide ở bên trong không chứa nhóm hydro có chức năngphân biệt giữa các dạng khuẩn lạc: dạng S (Smooth), dạng R (Rough), dạng M(Mucous) Khi làm mất dần từng đơn vị đờng của các chuỗi polisaccharide hoặc làmthay đổi vị trí ở các đơn vị này sẽ dẫn đến thay đổi độc lực của các vi khuẩn.

Kháng nguyên O chịu đợc nhiệt, không bị phá hủy khi đun nóng ở 1000C trong2 giờ Dới tác động của cồn, axít HCl nồng độ 1N vi khuẩn chịu đợc trong 20 giờ,nhng lại bị phá hủy bởi formol 0,5%.

Kháng nguyên O đợc cấu trúc bởi các phân tử lớn, thành phần các phân tửgồm có:

+ Polyosit: tạo ra tính đặc hiệu của kháng nguyên.+ Protein: làm cho phức hợp có tính kháng nguyên.+ Lipit: kết hợp với polyosit và là cơ sở của độc tính.

Tất cả kháng nguyên O đều c trú ở bề mặt, do đó nó liên hệ trực tiếp với hệthống miễn dịch Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tơng ứng sẽ xảy raphản ứng ngng kết Phản ứng ngng kết kháng nguyên O tạo thành những hạt nhỏ, khilắc rất khó tan.

1.2.2.2 Kháng nguyên H (kháng nguyên lông - Hauch)

Kháng nguyên H là thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất protein, rấtkém bền vững so với kháng nguyên O Kháng nguyên H không chịu nhiệt, bị pháhủy ở 600C trong 1 giờ Bị cồn 50% và các enzym phân giải protein phá hủy Khángnguyên H tồn tại đợc khi xử lý bằng formol 0,5%.

Kháng nguyên H khi gặp kháng thể H tơng ứng sẽ tạo ra hiện tợng ngng kếtH, trong đó các vi khuẩn đợc ngng kết lại với nhau nhờ các lông vì các kháng thể Hkhi cố định trên lông sẽ là cầu nối với các lông bên cạnh Phản ứng xảy ra nhanh hơnso với kháng nguyên O và các hạt ngng kết cũng lớn hơn, giống nh những cụm bôngrất dễ tan khi lắc vì lông của vi khuẩn rất nhỏ và dễ đứt Vi khuẩn di động khi tiếpxúc với kháng thể H tơng ứng sẽ trở thành không di động.

Kháng nguyên H của E coli không có tính độc và cũng không có ý nghĩa

trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít đợc quan tâm nghiên cứu, nhng nó có ý nghĩarất lớn trong việc xác định tên vi khuẩn [51] Các nhà khoa học đã dùng những

chủng E coli có lông và không có lông của cùng một serogroup O để gây cảm

nhiễm cho chuột bằng đờng miệng với lợng vi khuẩn bằng nhau Kết quả cho thấykhả năng gây bệnh cho chuột thí nghiệm hoàn toàn giống nhau

Kháng nguyên H bảo vệ cho vi khuẩn khỏi bị tiêu diệt trong tế bào đại thựcbào, từ đó giúp vi khuẩn sống lâu và tồn tại lâu hơn trong đại thực bào.

1.2.2.3 Kháng nguyên K (Kháng nguyên vỏ - Capsular)

Kháng nguyên K còn đợc gọi là kháng nguyên vỏ (Capsular), chúng baoquanh tế bào vi khuẩn và có bản chất hóa học là polysaccharide Kháng nguyên nàyngăn cản sự ngng kết của vi khuẩn trong huyết thanh "O" tơng ứng Khi đun nóng100 - 1210C kháng nguyên sẽ mất tác dụng ngăn cản Vai trò của kháng nguyên Kcha đợc thống nhất lắm Có nhiều ý kiến cho rằng, nó không có ý nghĩa về độc lực

của vi khuẩn, vì thấy độc lực của chủng E coli có kháng nguyên K cũng giống độc

lực của chủng không có kháng nguyên K [33] Có ý kiến khác cho rằng, nó có ý nghĩavề độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trớc những yếu tố phòng vệ của vật chủ[47] Tuy vậy, phần lớn các ý kiến đều thống nhất kháng nguyên K có hai nhiệm vụsau:

- Hỗ trợ trong phản ứng ngng kết của kháng nguyên O nên thờng ghi liền công thức

serotype của vi khuẩn là Ox: Ky nh E coli O139: K88, O149: K88

- Tạo ra hàng rào bảo vệ cho cho vi khuẩn chống lại tác động của ngoại cảnh và hiện ợng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ

t-1.2.2.4 Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae- Kháng nguyên bám dính)

Hầu hết các chủng E coli gây bệnh đều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng

nguyên bám dính Các chủng không gây bệnh không có kháng nguyên bám dính.Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bàobiểu mô ruột và trên lớp màng nhày, giúp vi khuẩn chống lại khả năng đào thải của

nhu động ruột Kháng nguyên bám dính của E coli nằm trên cấu trúc pili (fimbriae),

một cấu trúc ngắn thẳng, xuất phát từ một đĩa gốc trong màng nguyên sinh chất củatế bào vi khuẩn Fimbriae có bản chất là protein mọc trên bề mặt tế bào vi khuẩn vớisố lợng từ 10 - 40 fimbriae trên một tế bào vi khuẩn Quan sát dới kính hiển vi điệntử, chúng giống nh một chiếc áo lông bao bọc xung quanh vi khuẩn Fimbriae của vi

E coli khác lông ở chỗ cứng hơn, không lợn sóng và không liên quan đến chuyển

động Kháng nguyên bám dính đợc phân loại bởi phản ứng huyết thanh, thụ thể đặchiệu hoặc bằng khả năng ngng kết với hồng cầu của các loài động vật khác nhau và

bằng phản ứng PCR [17], [51] Kháng nguyên có chức năng bám dính đặc trng của ETEC

(Enterotoxigenic E coli) gây bệnh cho lợn chủ yếu là F4 (K88); F6 (987P); F107 và đôi

khi có cả F5 (K99) Kháng nguyên có chức năng bám dính của ETEC gây tiêu chảy

nguyên phát ở trâu bò là F5 (K99) đôi khi thấy cả F4 (K88) với tỷ lệ ít hơn E coli gây

bệnh cho trẻ em thờng có kháng nguyên bám dính F41 [51], [67].

1.3.1 Yếu tố bám dính của E coli

Để gây bệnh, các chủng ETEC phải bám dính đợc lên tế bào biểu mô của ruộtnon Quá trình bám dính đợc thực hiện qua ba giai đoạn: hấp thụ, gắn kết và bám dính.Hai quá trình trớc đợc thực hiện nhờ các tác động vật lý, hóa học, bớc bám dính đợcthực hiện bởi các sợi bám dính chuyên biệt (pili) trên bề mặt vi khuẩn đảm nhiệm, đó làquá trình liên kết giữa kháng nguyên tại yếu tố bám dính với các receptor tơng ứng trênbề mặt của các tế bào biểu mô Hầu hết các chủng ETEC đều có các yếu tố bám dínhbao gồm: K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), F17, F18, F41, F42 và F165 Fimbriae là sựtập hợp của các đơn vị protein nhỏ, đợc sắp xếp thành những sợi dây nhỏ gắn vào tế bàovà có tính miễn dịch cao Các sợi bám dính và độc tố đờng ruột của các chủng ETECnhìn chung đợc di truyền bởi plasmid ngoại trừ F41 và F17 [51], [61], [67]

Về mặt hình thái học, những sợi fimbriae này là những phần protein gắn vào, cóđoạn thẳng, có đoạn hơi cong hoặc xoắn, có nguồn gốc từ màng ngoài của các tế bào vikhuẩn Chúng có khối lợng phân tử khác nhau, từ 15 - 25 KDa [51], [61] Mặc dù cácthuật ngữ fimbriae và pili trớc kia đợc sử dụng nh những từ đồng nghĩa, nhng ngày naythuật ngữ fimbriae đợc dùng để chỉ nhóm protein bề mặt gắn vào màng tế bào, trái lạipili lại dùng để chỉ một đặc tính hình thái chuyên biệt của fimbriae Pili có cấu trúc cứngcó đờng kính từ 7 - 8 nm và có một lỗ ở trục (nhóm 1), trái lại fimbriae thì khá mảnh vàlinh hoạt với đờng kính không ổn định từ 2 - 4 nm (nhóm 2) Có thể thấy rõ là F1 và F6thuộc vào nhóm 1 có cấu trúc giống nh pili, trái lại F4 và F5 thuộc nhóm thứ 2 có cấutrúc giống fimbriae [51] Nhìn chung, các fimbriae bao gồm các đơn vị cấu trúc nhỏđợc điều khiển và tập hợp dới sự hoạt động của các gen cấu trúc, đợc gọi là sợi bámdính.

ETEC gây bệnh tiêu chảy cho lợn thờng mang các yếu tố bám dính sau đây:

- F4 (K88)

F4 hay còn gọi là K88 đầu tiên đợc mô tả bởi Orskov và cs (1961), là một khángnguyên không chịu nhiệt, không đợc sản sinh ở nhiệt độ 180C Theo nghiên cứu trớc kiacủa Kauffman (1947) thì kháng nguyên bề mặt này đợc cho là kháng nguyên vỏ (K) cóbản chất là polysacharide vì thế chúng đợc cho là K88 Các nghiên cứu sau này đã chỉra rằng K88 không phải là polysacharide mà có bản chất là protein, nó không phải làkháng nguyên vỏ nh đã đợc xác nhận trớc đây mà là fimbriae hay pili Tuy nhiên,

thuật ngữ này vẫn đợc dùng cho đến năm 1983 khi Orskov đề nghị sử dụng khángnguyên F (fimbriae) thay cho kháng nguyên K (capsular) Bằng việc sử dụng các khánghuyết thanh đặc hiệu, Orskov và cs (1964) đã phân biệt đợc hai loại khác nhau của F4 làF4ab và F4ac Vào năm 1979, loại thứ 3 đợc phát hiện bởi Guinee và Jansen đợc đặt tênlà F4ad [17] Rõ ràng là sợi F4 có chứa một vùng cố định hình thành loại "a" và cácvùng khác nhau, hình thành loại "b", "c", "d" Về mặt hình thái, F4 có các cấu trúc khácnhau, từ mảnh, linh hoạt và kéo dài cho tới dạng cứng Sự khác nhau này phần lớn phụthuộc vào môi trờng nuôi cấy [61].

