So sánh hiệu quả của hỗ trợ phôi thoát màng bằng laser và acid tyrode trong thụ tinh trong ống nghiệm

So sánh hiệu quả của hỗ trợ phôi thoát màng bằng laser và acid tyrode trong thụ tinh trong ống nghiệm

SO SÁNH HIỆU QUẢ CỦA HỖ TRỢ PHÔI THOÁT MÀNG BẰNG LASER VÀ ACID TYRODE TRONG THỤ

TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

TÓM TẮT

Mục tiêu: So sánh hiệu quả của laser và acid Tyrode trong hỗ trợ phôi thoát

màng ở bệnh nhân thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) chuyển phôi tươi

lâm sàng ngẫu nhiên, mù đôi có nhóm chứng được tiến hành tại IVF Vạn Hạnh trong thời gian từ tháng 07/2008 đến tháng 10/2008 Hai trăm bệnh nhân TTTON có chỉ định thực hiện hỗ trợ phôi thoát màng được phân bố ngẫu nhiên vào nhóm sử dụng laser và nhóm acid Tyrode

Kết quả: Không có sự khác biệt về tỉ lệ thai lâm sàng ở nhóm sử dụng laser và

nhóm sử dụng acid Tyrode để hỗ trợ phôi thoát màng (43% và 41%, p = 0,57) Tỉ lệ làm tổ của phôi cũng tương đương giữa 2 nhóm, 21,2% ở nhóm laser và 22,1% ở nhóm acid Tyrode (p = 0,85) Tỉ lệ đa thai giữa hai nhóm cũng không

khác biệt có ý nghĩa thống kê (53,4% ở nhóm laser và 58,5% ở nhóm acid Tyrode, p = 0,21)

Kết luận: Laser và acid Tyrode có hiệu quả tương đương trong hỗ trợ phôi

thoát màng ở các chu kỳ TTTON chuyển phôi tươi

ABSTRACT

A PROSPECTIVE, RANDOMIZED, DOUBLE BLIND STUDY COMPARING ASSISTED HATCHING USING LASER AND ACID TYRODE IN IN-VITRO FERTILIZATION PATIENTS

Dang Quang Vinh, Vuong Thi Ngoc Lan, Le Thuy Hong Kha, Mai Cong Minh Tam,

Truong Thi Thanh Binh, Ho Manh Tuong

* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 13 – Supplement of No 1 - 2009: 135 –

142

Objective: To compare the efficiency of the two methods for assisted hatching

(AH), laser-AH and AH using acid Tyrode

Material and method: This was a prospective, randomized, double blind

study, conducted on IVF-ET patients from 07/2008 to 10/2008 at IVF Van Hanh Two hundred patients were randomly assigned to receive laser or acid Tyrode for assisted hatching

Results: There were no significant differences between 2 groups of patients

with regard to clinical pregnancy rate (43% in laser group and 41% in acid Tyrode group, p = 0.57), implantation rate (21.2% in laser group and 22.1% in acid Tyrode group, p = 0.85) The multiple pregnancy rate was also similar between two groups (53.4% in laser group and 58.5% in acid Tyrode group, p = 0.21)

Conclusion: Laser is as effective as acid Tyrode for assisted hatching in

IVF-ET patients, resulting in similar clinical pregnancy rate and implantation rate

ĐẶT VẤN ĐỀ

Phôi người sau khi hình thành từ quá trình thụ tinh sẽ được bao quanh bởi một lớp màng cấu tạo từ các phức hợp glycoproteins, màng zona pellucida (ZP) Chức năng chính của màng ZP là ngăn ngừa hiện tượng đa thụ tinh; bảo vệ phôi trong những giai đoạn đầu phát triển và giúp các phôi bào không rời ra và áp sát vào nhau trong quá trình compaction(Error! Reference source not found.) Tuy nhiên, để có thể làm tổ, phôi phải thoát ra khỏi lớp màng bảo vệ này và bám vào niêm mạc tử cung Hiện tượng này được gọi là thoát màng (hatching), thường xảy ra vào ngày 6-7 sau thụ tinh Người ta cho rằng đây là kết quả của sự kết hợp giữa sự gia tăng áp suất bên trong của phôi ở giai đoạn phôi nang làm cho màng zona mỏng đi, và tác động của các loại enzyme (chủ yếu là lysin) có trong môi trường tử cung và bản thân phôi tiết ra(Error! Reference source not

found.,Error! Reference source not found.)