Thành phần chính của F4 đã đợc mô tả đầu tiên bởi Mooi và cs [54] Phântích F4 tinh khiết trong hỗn dịch gel dodecyl sulfate polyacrylamide cho thấy mộtdải protein đơn lẻ với khối lợng phân tử từ 23.500 đến 26.000 Da, tuỳ thuộc vào cácloại F4 phân lập đợc [54] F4 có hàng trăm các đơn vị protein nhỏ giống nhau, cácđơn vị này tạo thành sợi fimbriae

Sợi F4giúp cho vi khuẩn bám đợc vào thụ thể tơng ứng của nó trên tế bàobiểu mô của lông nhung ruột non từ đó vi khuẩn có thể xâm nhập, cố định và pháttriển đợc ở thành ruột non

- F5 (K99)

F5 trớc kia đợc cho là kháng nguyên bám dính của E coli chỉ gây bệnh ở bê,

nghé và cừu Tuy nhiên, hiện nay chúng cũng đợc tìm thấy với tỷ lệ thấp ở các chủngETEC phân lập từ lợn tiêu chảy [46] Sự sản sinh F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố củavi khuẩn nh tốc độ sinh trởng, pha sinh trởng, nhiệt độ và alanine trong môi trờng [51].Các gen mã hóa cho sự tổng hợp K99 nằm trong ADN của plasmid Plasmid này cókhối lợng phân tử là 87,8 KDa [46].

- F6 (987P)

F6 nằm trong số các fimbriae phát hiện thờng xuyên nhất, nó đợc sản xuất bởiETEC ở lợn Fimbriae này đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của ETECnhờ việc gắn kết vi khuẩn với các tế bào biểu mô ruột và cải thiện sự bám dính ởmàng nhầy để đa lợng độc tố đờng ruột tối đa đến vật chủ [49].

Cấu trúc F6 bao gồm sự sắp xếp xoắn ốc của 3 protein: đơn vị chính FaeA,đơn vị phụ FaeF và FaeG nằm ở đỉnh và các vị trí khác nhau dọc theo sợi fimbriae.Các protein này có vai trò gắn kết F6 với thụ thể glycoprotein [34], [35] F6 củaETEC ở lợn có thể giúp vi khuẩn bám vào cả các thụ thể đợc cấu tạo bởiglycoprotein và glycolipid trên riềm bàn chải của các tế bào biểu mô ruột lợn [34]

- F41

Những nghiên cứu đầu tiên về K99 cho rằng, đây là kháng nguyên gồm 1 đơnvị, nhng gần đây khi điện phân thấy rằng nó có 2 đơn vị nhỏ, 1 đi về cực dơng và 1 đi về

cực âm Đơn vị đi về cực dơng đợc cho là 1 fimbriae riêng biệt có tên là F41 Khối ợng phân tử của F41 là 30,5 KDa [33].

l-Các đặc điểm của F41 đợc thể hiện khác nhau phụ thuộc vào thành phần củamôi trờng nuôi cấy F41 nguyên thể có cấu trúc sợi với đờng kính là 3,2 nm [47]

ox và cs đã nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về khả năng mẫn cảm và sức

đề kháng của lợn đối với E coli có mang F41 Kết quả cho thấy các chủng có F41

bám vào lông nhung (với số lợng thấp) của 23 trong số 30 lợn đợc kiểm tra ở độ tuổi4 đến 5 tuần Ngoài ra, những lợn lớn tuổi hơn có sức đề kháng cao hơn với sự bám

dính của các chủng E coli có F41 do các thụ thể tơng ứng với F41 bị giảm đi.

- F17

F17 chủ yếu đợc phát hiện ở chủng E coli gây tiêu chảy hay nhiễm trùng máutrên bò Một vài nghiên cứu cũng cho thấy sự xuất hiện của F17 ở các chủng E coliphân lập từ bò tiêu chảy ở Pháp và Bỉ (chiếm tới 46%) [57] Các chủng E coli có F17 đ-

ợc phân lập từ các chất trong ruột bò cũng đợc gọi là chủng ETEC, khi F41, F5 hoặc cả haicùng xuất hiện ở trên bề mặt tế bào vi khuẩn F17cũng đợc tìm thấy ở các chủng E coli

gây tiêu chảy ở lợn [57].

- F18

F18 không làm ngng kết hồng cầu, sản sinh rất ít khi vi khuẩn đợc nuôi cấytrong các môi trờng thông thờng [51] F18 đợc chia làm hai loại là F18ab và F18ac[67] Các nghiên cứu cho thấy rằng F18ab và F18ac khác nhau về mặt sinh học.F18ab ít thấy thể hiện ở trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm Chúng th-ờng thấy cùng với việc sản xuất SLT-2e ở các chủng VTEC, trong khi F18ac thể hiệnrất rõ ở cả trong thực tế và trong phòng thí nghiệm, chúng mang các đặc tính của cácchủng ETEC.

Một đặc điểm đáng chú ý ở F18ac là chúng không bám vào riềm bàn chải củalợn sơ sinh trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm [67], cũng không tậptrung ở lớp màng nhầy ruột của lợn con mới sinh Điều này ngợc với F5 và F6, chúngbám vào các tế bào biểu mô ruột Khả năng bám này ở lợn con nhiều hơn so với lợnlớn Lý do xác đáng để giải thích về việc tăng sự mẫn cảm với bám dính của F18abvà F18ac theo tuổi của lợn vẫn cha đợc làm rõ, nhng có thể là do sự tăng dần các thụthể đặc hiệu ở lông nhung ruột của lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi Sự thiếu hụt các thụthể của F18ab và F18ac ở lợn sơ sinh có thểgiải thích cho lý do vì sao chỉ thấy cácchủng VTEC và ETEC ở lợn cai sữa [61], [61]

1.3.2 Yếu tố xâm nhập của E coli

Yếu tố xâm nhập của E coli là một khái niệm đựơc dùng để chỉ quá trình chađợc hiểu rõ, nhờ quá trình này mà E coli qua đợc hàng rào bảo vệ của lớp nhầy trên

bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào biểu mô, đồng thời sinh sản và phát triểntrong lớp tế bào này Trong khi đó những vi khuẩn khác không có khả năng xâmnhập, không thể qua đợc hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua đợc hàngrào này sẽ bị bắt bởi đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc [2], [6]

1.3.3 Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên

Theo ý kiến của nhiều tác giả, mặc dù E coli có nhiều loại kháng nguyên,

trong đó có loại tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịchphòng vệ cho vật chủ nhng đều tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo điềukiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ và tham gia vào quá trình kháng lạicác yếu tố phòng vệ tự nhiên của vật chủ Các kháng nguyên tham gia quá trình trênphải kể đến là kháng nguyên O, kháng nguyên K và kháng nguyên F [17].

1.3.4 Yếu tố dung huyết (Hly) của E coli

Khi E coli phát triển trong tổ chức cơ quan, sắt đợc cung cấp phụ thuộc vào

chất siderofor do vi khuẩn sản sinh ra Chất này có khả năng phân hủy sắt liên kếttrong tổ chức vật chủ thông qua sự phá vỡ hồng cầu giải phóng sắt dới dạng hợp chấtHEM để vi khuẩn sử dụng Sự phân hủy hồng cầu chủ yếu là do enzum heamolyzincủa vi khuẩn tiết ra vì thế có thể coi nó là một yếu tố độc lực gây bệnh của vi khuẩn

[16] Khả năng dung huyết là yếu tố độc lực quan trọng của E coli gây bệnh đờngtiết niệu E coli phân lập từ cơ quan cảm nhiễm ngoài đờng ruột thờng có khả năngdung huyết cao hơn nhiều so với E coli phân lập từ phân.

Có 4 kiểu dung huyết của E coli: -haemolysin, -haemolysin, -haemolysin,

-haemolysin nhng quan trọng nhất là kiểu -haemolysin và -haemolysin [16],[63].

Heamolyzin do E coli sinh ra có thể gây chết chuột, phôi trứng, tế bào phôi gà,

tế bào thận chuột và gây hoại tử da thỏ Khối lợng phân tử của heamolyzin khoảng300.000 Da, đợc cấu tạo chủ yếu từ protein, ngoài ra còn có hydratcacbon [63]

Theo Smith [63] E coli gây bệnh cho lợn có khả năng sản sinh heamolyzin,thờng thấy chủ yếu ở các serotgroup O nh: O8, O138, O141, O147 Đa số E coli gây

bệnh đờng ruột cho lợn con theo mẹ đều gây dung huyết, đặc tính này không bền vữngkhi nuôi cấy nhiều đời qua môi trờng nhân tạo.

1.3.5 Yếu tố kháng khuẩn Colicin V của E coli (ColV)

Trong quá trình phát triển và c trú ở đờng ruột, E coli phát triển và tồn tạicộng sinh với nhiều loại vi khuẩn đờng ruột khác: Salmonella spp, Staphylococcusspp, Clostridium, Vibrio cholera Để tạo điều kiện cho quá trình phát triển của mình vàtrở thành vi khuẩn chiếm u thế trong đờng ruột, E coli sản sinh ra chất kháng khuẩn

có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác, đợc gọi là ColV Vì vậy, yếu

tố này cũng đợc coi là yếu tố độc lực của E coli gây bệnh [5].

Khả năng sản sinh Colv của E coli đợc di truyền qua plasmid, ColV plasmidđợc tìm thấy không chỉ ở E coli gây bệnh mà còn tìm thấy ở các loại vi khuẩn đờng

ruột khác Yếu tố ColV lần đầu tiên đợc tìm thấy năm 1936, nhng ColV plasmid thìmới phân lập đợc trong thời gian gần đây Ngời ta cho rằng việc di truyền ColV thờnggắn liền với việc di truyền serotype O18:K9:H7 Nhiều tác giả cho ColV là một chấtkháng sinh có hiệu quả, có thể tác dụng với tất cả các loại vi khuẩn đờng ruột trừ vikhuẩn sinh ra nó Họ mong muốn rằng trong thời gian tới ColV đợc sử dụng rộng rãinh một chất kháng sinh để ức chế hay tiêu diệt các loại vi khuẩn đờng ruột khác.

1.3.6 Tính kháng thuốc kháng sinh của E coli

Để điều trị bệnh đờng ruột ngời ta sử dụng nhiều loại thuốc kháng sinh, ngoàira còn trộn chúng vào thức ăn với tỷ lệ thấp để phòng bệnh và kích thích tăng trọng.

Vì vậy, khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn đờng ruột nói chung và E.coli nói riêng đang ngày một tăng làm cho hiệu quả điều trị giảm, thậm chí nhiều

loại thuốc kháng sinh còn bị vô hiệu hóa hoàn toàn Phạm Khắc Hiếu và cs [8] đã

tìm thấy chủng E coli kháng lại 11 loại kháng sinh đồng thời chứng minh khả năngdi truyền tính kháng thuốc giữa E coli và Salmonella spp qua plasmid.

Sở dĩ khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn nói chung và E coli nói

riêng tăng nhanh, lan rộng vì gen sản sinh yếu tố kháng thuốc kháng sinh nằm trongplasmid R (Resistance) Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền ngang cho tấtcả quần thể vi khuẩn thích hợp [19] Với những ý nghĩa trên, ngày nay việc nghiêncứu khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn không còn đơn thuần là việc lựa

chọn thuốc kháng sinh mẫn cảm để điều trị bệnh do E coli gây ra mà là nghiên cứu

một yếu tố gây bệnh của vi khuẩn này

1.3.7 Độc tố của E coli

E coli bám dính, xâm nhập vào niêm mạc ruột và sản sinh ra các loại độc tố

đờng ruột Các độc tố này làm thay đổi quá trình trao đổi nớc và điện giải ở ruột nonvà dẫn tới tiêu chảy do dịch tiết ra quá nhiều ở ruột non, không đợc hấp thu lại ở ruột

già [5], [9] Sự sản sinh độc tố đợc xem là một yếu quan trọng của E coli Độc tố và

yếu tố bám dính đợc coi là những yếu tố độc lực vô cùng quan trọng đã và đang đợc

nhiều tác giả quan tâm và đề cập đến trong các nghiên cứu về E coli.

E coli sản sinh nhiều loại độc tố: enterotoxin, verotoxin, neurotoxin Mỗi loại

độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra

- Nhóm độc tố đờng ruột (Enterotoxin)

Fairbrother và cs [37] cho biết độc tố đờng ruột do E coli tạo ra (ETEC) gâytiêu chảy trầm trọng cho lợn sơ sinh từ 1 - 4 ngày tuổi E coli xâm nhập vào tế bào

biểu mô ruột bằng một hoặc nhiều yếu tố bám dính F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P)và F41 rồi xâm nhập vào thành ruột Tại đó chúng sản sinh ra độc tố đờng ruột gồmhai loại:

+ Độc tố chịu nhiệt (Heat stable toxin - ST)

Độc tố này chịu đợc nhiệt độ 1000C trong 15 phút Độc tố ST đợc chia thành hainhóm STa và STb dựa trên đặc tính sinh học và khả năng hòa tan trong methanol.

STa là một protein không có tính kháng nguyên, có phân tử lợng gần 2.000Da, STa kích thích sản sinh cGMP mức cao trong tế bào, ngăn trở hệ thống chuyểnNa+ và Cl-, làm giảm khả năng hấp thu chất điện giải và nớc ở ruột STa thờng thấy ởETEC gây bệnh ở lợn dới hai tuần tuổi và ở lợn lớn [39].

STb là một protein có tính kháng nguyên yếu, có phân tử lợng gần 5.000 Da,STb kích thích tiết dịch độc lập ở ruột, phơng thức tác dụng của nó cha đợc hiểu rõ.STb hoạt động ở ruột non lợn, nhng không hoạt động ở ruột non chuột, bê và bị vô

hoạt bởi trypsin STb đợc tìm thấy ở 75% các chủng E coli phân lập từ lợn con, 33%

phân lập từ lợn lớn [39].

Vai trò của STb trong tiêu chảy cha đợc biết đến, mặc dù ETEC sản sinh STbcó thể kích thích gây tiêu chảy và làm teo lông nhung ruột ở lợn con trong điều kiệnthực nghiệm [52].

Cả STa và STb đều có vai trò quan trọng trong việc gây tiêu chảy của các

chủng E coli gây bệnh ở bê, nghé, dê, cừu, lợn con và trẻ sơ sinh.+ Độc tố không chịu nhiệt (Heat labile toxin - LT):

Độc tố này bị bất hoạt ở nhiệt độ 600C trong vòng 15 phút LT là độc tố phứctạp có khối lợng phân tử cao, gồm 5 nhóm trong đó nhóm B có thể gắn với thụ thểtrên bề mặt tế bào biểu mô, còn nhóm A có hoạt tính sinh học cao Nhóm A kíchthích sản sinh cAMP ở mức cao trong tế bào, dẫn đến tăng tiết Cl-, Na+, HCO3- và n-ớc vào trong ruột [56] Sự tiết nớc quá mức sẽ dẫn đến sự mất nớc nặng và rối loạntrao đổi chất, có thể dẫn đến chết gia súc.

LT cũng có hai nhóm phụ LT1 và LT2, chỉ có LT1 bị trung hòa bởi

anticholerae toxin LT đợc sinh ra bởi các chủng E coli ở lợn thuộc nhóm phụ LT1,

còn LT2 đợc sinh ra bởi ETEC phân lập từ lợn và ngời LT là một trong những yếu tốquan trọng gây triệu chứng tiêu chảy [64] Cả hai loại độc tố ST và LT đều bền vữngở nhiệt độ âm, thậm chí cả ở nhiệt độ âm 200C.

Cơ chế tác động gây tiêu chảy của LT: tiểu phần B của phân tử LT gắn lên cácthụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng tế bào biểu mô nhung mao ruột non, đoạn A1 đợc

vận chuyển vào màng tế bào Tại đây đoạn A1 tơng tác với hệ thống enzymadenylate cyclase Enzym này có ít nhất ba thành phần: phần thứ nhất đảm bảo chứcnăng chuyển ATP thành cAMP, phần thứ hai thực hiện chức năng enzym điều khiểnGTP, phần thứ ba là thụ thể cho hormone Trong điều kiện bình thờng hệ thống trênhoạt động khi hormone gắn lên các thụ thể của hệ thống này, do vậy GTP đ ợc nốivới điểm hoạt động của protein điều khiển adenylate cyclase, làm thành tổ hợp GTPvà protein điều khiển Khi GTP chuyển thành GDP bởi enzym GDP-ase, hệ thốngnày ở trạng thái không hoạt động Đoạn A1 của LT là một adenylase diphosphatetranferase, chuyển ADP ribosom từ nicotinamide dinucleotile (NDA) đến proteinđiều khiển ADP-ribosom vừa đợc chuyển đến ức chế GTP-ase dẫn đến mất chứcnăng kiểm soát hệ thống trên Hiện tợng trên làm cho hệ thống adenylate cyclase th-ờng xuyên hoạt động, gây tăng cAMP hơn mức bình thờng dẫn đến bài xuất các ionNa+, Cl+ và nớc từ tế bào vào xoang ruột gây hiện tợng tiêu chảy [64]

- Nhóm độc tố tế bào (Shiga /Verotoxin)

Năm 1977, Konowalchuck và cs [50] đã phát hiện một loại độc tố hoạt độngtrong môi trờng nuôi cấy tế bào Vero (do đó đợc đặt tên là độc tố tế bào Vero), đợc

sinh ra bởi E coli gây bệnh tiêu chảy ở ngời, tiêu chảy và bệnh phù đầu ở lợn con.

Tác động gây bệnh ở tế bào của độc tố Vero rất khác so với tác động của độc tố đờng

ruột không chịu nhiệt cổ điển thuộc nhóm E coli gây bệnh đờng ruột (ETEC) Cũngtrong năm đó, Konowalchuck và cs tìm thấy một số chủng E coli, bao gồm cả chủng

H30 ở ngời, có độc tố tế bào trong môi trờng nuôi cấy tế bào Hela Độc tố tế bào nàyđợc trung hòa bởi kháng thể đặc hiệu cho độc tố Shiga (Stx) của vi khuẩn gây bệnhlỵ, do đó nó còn đợc gọi là độc tố giống nh Shiga (SLT).

Sự phát hiện của các nhóm nghiên cứu khác nhau về các loại độc tố tế bào nàyđã đa ra nhiều thuật ngữ tơng đồng Thuật ngữ độc tố Vero (VTs) hay độc tố giốngnh Shiga (SLTs) đợc sử dụng trong nhiều năm bởi các nhà nghiên cứu ở Canada và

Anh, nhng nhóm nghiên cứu ở Mỹ lại thờng dùng thuật ngữ E coli sản sinh độc tốVero (VTEC) hay vi khuẩn E coli sản sinh độc tố giống nh Shiga, mặc dù chúng là

những từ để chỉ một khái niệm nh nhau

Stx đợc sản sinh bởi E coli bao gồm 2 nhóm: Stx1 là nhóm độc tố giống nh

Stx của vi khuẩn gây bệnh lỵ và Stx2 là nhóm độc tố có liên hệ với Stx Loại Stx1

đ-ợc sản sinh từ chủng E coli H19, H30, và 933 [31], [41] Các loại độc tố khác nhau

trong nhóm Stx1 chỉ khác nhau ở một axit amin và không gây khác biệt ở tính độc tố

hay tính kháng nguyên Stx2 đợc sản sinh bởi E coli chủng 933 và E32511 [41],[51] Độc tố Stx2e đợc sản sinh bởi E coli chủng E57, S1191 và 412, độc tố này xuất

hiện ở bệnh phù đầu của lợn sau cai sữa [51] Các loại độc tố khác của Stx2 cũng đợc

mô tả bởi Konowalchuck và cs [50] khi phát hiện ở chủng E coli H.I.8 trên ngời Nó có

mối liên hệ gần với Stx2e hơn Stx2 và đợc đặt tên là Stx2ev sau loại gây bệnh phù đầu(Stx2va), hay (Stx2vh) sau loại gây bệnh ở ngời.

Stx có cấu trúc đơn vị nhỏ A-B bao gồm một đơn vị A có kích thớc khoảng 33KDa và 5 đơn vị B, mỗi đơn vị có kích thớc 7,5 KDa Đơn vị A là phần hoạt hóa củađộc tố, còn các đơn vị B gắn kết độc tố với thụ thể ở màng tế bào Sự chuyên hóa củathụ thể dựa trên một vài axit amin ở đơn vị B [50].

- Độc tố Stx2e (Vt2e)

Độc tố Shiga ở lợn là một loại trong nhóm độc tố Stx2 với một số khác biệttrong đặc tính sinh học Stx1 và Stx2 gây độc cho các tế bào Hela Stx2e kém độchơn so với các loại độc tố Stx2 khác Stx2e độc hơn đối với tế bào Vero, từ 10-100lần so với tế bào Hela Các quan sát này có liên quan tới lợng thụ thể chuyên biệt cómặt trên các loại tế bào [50].

Stx2e đợc mô tả là độc tố trong nhóm đồng hợp và với rất ít ngoại lệ là đặchiệu trên lợn [55] Ngoài Stx2e, các độc tố Stx khác (Stx1, Stx2) hiếm khi đợc phát

hiện ở các chủng E coli gây bệnh phù đầu [41].

Stx2e đóng vai trò quan trọng trong nguyên nhân gây bệnh và sự xuất hiện

các triệu chứng của bệnh phù đầu Sau khi tụ đám và phát triển ở ruột, E coli sinh

độc tố Shiga (STEC) sản sinh ra Stx2e, độc tố này đi qua tế bào biểu mô ruột vàomáu Từ đó Stx2e gắn kết với các thụ thể có mặt ở các tế bào màng trong của độngmạch, các tiểu động mạch ở các mô và cơ quan khác nhau gây ra các tổn thơng vi thể.Đó cũng là cơ sở của những tổn thơng đại thể và triệu chứng lâm sàng Triệu chứng

cũng có thể thấy khi tiêm tĩnh mạch độc tố Stx2e tinh lọc [41] E coli sinh độc tố

Shiga (STEC) cũng gây ra bệnh tiêu chảy cho lợn sau cai sữa, nhng Stx2e không cóvai trò trong việc xuất hiện tiêu chảy, đó là do các độc tố đờng ruột cổ điển(STEC/ETEC) [31].

1.4.1 Bệnh tiêu chảy do E coli ở lợn

Bệnh tiêu chảy ở lợn con đã trở thành một bệnh gây thiệt hại lớn về mặt kinh tế.Nó có thể chia làm ba loại bệnh viêm ruột chính nh: tiêu chảy ở lợn sơ sinh (một vàingày đầu sau khi sinh), tiêu chảy ở lợn con theo mẹ (từ tuần đầu cho đến lúc cai sữa) vàtiêu chảy ở lợn sau cai sữa Có nhiều nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy ở lợn con bao

gồm: virut gây viêm dạ dày ruột (Transmissible gastroenteritis virut-TGE),Rotavirut, Coccidia Trong đó, E coli là nguyên nhân quan trọng nhất trong bệnhtiêu chảy của lợn mới sinh và sau cai sữa [2], [6] E coli gây bệnh thờng có khả năngsản sinh một hay nhiều yếu tố gây bệnh, ở những chủng E coli không gây bệnh

không tìm thấy những yếu tố này

1.4.1.1 Mầm bệnh

Tiêu chảy ở lợn con do E coli thờng thấy ở lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi Các

chủng gây bệnh đều sản sinh độc tố đờng ruột nên đợc gọi là ETEC (Enterotoxigenic

E coli) ETEC bám vào màng nhày ruột non của lợn con bằng một hay nhiều kháng

nguyên bám dính F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) hoặc F41 Chúng phát triển ở tế bàobiểu mô ruột non và sản xuất một hay nhiều loại độc tố đờng ruột: STa (ST1), STb(ST2) hoặc LT Nhiều tác giả cho rằng hầu hết các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy ởlợn con thuộc nhóm O149, O8, O147, O157 và sản sinh độc tố LT và STb [27], [40].Ngoài ra, còn có các chủng ETEC thuộc các nhóm O8, O9, O64, O101 ngày càngtăng lên Các chủng này có F5, F6hoặc F41 và chủ yếu sản sinh độc tố STa, ít thấysản sinh STb Những chủng ETEC này gây bệnh chủ yếu ở lợn từ sơ sinh đến 6 ngàytuổi, ít thấy ở lợn lớn hơn Trái lại ETEC có F4thờng phân lập đợc ở lợn từ sơ sinhđến cai sữa.

1.4.1.2 Dịch tễ học

Sự xuất hiện của bệnh tiêu chảy do E coli phụ thuộc vào sự tơng tác giữa vi

khuẩn gây bệnh với điều kiện môi trờng và các yếu tố từ bản thân vật chủ Chỉ có

E coli mang các yếu tố gây bệnh tăng sinh với số lợng lớn thì mới gây tiêu chảy.

Lợn con khi mới sinh, trớc khi bú mẹ đã tiếp xúc với môi trờng bị ô nhiễm nặng ởchuồng đẻ, da của lợn mẹ và hệ vi sinh vật trong phân lợn mẹ Do vậy, trong điềukiện vệ sinh kém hay trong chuồng đẻ dùng liên tục không có thời gian sát trùng và

để trống chuồng thì sự lây nhiễm E coli gây bệnh ở môi trờng cao, khả năng bộinhiễm cao dẫn đến xuất hiện dịch tiêu chảy do E coli ở lợn con Sữa đầu có chứakháng thể đặc hiệu IgA có thể ngăn ngừa sự bám dính của E coli trong đờng ruộtcủa lợn con Nếu lợn mẹ không tiếp xúc với E coli gây bệnh trong môi trờng,

kháng thể đặc hiệu không có trong sữa đầu, lợn con sẽ rất mẫn cảm với mầm bệnh[11], [21].

Triệu chứng tiêu chảy ở lợn con có thể quan sát thấy đầu tiên lúc 2 - 3 giờ saukhi sinh và có thể thấy ở một vài lợn con hay toàn ổ Lợn con của những lợn nái hậubị thờng có tỷ lệ nhiễm bệnh tiêu chảy cao hơn so với những lợn con của lợn nái đẻ ởnhững lứa sau Phần lớn lợn con trong chuồng đều bị nhiễm bệnh và tỷ lệ chết rất caotrong vài ngày đầu sau khi sinh Tiêu chảy có thể ở mức độ nhẹ, lợn không có biểu

hiện mất nớc hoặc tiêu chảy nặng với phân toàn nớc Phân lợn có màu khác nhau từtrắng sang nâu, phân có thể chảy tự do từ hậu môn xuống sàn và chỉ phát hiện thấykhi quan sát gần Trong những ổ dịch nặng, một số lợn có thể nôn Khối lợng cơ thểbị giảm sút 30 - 40% do mất nớc Cơ bụng hóp lại, lợn gầy, suy kiệt và xiêu vẹo, mắttrũng sâu, da tái xám và nhợt nhạt Sự mất nớc và giảm khối lợng cơ thể làm cho lợnbị suy sụp nhanh, những lợn con này thờng chết Trong trờng hợp mãn tính hay bệnhít nghiêm trọng, da quanh hậu môn và vùng háng có thể đỏ lên do tiếp xúc với phânkiềm tính, lợn ít bị mất nớc và nếu đợc điều trị tích cực có thể khỏi bệnh

1.4.1.4 Phòng bệnh

Phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con nên tập trung vào việc giảm số mầm bệnh

E coli trong môi trờng bằng vệ sinh tốt, duy trì các điều kiện môi trờng thích hợp và

tạo miễn dịch ổn định

Một điều quan trọng là lợn đợc nuôi trong môi trờng có nhiệt độ ổn định ở 32- 340C đối với lợn con theo mẹ, 30 - 320C đối với lợn con cai sữa, lợn con đợc nuôitrong môi trờng thông thoáng, không có rác bẩn, nền chuồng có độ dẫn nhiệt thấp.Lợn nái nên nuôi ở môi trờng 220C, vì vậy trong chuồng lợn đẻ cần có ổ có nhiệt độcao hơn cho lợn con [11].

Độ ẩm trong chuồng nuôi cũng ảnh hởng không nhỏ tới bệnh tiêu chảy ở lợncon Độ ẩm càng cao thì lợn con mắc tiêu chảy càng nhiều Độ ẩm thích hợp cho lợncon đợc khuyến cáo là 70 - 85% [21].

Thiết kế chuồng đẻ cũng rất quan trọng vì nó ảnh hởng đến vị trí thải phâncủa lợn nái Khi chuồng quá dài, phân rải rác trong diện tích chuồng do đó làm tăngkhả năng ô nhiễm Tốt nhất là dùng cũi đẻ có thể điều chỉnh đợc, ngắn cho lợn cáihậu bị, dài hơn cho lợn nái Chuồng đẻ thờng cao trên mặt đất, nền chuồng bằng sànnhựa để hổng có lỗ cho phân rơi xuống Nuôi trong những ổ đẻ nh vậy lợn con ít tiêuchảy hơn những ổ đẻ có nền chuồng bằng xi măng Chuồng đẻ nên đợc rửa sạch vàsát trùng giữa các lứa đẻ Một hệ thống chuồng đẻ cùng vào cùng ra và đợc sát trùng

toàn bộ chuồng đẻ giữa các đợt sẽ làm giảm mật độ của E coli ở môi trờng [22]

Khẩu phần ăn cho lợn có thể đợc điều chỉnh để làm giảm sự phát triển của

E coli trong ruột [66]

- Phòng bệnh bằng miễn dịch

Khả năng miễn dịch chống bệnh tiêu chảy ở lợn con trớc tiên đợc cung cấpthông qua sữa đầu của con mẹ, sau đó là sự đáp ứng miễn dịch tại ruột non Nhữngkháng thể đặc hiệu trong sữa đầu hoặc ở niêm mạc ruột ngăn cản sự bám dính của vikhuẩn vào các thụ thể trên tế bào biểu mô ruột non và trung hòa hoạt động của độc

tố đờng ruột, độc tố tế bào của E coli Sữa đầu của lợn nái có chứa hàm lợng kháng

thể IgG cao và nó giảm rất nhanh trong quá trình tiết sữa, sau đó IgA trở thành

globulin miễn dịch chính [1] IgA bảo vệ ruột chống lại sự xâm nhập của E coli.

Hầu hết IgA, IgM và IgG trong sữa của lợn nái đợc sản xuất trong tuyến vú Lợn conmới sinh bắt đầu tổng hợp kháng thể đặc hiệu và phát triển hệ miễn dịch ở ruột nontrong tuần đầu tiên sau khi sinh [1], [30] Trớc hết IgM thịnh hành ở 2 - 3 tuần đầu,sau đó nó đợc thay thế bởi IgA, đây là một kháng thể quan trọng nhất ở trong ruộtnon Do vậy, trong tuần đầu tiên sau khi sinh thì sữa đầu là nguồn miễn dịch bảo vệchính cho lợn con [1].

1.4.1.5 Điều trị

Điều trị bệnh tiêu chảy do E coli ở lợn con cần đợc tập trung vào việc loại bỏ

các yếu tố gây bệnh, khắc phục những ảnh hởng độc hại của chúng, bổ sung nớc vàđiện giải đã mất và tạo môi trờng sống tối u cho lợn Các liệu pháp điều trị càng ápdụng nhanh, đồng bộ càng có hiệu quả Để loại bỏ nguyên nhân gây bệnh, trớc tiêncần sử dụng thuốc kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng để điều trị, đến khi biết đợc

kết quả của kháng sinh đồ thì dùng thuốc có độ mẫn cảm mạnh với E coli để điều

1.4.2 Bệnh phù đầu do E coli gây ra ở lợn

1.4.2.1 Mầm bệnh

Bệnh phù đầu (Edema Disease) là bệnh gây ra bởi E coli mang yếu tố bám

dính F18, F6, độc tố vero và khả năng dung huyết Chúng sản xuất verotoxin đi vàomáu và làm tổn thơng thành mạch Các khái niệm bệnh phù đầu, phù thũng, phù ruộtđợc coi là một bệnh, bởi vì phù ở lớp dới màng nhầy của dạ dày và ở giữa ruột kếtđều là những đặc điểm nổi bật của bệnh.

Bệnh phù đầu do các chủng E coli gây ra hầu hết thuộc một số serotype rất

hạn chế trong một vùng nào đó, những serotype này thờng gắn với một số yếu tố bámdính và độc tố ổn định Serotype O139 đợc tìm thấy trên khắp thế giới và có F18ab.Những chủng thuộc serotype này ở úc lại thờng gây bệnh tiêu chảy ở lợn sau cai sữa.Trái lại, những chủng của nhóm này ở châu Âu thì thờng gây bệnh phù đầu [139].Loại F18 (trớc kia gọi là F107, 2134P, 8813, Av24) và F4 (K88) đợc phát hiện với tỷlệ tơng ứng là 44% và 36% trong các chủng sản sinh độc tố Trong khoảng 24% các

chủng có F4 không phát hiện thấy các gen mã hóa cho những loại fimbriae đã biếtkhác F6(987P) thờng có mặt cùng với F4 hoặc F18[63].

1.4.2.2 Dịch tễ học

Nhóm tuổi bị nhiễm bệnh phù đầu phụ thuộc vào tuổi cai sữa Lợn con cha caisữa cũng có thể bị mắc phù đầu và mức độ trầm trọng phụ thuộc vào kháng thể trongsữa của lợn mẹ ở lợn trởng thành, phù đầu thờng là nguyên nhân của triệu chứngthần kinh và là nguyên nhân gây chết đáng kể [7] Tỷ lệ nhiễm bệnh trong các đànrất khác nhau, có thể lên tới 80%, nhng trung bình là 30 - 40% Với bệnh phù đầu, tỷlệ chết từ 50 đến trên 90% Thời gian bệnh kéo dài trong một đàn cũng khác nhau từ4 - 14 ngày, trung bình là dới 1 tuần Bệnh biến mất cũng đột ngột nh khi nó xuấthiện Sự tái diễn cũng có thể xảy ra tại chuồng đó [7].

Môi trờng ở chuồng cai sữa có thể là nguồn lây nhiễm các chủng E coli gây

bệnh phù đầu Lợn cha cai sữa có thể nhiễm trong chuồng đẻ và mang nó đến chuồngcai sữa Thờng xuyên rửa và sát trùng chuồng cũng cha đủ để cắt đứt chu kỳ lu truyền

mầm bệnh [13] Sự lan truyền của các chủng E coli gây bệnh có thể qua đờng không

khí, thức ăn, phơng tiện vận chuyển, qua lợn hoặc các dụng cụ chăn nuôi [14].

1.4.2.3 Cơ chế gây bệnh

Bớc đầu tiên của quá trình gây bệnh phù đầu ở lợn con sau cai sữa cũng giốngnh ở lợn con theo mẹ, đó là sự bám dính và phát triển trong ruột non, sản sinh độc tố.

Nhng để có đợc sự bám dính, E coli phải tập trung thành đám ở lớp màng nhầy của

riềm bàn chải Mức độ tập trung này quyết định liệu có gây ra bệnh hay không vàphụ thuộc vào nhiều nhân tố, không chỉ dựa vào khả năng sinh sản của vi khuẩn Vikhuẩn tập trung ở màng nhầy sẽ bám dính vào thụ thể nằm ở riềm bàn chải đặc thùcho từng loại kháng nguyên bám dính và không phải có ở tất cả các lợn Sau khi bámdính, vi khuẩn xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô rồi nhân lên, sản sinh độc tố đờng

ruột gây tiêu chảy Từ lớp tế bào biểu mô E coli xâm nhập vào hệ lâm ba, vào hệ

tuần hoàn gây dung huyết, theo máu đến các cơ quan nội tạng, phát triển nhân lênphá hủy tế bào tổ chức, sản sinh verotoxin, neurotoxin làm tăng tính thấm thànhmạch gây phù, tác động vào tế bào thần kinh gây các biểu hiện thần kinh [6].

1.4.2.4 Triệu chứng

Biểu hiện đầu tiên là biếng ăn, bệnh nặng trong một thời gian ngắn Triệu chứngthần kinh xuất hiện vào ngày thứ 6 sau khi mắc bệnh Sng mí mắt cũng xuất hiện vàothời điểm đó Liệt (mất chức năng điều khiển) kết hợp với rối loạn thần kinh thờng thấyrất rõ Những lợn bị bệnh thờng nằm nghiêng sang một bên Nhiệt độ cơ thể luôn tronggiới hạn bình thờng, ở một vài cá thể trớc khi chết thân nhiệt có thể hạ xuống dới mứcbình thờng [11], [27].

Bệnh phù đầu mãn tính cũng xuất hiện với tỷ lệ khác nhau (nhng thờng là thấp)từ những lợn mắc bệnh phù đầu cấp tính đã hồi phục Bệnh xảy ra sau vài ngàyđến vài tuần khi có viêm nhiễm ở ruột, sinh trởng của lợn ngừng lại, những lợnốm thờng có những triệu chứng bất thờng về thần kinh nh đi vòng tròn, ngoẹođầu hay liệt chân, phù dới da rất ít thấy, những lợn bị nhiễm bệnh thế này thờngbị chết [5].

1.4.2.5 Phòng bệnh

- Chọn những giống lợn có khả năng kháng bệnh

Đây là một biện pháp phòng bệnh hữu hiệu và kinh tế nhất trong tơng lai xa.Hiện tại, nếu lựa chọn những đàn giống theo hớng này vẫn cha khả thi bởi các côngcụ để xác định kiểu gen ở lợn khỏe vẫn cha phổ biến Phòng bệnh theo hớng này vẫnđang là thăm dò Tránh lựa chọn các tính trạng không mong muốn có liên quan gầnvới loại mã hóa cho thụ thể của F4 và F18.

- Hạn chế sự lây nhiễm

Đặc tính lây lan của bệnh phù đầu đã rõ ở Đan Mạch, hầu hết sự lây lancủa bệnh phù đầu đều theo đờng buôn bán, vận chuyển lợn Giảm mật độ lợn ởcác trại bị nhiễm bệnh và sát trùng toàn bộ chuồng nuôi, vệ sinh tiêu độc th ờngxuyên là biện pháp tốt làm cho chuồng nuôi giảm nguy cơ tiềm tàng mầm bệnh,

nhng cần chú ý E coli có khả năng tồn tại rất lâu trong môi trờng [14].- Các liệu pháp miễn dịch

Miễn dịch của cơ thể là sự bảo vệ tốt nhất chống lại sự bám dính và các tácđộng của độc tố Lợn cai sữa có thể đợc bảo vệ nhờ miễn dịch chủ động hay bị động.+ Miễn dịch bị động

Cho lợn cai sữa ăn hàng ngày 525 ml sữa của lợn nái trong giai đoạn cuối củathời kỳ tiết sữa sẽ ngăn đợc sự bám dính của vi khuẩn, trong khi nếu cho lợn ăn mộtlợng tơng tự sữa bò thì số lợng vi khuẩn ETEC sẽ tăng cao Cho lợn ăn bột máu lợnsấy khô với liều 90g cho một lợn một ngày có tác dụng ngăn cản sự bám dính, tác độngnày chỉ kéo dài trong thời gian cho ăn bột máu [60] Tác động ngăn cản sự bám dínhcũng đợc cải thiện nếu dùng vacxin cho lợn mẹ [47] Miễn dịch chống lại sự bám

dính của E coli có F4 và F18 cũng có thể có đợc bằng cách cho lợn ăn bột lòng đỏ

trứng gà đã đợc tiêm phòng vacxin [47].+ Miễn dịch chủ động

Miễn dịch chủ động chống lại sự gây bệnh bằng độc tố SLT-2e (Shiga liketoxin- 2e) đã đạt đợc ở những lợn con tiêm phòng vacxin giải độc tố Vacxin này đ -ợc sản xuất từ độc tố SLT-2e đã qua xử lý bằng glucotaldehyde [15], [56] Vacxingiải độc tố tơng tự cũng đã đợc sử dụng cho lợn trớc khi cai sữa 1 tuần tuổi Vacxin

cũng có tác dụng bảo hộ đáng kể chống lại phù đầu khi lợn bị gây nhiễm bằngchủng ETEC thuộc nhóm O139:K12 Tuy nhiên, hiệu quả của các vacxin này ch acao, sự đáp ứng miễn dịch của lợn con với các loại vacxin này không cao [15].

- Liệu pháp hóa học

Hiện tại, phòng bệnh bằng trộn thuốc vào thức ăn là liệu pháp chính đối vớinhững cơ sở bị lây nhiễm ở hầu hết các nớc trên thế giới, mặc dù có rất nhiều phản đốitừ ngời tiêu dùng, nó có thể làm suy giảm miễn dịch và gây ra kháng thuốc Các chủng

E coli phân lập từ bệnh phù đầu có tỷ lệ kháng thuốc cao nhất trong các chủng gây

bệnh ở lợn Thức ăn có chứa 2.400 - 3.000 ppm kẽm làm giảm tiêu chảy, giảm tỷlệ chết và cải thiện sự tăng trởng của lợn [43].

- Liệu pháp điều chỉnh khẩu phần ăn

Hạn chế lợng thức ăn sử dụng, tăng khẩu phần có hàm lợng chất xơ caohoặc cho ăn tự do chất xơ đã đợc coi là phơng pháp hiệu quả hạn chế xuất hiệnbệnh phù đầu [43] Để phòng bệnh, giá trị dinh d ỡng của thức ăn có thể đợc giảmbớt nhờ tăng hàm lợng chất xơ lên 15- 20%, giảm protein thô và năng l ợng tiêuhóa còn một nửa giá trị trong khẩu phần bình thờng, cung cấp mức dinh dỡng thấpchỉ đủ để duy trì tăng trọng hàng ngày nhỏ hơn 1% khối l ợng cơ thể trong 2 tuầnsau cai sữa Những khẩu phần nh vậy ngăn cản sự tụ bám của vi khuẩn và ngăn

cản sự phát triển của E coli [55] Ngoài việc hạn chế cho ăn thức ăn giàu đạm,

sinh năng lợng cao, có thể kết hợp cho ăn thêm một số sản phẩm có chứa men tiêuhóa để hạn chế phát triển các loại vi khuẩn gây bệnh.

1.4.2.6 Điều trị

- Liệu pháp hỗ trợ chống mất nớc và điện giải

Lợn sau cai sữa mắc bệnh phù đầu nếu kết hợp với tiêu chảy thì việc cung cấpdung dịch điện giải rất quan trọng Dung dịch chống mất nớc phải đợc cho uống liêntục hoặc tiêm thẳng vào khoang bụng nếu lợn bỏ ăn và mất nớc Dung dịch này cầnchứa glucose, glycerin, axit citric và dung dịch muối phot phat Lợng dịch tiếp bùđắp bằng với lợng mất đi, có thể tới 25% khối lợng cơ thể [21], [27].

- Liệu pháp kháng sinh

Liệu pháp dùng thuốc kháng sinh để kiểm soát sự nhân lên của vi khuẩn cóhiệu quả hơn ở bệnh tiêu chảy sau cai sữa so với bệnh phù đầu, bởi vì ở bệnh phù đầuđộc tố đợc sản sinh ở ruột gần nh cao nhất khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng.Việc xuất hiện sự kháng thuốc của vi khuẩn cho tới nay là không tránh khỏi Khôngthể đa ra con số đồng nhất về sự kháng thuốc bởi vì nó rất khác nhau ở những đànlợn khác nhau và phụ thuộc vào loại thuốc nào hay đợc sử dụng Thuốc phải đợc

chọn lọc và đa vào tới khoang ruột Làm kháng sinh đồ để chọn thuốc kháng sinhmẫn cảm dùng điều trị là tốt nhất.

Điều trị không có nhiều kết quả khi lợn xuất hiện có các triệu chứng nh phùnặng dới da, thở khó, không còn khả năng đứng lên đợc Rất nhiều phơng pháp điềutrị đã đợc đa ra trong thời gian qua, nhng việc điều trị bệnh hiện nay ở các trại chănnuôi tập trung còn gặp nhiều khó khăn.

1.5 Kháng thể

1.5.1 Khái niệm

- Kháng thể (tiếng Anh: antibody): là các phân tử immunoglobulin (có bản

chất glycoprotein), do các tế bào lympho B cũng nh các tơng bào (biệt hóa từ lymphoB) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vikhuẩn hoặc virut Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một epitop kháng nguyên duynhất [30].

Trớc đây, việc sản xuất kháng thể đơn dòng in vitro rất khó khăn do đời sốngngắn ngủi của các tơng bào Kháng thể chỉ thu đợc in vivo bằng cách tiêm một kháng

nguyên cụ thể vào một động vật rồi chiết lấy kháng thể trong máu Phơng pháp nàyrất tốn kém nhng chỉ thu đợc lợng kháng thể rất ít, không thuần nhất và bị ô nhiễm[30], [36].

+ Kháng thể đa dòng: là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitop khác

nhau trên một kháng nguyên cho trớc Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợpnhiều kháng thể tơng ứng với các epitop của cùng một kháng nguyên: đáp ứng nhvậy gọi là đa dòng.

1.5.2 Đặc tính và ứng dụng

Kháng thể là một protein sinh học đặc thù, có cấu tạo phức tạp và có tác dụngđặc hiệu, do động vật cấp cao sản sinh ra Nó là “chất miễn dịch” giúp cho cơ thểkhông mắc bệnh đối với tác nhân gây ra nó (kháng nguyên) Đối với động vật máunóng, khoa học đã nghiên cứu về kháng thể từ rất lâu cùng với hỗ trợ của các tiến bộsinh học phân tử, tuy nhiên vẫn còn nhiều câu hỏi cha giải đáp đợc Các nghiên cứu

tập trung nhiều vào y học, thú y và đã có những thành tựu rực rỡ trong phòng bệnh vàchữa bệnh cho ngời và gia súc [22].

Cơ thể động vật chỉ sinh ra kháng thể khi đợc tiếp xúc với kháng nguyên, màcác kháng nguyên ta đang quan tâm ở đây là các mầm bệnh nh vi khuẩn, virut gâybệnh cho gia súc Nếu cha từng tiếp xúc với kháng nguyên thì cơ thể không sản sinhkháng thể, nghĩa là động vật cha có miễn dịch và có thể bị mầm bệnh tấn công.Muốn phòng đợc bệnh, cơ thể cần có kháng thể, dựa trên cơ sở đó, khoa học đã dùngkháng thể để phòng bệnh và chữa bệnh [30] Kháng thể thờng lấy từ máu động vật đãđợc miễn dịch với kháng nguyên (mầm bệnh, vi khuẩn, virut, ) theo mục đích đãđịnh Kháng thể hòa tan trong phần dịch thể của máu động vật (trong huyết thanh).Ngời ta đã chế đợc huyết thanh có chứa kháng thể (kháng huyết thanh) Trong thú y,ngời ta đã chế tạo kháng huyết thanh chống bệnh tụ huyết trùng, bệnh đóng dấu lợn,bệnh dịch tả trâu bò, bệnh dịch tả lợn đợc dùng để chữa bệnh và phòng bệnh rấttốt [30] Tính u việt của kháng thể so với chất kháng sinh là:

+ Kháng thể chống đợc virut, chống đợc cả độc tố (chất kháng sinh không làm ợc).

đ-+ Kháng thể thụ động có tác dụng kéo dài tới 2 tuần lễ (chất kháng sinh chỉ có tácdụng từ 6 -24 giờ).

+ Kháng thể tác động đặc hiệu mầm bệnh, không tác động tràn lan ngoài ý muốn.+ Kháng thể không gây “kháng thuốc” nên không gây hậu quả cho sinh thái môi

trờng

+ Kháng thể cung cấp miễn dịch nhanh chóng trong vài giờ, đợc dùng phòng bệnhkhẩn cấp khi cần qua lại vùng đang có dịch, điều trị bệnh cấp tính có hiệu quảtức thì.

+ Kháng thể ngoài tác dụng phòng trị bệnh đặc hiệu, nó còn có tác dụng nh mộtprotein liệu pháp, giúp con vật sau khi sử dụng tăng trởng tốt hơn.

Rõ ràng kháng thể có tính u việt nổi trội về nhiều mặt trong phòng và chữabệnh, đặc biệt với các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho gia súc và cả con ngời Tuynhiên chế tạo kháng thể vô cùng phức tạp, có giá thành cao, khó ứng dụng mở rộngđợc vì lý do kinh tế.

Những năm cuối tập kỷ 60 của thế kỷ 20, khoa học đã chú ý tới một vấn đềhấp dẫn về kháng thể đó là: gà là động vật có đáp ứng miễn dịch với nhiều loạikháng nguyên, với nhiều loại mầm bệnh khác nhau, nghĩa là gà có thể sản sinhkháng thể ở trong máu để chống lại các mầm bệnh đó Tuy nhiên, ta không thể có đủlợng máu gà miễn dịch này để phục vụ sản xuất kháng thể, nhng có một điều thú vịlà kháng thể trong huyết thanh gà lại đợc truyền và tích lũy ở trong lòng đỏ trứng gà

[36], [42], chính các kháng thể này bảo vệ cho gà con nở ra tránh đợc các bệnh tật.Vậy ta có thể sản xuất kháng thể từ lòng đỏ trứng gà không? Các thí nghiệm đãchứng minh: trứng của gà đợc miễn dịch có chứa kháng thể chống lại các vi khuẩn,virut, độc tố mà ngời ta đã tiêm để gây miễn dịch cho gà Kháng thể trong lòng đỏcũng kết hợp đặc hiệu với các mầm bệnh tơng ứng [42], [45] Thời cổ xa, con ngờicũng đã biết dùng lòng đỏ trứng gà để chống các bệnh do vi khuẩn, virut ở đờngruột, xoang miệng và dùng ngoài da, đó chính là ứng dụng phơng pháp miễn dịch thuđộng.

Lòng đỏ trứng gà có thành phần: 48% là nớc, 17,8% protein và 30,5% lipid.Hầu hết (mỡ) lipid trong lòng đỏ trứng đợc kết hợp với protein (lipoprotein) hơn là ởdạng lipid tự do Protein trong lòng đỏ trứng cũng có dạng không kết hợp với lipid,mà ở dạng protein hòa tan đợc trong nớc Kháng thể trong lòng đỏ trứng là loạiprotein hòa tan trong nớc và cùng với lipoprotein tạo thành dạng nhũ dịch trong lòngđỏ [45] Ngày nay, ngời ta đã chứng minh và có nhiều bằng sáng chế về sản xuấtkháng thể trong lòng đỏ trứng, cho đến nay ngời ta đã đợc xác định đợc bản chất củakháng thể đó là IgY do các tài liệu khác còn gọi là: IgG gà (chicken IgG), IgG lòngđỏ trứng (Egg yolk IgG), hoặc 7S IgG.

IgY - globulin miễn dịch có trong lòng đỏ trứng có thể có hàm lợng khoảng từ5 đến 20 mg/trong 1 ml Hàng loạt kháng nguyên đã đợc dùng để sản xuất kháng thể

IgY và cho kết quả tốt nh với Newcastle, E coli, liên cầu khuẩn, nọc rắn v.v

IGY có khối lợng phân tử khoảng 180 kDa, mỗi chuỗi nhẹ khoảng 25 kDa,mỗi chuỗi nặng khoảng 65 - 68 kDa Điểm đẳng điện 5,7 - 7,6 (6,6  0,9) Gà máicó thể sinh ra các kháng thể nhận biết nhiều epitop khác nhau hơn so với các khángthể do động vật có vú sinh ra [45].

IgY có chức năng tơng tự nh kháng thể của thỏ và động vật có vú khác, do đónó có giá trị kinh tế hơn đợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực (đặc biệt với việc sảnxuất các kháng thể đơn dòng) 12 quả trứng gà chứa khoảng 1 gam kháng thể IgY, t-ơng đơng tổng số kháng thể IgG có trong 100ml huyết thanh, vì vậy 1 con gà mái cóthể thay thế 12 con thỏ dùng sản xuất kháng thể trong 1 năm Mỗi gà mái, một thángcó thể sản xuất 2,5 g IgY Kháng thể đặc hiệu có thể chiếm từ 0,5 đến 10% tổng sốIgY tùy theo việc sử dụng kháng nguyên miễn dịch [36].

2.1.2 Động vật thí nghiệm

Chuột bạch: 18 - 20 gam, khỏe mạnh; chuột lang trởng thành; thỏ: 2,5-3,0 kg,khỏe mạnh, không mắc bệnh ngoài da; gà đẻ giống siêu trứng (Hyline, Leghorn):trung bình 2,5-3 kg/con

2.1.3 Các loại hóa chất, môi trờng, kháng huyết thanh2.1.3.1 Các loại môi trờng

Bao gồm: thạch máu, thạch Mac Conkey, NB (nutrient broth), NA (nutrientagar), môi trờng BHI, môi trờng do hãng Oxoid (Anh) sản xuất.

2.1.3.2 Các loại hóa chất

Các loại đờng: lactose, sucrose, dulcitol, salicin, sorbitol, arabinose, raffnose,mannitol, rhamnose, xylose, maltose, trehalose.

Thuốc nhuộm Gram, dung dịch PBS, dung dịch Kowacs, dung dịch Andraderdo hãng Oxoid sản xuất.

2.1.3.3 Các loại huyết thanh chuẩn để định type E coli

Kháng huyết thanh chuẩn xác định nhóm huyết thanh (serogroup) và kiểu huyết

thanh (serotype) của E coli (Nhật Bản).

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ

Máy móc, thiết bị: máy ly tâm (Eppendorf), máy lắc (Nhật), cân vi lợng(Sartorius, Đức), lò vi sóng, máy Vortex, nồi lên men (Trung Quốc), máy đo pH(Mỹ), máy đo OD, v.v

Dụng cụ: pipetman (Eppendorf), đầu côn 1000l, 200l (Greiner Bio-one),ống ly tâm kích cỡ 15ml, 50ml, phiến kính, bình tam giác thủy tinh các cỡ, v.v Cácdụng cụ phải đợc sấy hoặc hấp vô trùng.

2.2.2 Phân lập, giám định và xác định các yếu tố gây bệnh của E coli2.2.2.1 Phơng pháp phân lập và giám định E.coli

Quy trình phân lập và giám định E coli đợc trình bày theo sơ đồ 1.

Cấy 0,2 ml huyễn dịch phân, bệnh phẩm ở độ pha loãng 10-5 trên thạch Istrati Saukhi cấy và bồi dỡng ở 370C trong 24 giờ đếm khuẩn lạc Chọn khuẩn lạc có dạng S,có màu vàng đặc trng trên môi trờng thạch Istrati cấy sang môi trờng Mac Conkey vàmôi trờng Brilliant green agar bồi dỡng ở 370C trong 24 giờ lấy ra quan sát tính chấtmọc, màu sắc khuẩn lạc, độ tinh khiết Nếu thuần khiết, cấy giữ giống trên thạchmáu để tiến hành kiểm tra hình thái và giám định các tiêu chuẩn khác.

Sơ đồ 1: Phân lập và giám định E coli từ phân và bệnh phẩm

2.2.2.2 Giám định một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng E coli phânlập đợc bằng phơng pháp thờng quy

Từ các giống E coli phân lập đã đợc thuần khiết, tiến hành giám định một số

đặc tính sinh vật hóa học cơ bản nh đặc tính hình thái, tính chất nuôi cấy và các phảnứng lên men đờng.

- Kiểm tra hình thái học: từ giống phân lập giữ trên thạch máu cấy chuyển ra nớc thịthoặc thạch nghiêng, làm tiêu bản nhuộm Gram để kiểm tra.

- Kiểm tra khả năng di động: cấy chích sâu vi khuẩn vào thạch mềm hoặc xem diđộng của vi khuẩn trực tiếp trên kính hiển vi bằng tiêu bản giọt treo.

Phân hoặc bệnh phẩm lợn bị tiêu chảy, phù đầu

Brilliant green agar(Khuẩn lạc màu vàng chanh)

(Khuẩn lạc thuần khiết dạng S, màu vàng)

Mac Conkey

(Khuẩn lạc màu đỏ cánh sen)

Khuẩn lạc thuần khiết

Giữ trên thạch máu

Tính chất sinh học

Nhuộm Gram và kiểm tra hình thái Cấy trên các môi tr ờng sinh hóa

KIA, Mannitol, Ureindol, Simon Citratepha loãng 10-5

- Kiểm tra tính chất mọc bằng cách nuôi cấy trên các môi trờng: nớc thịt, thạch ờng, thạch máu, các môi trờng đặc biệt nh: Istrati, Mac Conkey, Brilliant green agar.Quan sát tính chất mọc, hình thái, kích thớc và màu sắc khuẩn lạc.

th Kiểm tra các đặc tính lên men đờng của E coli:

+ Trên môi trờng thạch nghiêng KIA (Kligler Iron Agar)

Kỹ thuật cấy: Dùng que cấy vô trùng chấm vào khuẩn lạc định kiểm tra, riamột đờng ở phần thạch nghiêng và cắm que cấy thẳng xuống phần thẳng đứng nhngkhông chạm vào đáy ống, bồi dỡng ở 370C trong 24 giờ Đọc kết quả (chậm nhất là48 giờ).

Môi trờng KIA cho phép đọc các tính chất:

Khả năng lên men đờng lactose: Vi khuẩn có khả năng lên men đờng lactoselàm cho phần thạch nghiêng chuyển sang màu vàng, ngợc lại thì giữ nguyên màu

Khả năng lên men đờng glucose: Vi khuẩn có khả năng lên men đờng glucosethì chuyển phần thạch đứng từ màu hồng sang màu vàng rõ, vi khuẩn không lên menđờng glucose thì giữ nguyên màu Nếu sinh hơi thì phần thạch đứng bị nứt hoặc tạothành bọt khí bên trong thạch đứng, có thể đẩy toàn bộ phần thạch lên cao, ở d ới làhơi.

+ Khả năng lên men các loại đờng khác

Trong môi trờng dinh dỡng Nutrient Broth đã bổ sung thêm 1,5 ml xanhBromothymol 1,5% trong cồn và các loại dung dịch đờng cần kiểm tra, cấy vi khuẩnvào, bồi dỡng trong tủ ấm 370C/24 giờ đọc kết quả Phản ứng dơng tính khi môi trờngchuyển màu hồng, âm tính khi môi trờng vẫn giữ nguyên màu sắc ban đầu

+ Phản ứng sinh Indol

Trong môi trờng dinh dỡng Nutrient Broth, cấy E coli cần kiểm tra, bồi dỡng

ở điều kiện nhiệt độ 43 - 470C/24 giờ, nhỏ thuốc thử Kowacs vào Phản ứng dơngtính khi một vòng tròn đỏ xuất hiện ở trên cùng ống môi trờng nuôi cấy Phản ứngâm tính khi vòng tròn đỏ không xuất hiện.

2.2.2.3 Xác định serotype của E coli bằng phản ứng ngng kết nhanh trên phiếnkính theo phơng pháp thờng quy

- Vật liệu dùng xác định:

+ Các chủng E coli đợc lu giữ trên thạch máu.

+ Kháng huyết thanh chuẩn (nhóm và đơn giá), nớc muối sinh lý 0,85%, phiến kínhsạch.

- E coli có nhiều serotype, vì vậy để xác định serotype E coli, tiến hành làm phản

ứng với kháng huyết thanh nhóm (serogroup), sau đó mới tiến hành xác địnhserotype với kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm kháng huyết thanh đã ngng kết.Cách tiến hành nh sau:

+ Trên một phiến kính sạch, ở hai đầu nhỏ hai giọt nớc sinh lý Dùng que cấy vô

trùng lấy khuẩn lạc E coli cần xác định serotype mọc trên thạch Mac Conkey

hoặc thạch máu hòa tan vào hai giọt nớc muối sinh lý ở hai đầu của phiến kính + Dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy kháng huyết thanh nhóm trộn đều

vào một bên huyễn dịch vi khuẩn, huyễn dịch vi khuẩn bên kia phiến kính khôngtrộn huyết thanh đa giá nhóm (đối chứng âm) Để yên từ 1-2 phút ở nhiệt độphòng, đọc kết quả phản ứng Phản ứng dơng tính khi trong giọt huyễn dịchkháng huyết thanh và vi khuẩn xuất hiện những hạt ngng kết lấm chấm, mức độngng kết đợc đánh giá theo thang bậc: +, ++, +++, ++++ Phản ứng âm tính khihuyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh vẫn đục đều không có hạt ngng kếtxuất hiện nh bên đối chứng âm.

+ Chọn những khuẩn lạc có ngng kết với kháng huyết thanh nhóm, tiến hành làmngng kết với từng kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm nh đã tiến hành vớinhóm Nhận xét kết quả nh đối với kháng huyết thanh nhóm Nếu một vi khuẩnngng kết chéo với nhiều nhóm, hoặc nhiều kháng huyết thanh đơn giá thì phảitiến hành pha loãng kháng huyết thanh thành các độ pha loãng khác nhau theo hệsố 2 (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, ), rồi làm phản ứng với từng độ pha loãng.

+ Serotype nào ngng kết ở hiệu giá pha loãng kháng huyết thanh cao nhất thì đó làserotype của vi khuẩn.

2.2.2.4 Xác định độc lực của E coli theo phơng pháp của Cater (1984) [64]

Mỗi chủng vi khuẩn đợc tiêm cho 2 chuột, liều 0,2 ml dịch nuôi cấy24giờ/370C vào phúc xoang Theo dõi số chuột chết và thời gian giết chết chuột củavi khuẩn trong 7 ngày Chuột chết đợc mổ kiểm tra bệnh tích và lấy máu tim, phủtạng nuôi cấy phân lập vi khuẩn

2.2.2.5 Xác định khả năng dung huyết của E coli bằng phản ứng gây dung huyếttrên thạch máu bê 10%

Giống E coli thuần khiết đợc ria cấy trên môi trờng thạch máu bê 10%, bồi

d-ỡng ở tủ ấm 370C trong 24 giờ.

Đánh giá kết quả:

+ Dung huyết hoàn toàn (-haemolysin): xung quanh khuẩn lạc có vòng tan máuto, rõ, có thể nhìn qua đợc môi trờng.

+ Dung huyết không hoàn toàn (-haemolysin): xung quanh khuẩn lạc có vòng tanmáu nhỏ, có ánh xanh.

+ Không dung huyết (-haemolysin): xung quanh khuẩn lạc không có vòng tanmáu.

2.2.2.6 Xác định các gen độc tố (LT, STa, STb và VT2e) bằng phơng pháp PCR

Hiện nay ngời ta dùng phơng pháp PCR để xác định các gen độc tố của E coli,

đây là phơng pháp u việt nhất về độ nhạy và tính chính xác của nó.

Enzym (Taq polymerase): 0,5 l

Nớc khử ion vừa đủ để đạt đợc thể tích cuối cùng là 25l cho 1 phản ứng.

+ Chu trình của một phản ứng PCR (Amplification): phản ứng PCR là một chuỗigồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bớc và đợc thực hiện trongmáy nhân gen tự động Perkin Elmer, theo bảng 1.

+ Chạy điện di: sản phẩm PCR thu đợc sau chu trình phản ứng đợc nhuộm với chấtnhuộm nhỏ mẫu (loading dye), đợc trộn vào mẫu theo tỷ lệ 1: 5 Sau khi nhuộm, sảnphẩm PCR đợc chạy điện di trên thạch agarose 1%, trong dung dịch đệm TAE (Tris- agartate - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút

+ Nhuộm: gel thạch sau khi chạy điện di đợc nhuộm màu bằng chất nhuộm màuhuỳnh quang Ethidium bromide (1l/ml) trong vòng 15 phút đọc kết quả.

Biến tính(0C/phút)

Biến tính(0C/phút)

Gắn mồi(0C/phút)

Tổng hợp(0C/phút)

Tổng hợp(0C/phút)ADN khuôn,

primer, Taqpolymerase,

dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh đợc và ghi nhận lại Kích thớc các băngADN đợc so sánh với ADN chuẩn (ADN marker).

2.2.3 Phơng pháp chế tạo kháng nguyên

Dùng các chủng E coli đã lựa chọn nuôi cấy trên các môi trờng dinh dỡng

riêng từng chủng ở 37oC/24 giờ, kiểm tra đậm độ vi khuẩn, kiểm tra thuần khiết, bấthoạt bằng nhiệt độ hoặc hóa chất, kiểm tra vô trùng, chia lọ để sử dụng.

2.2.4 Nghiên cứu qui trình miễn dịch để đạt hiệu giá kháng thể trong huyếtthanh gà cao nhất

Chúng tôi tiến hành thử nghiệm tiêm miễn dịch cho 3 đàn gà thí nghiệm, mỗiđàn theo một qui trình khác nhau, sau đó định kỳ hàng tuần kiểm tra hiệu giá khángthể trong máu gà để tìm ra qui trình hợp lý, cho hiệu giá kháng thể trong máu gà caonhất, ổn định nhất.

2.2.5 Phơng pháp định tính hàm lợng kháng thể trong sản phẩm bằng khả

năng bảo hộ của kháng thể chống lại E coli trên động vật thí nghiệm

Dùng chuột bạch thể trọng mỗi con 18 - 20g, khoẻ mạnh Chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: Mỗi con tiêm 0,4 ml kháng thể vào phúc xoang; sau 24 giờ tiêm lần haicùng liều.

+ Nhóm 2: Không tiêm, làm đối chứng.

Sau 48 giờ kể từ khi tiêm kháng thể lần hai, công cờng độc cho cả hai nhóm

chuột với liều tiêm dới da mỗi chuột 0,2 ml canh trùng 24 giờ của các chủng E coli.

Theo dõi chuột trong 7 ngày sau đánh giá kết quả

Tính hiệu số của số lợng chuột sống sót của nhóm 1 (nhóm đợc tiêm miễn

dịch bằng kháng thể) và số lợng chuột sống sót của nhóm 2 (nhóm đối chứng).

2.2.6 Phơng pháp định lợng hàm lợng kháng thể trong sản phẩm bằng phản

ứng ngng kết giữa kháng thể trong sản phẩm với kháng nguyên E coli tơng ứng

Có thể thực hiện phản ứng ngng kết nhanh trên phiến kính hay ngng kết chậmtrong ống nghiệm theo thờng qui.

Pha loãng kháng thể bằng nớc muối sinh lý theo các độ pha loãng khác nhau(theo cấp số 2)

Lấy một lợng kháng thể đã pha ở mỗi hiệu giá và một lợng kháng nguyên

E coli bằng nhau, trộn đều, để ở nhiệt độ khoảng 250C Nếu là ngng kết nhanh trênphiến kính thì đọc kết quả sau 3-5 phút, nếu là ngng kết chậm trong ống nghiệm thìđọc kết quả sau 6-12 giờ bằng mắt thờng

§èi chøng ©m lµm t¬ng tù bíc trªn nhng thay thÕ kh¸ng thÓ b»ng níc sinh lý.§èi chøng d¬ng lµm t¬ng tù bíc trªn nhng thay thÕ kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm b»ng

3.1.1 Thu thËp mÉu bÖnh phÈm lîn èm tiªu ch¶y vµ sng phï ®Çu

Các mẫu đợc thu thập ở 8 huyện của 5 tỉnh đại diện cho 3 miền Bắc Trung Nam, chúng tôi đã tiến hành thu thập đợc tổng số 340 mẫu bệnh phẩm ở lợn ốm có

-triệu chứng mắc bệnh sng phù đầu và tiêu chảy do E coli gây nên Các loại mẫu

bệnh phẩm chúng tôi thu thập là: phân, lợn nguyên con, tim, gan, ruột và hạch ruộtcủa lợn bệnh Kết quả cụ thể trong bảng 2.

Bảng 2: Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm lợn ốm tiêu chảy và sng phù đầu

Địa điểm

Số cơsở lấymẫu

Tổng sốmẫu

3.1.2 Nuôi cấy đặc hiệu cho E coli, sàng lọc vi khuẩn tạp

Từ 340 mẫu bệnh phẩm thu thập đợc ở các vùng, miền trên cả nớc, bớc đầu

chọn lọc E coli, chúng tôi dùng môi trờng đặc hiệu cho E coli là môi trờng Mac

Conkey Kết hợp với các môi trờng khác nh là môi trờng thạch máu, môi trờng nớcthịt, môi trờng thạch thờng, môi trờng yếm khí để chọn ra những chủng có đặc điểm

giống với E coli, loại đợc những vi khuẩn tạp (không phải là E coli) Kết quả cụ thể

đợc thống kê ở bảng 3.

Qua bảng 3 thấy rằng: từ 340 mẫu bệnh phẩm ở lợn có dấu hiệu mắc bệnh sng

phù đầu và ỉa chảy do E coli gây nên, trên môi trờng Mac Conkey phân lập đợc 266mẫu vi khuẩn có đặc điểm hình thái khuẩn lạc giống với hình thái khuẩn lạc E coli

(màu hồng cánh sen), chiếm tới 78,24% Trong đó cao nhất là ở Đồng Nai có tỷ lệ85% và thấp nhất là Nghệ An có tỷ lệ 68,0% mẫu vi khuẩn có đặc điểm hình thái

khuẩn lạc giống với E coli.

STTĐịa điểm lấymẫu

Số lợngmẫu