Mặc dù cơ chế sinh hóa chính xác còn chưa được hiểu rõ ràng, nhiều nghiên cứu cho thấy bản thân các hoạt động của phôi có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng phôi thoát màng hơn là các tác động từ môi trường tử cung(Error! Reference source not found.)

Trong các trường hợp thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON), phôi thường được nuôi cấy trong điều kiện in vitro trong thời gian 2-5 ngày trước khi chuyển phôi Trong môi trường in vitro, có thể do điều kiện nuôi cấy khác với môi trường in vivo, nhất là khi điều kiện nuôi cấy chưa được tối ưu hóa, màng zona

pellucida có thể bị thay đổi cấu trúc, trở nên “chắc” hơn (zona hardening), dẫn đến quá trình làm mỏng màng bị ảnh hưởng(4,5) Nghiên cứu cho thấy có đến 54% phôi nang vào ngày 6-7 khi nuôi cấy trong môi trường in vitro có bất thường trong quá trình thoát màng(Error! Reference source not found.) Đó là chưa kể đến có khoảng 15% các phôi nuôi cấy có màng zona dày hơn bình thường(4) làm cho quá trình thoát màng của phôi bị ảnh hưởng Y văn cũng ghi nhận phôi TTTON thường thoát màng trễ hơn phôi trong tự nhiên khoảng 1 ngày(Error!

Reference source not found.)

Do đó, trong một số trường hợp, khi phôi từ các chu kỳ TTTON thoát màng, NMTC có thể không còn phù hợp cho phôi làm tổ

Kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng (assisted hatching) đã được triển khai và áp dụng thành công lần đầu tiên vào những năm cuối thập niên 80(Error! Reference

source not found.)

Trong hơn hai thập niên qua, nhiều kỹ thuật đã được thử nghiệm và áp dụng trong hỗ trợ thoát màng nhằm làm tăng tỷ lệ làm tổ của phôi trong các chu kỳ TTTON Các kỹ thuật được áp dụng là phương pháp cơ học(3,4); hóa học(Error! Reference source not found.) hay gần đây nhất là tia laser(2,15) để thực hiện các thao tác trên màng zona Với các kỹ thuật trên, hỗ trợ thoát màng có thể được thực hiện bằng cách làm mỏng màng zona, tạo một lỗ thủng trên màng zona hay loại bỏ hoàn toàn màng zona Nghiên cứu cho thấy cả 4 phương pháp này đều có hiệu quả và độ an toàn như nhau trong việc hỗ trợ phôi thoát màng(1,8,Error! Reference source not found.) Tuy nhiên, với những ưu nhược điểm của

mỗi phương pháp, hiện nay, hai phương pháp thường được áp dụng nhiều nhất là sử dụng acid Tyrode và laser(13,15,Error! Reference source not found.)

Trong phương pháp sử dụng acid, zona pellucida dưới tác động của dung dịch có độ pH thấp sẽ bị bào mòn Acid Tyrode, với độ pH 2,2 – 2,6, đã được sử dụng từ nhiều thập niên qua cho mục đích này(15) Kích thước của lỗ thủng tạo thành thường rất khó kiểm soát vì phụ thuộc vào số lượng acid bơm ra, sự khác biệt về đặc tính của màng ZP của từng phôi cũng như đòi hỏi sự kinh nghiệm của người thao tác Lợi điểm của acid Tyrode là chi phí đầu thấp, cơ động Do đó, acid vẫn được sử dụng rộng rãi tại các labo TTTON lớn trên thế giới và khu vực để hỗ trợ thoát màng Sự an toàn của việc sử dụng acid trong hỗ trợ màng cũng đã được chứng minh Sai và cs năm 2006 cho thấy trẻ sinh ra từ các chu kỳ có hỗ trợ thoát màng bằng acid có tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể tương đương so với nhóm chứng(Error! Reference source not found.)

Việc ứng dụng tia laser trong hỗ trợ thoát màng đã được triển khai ngay từ những năm cuối thập niên 80(Error! Reference source not found.) Tuy nhiên, chỉ đến khi hệ thống laser không tiếp xúc trực tiếp ra đời và nhất là khi Tổ chức Dược phẩm và thực phẩm Hoa kỳ (FDA) chính thức công nhận laser được sử dụng trong TTTON thì việc ứng dụng và lắp đặt hệ thống laser cho hỗ trợ thoát màng ngày càng trở nên dễ dàng và hiệu quả hơn Với những ưu điểm như có độ chính xác cao, thời gian thực hiện ngắn, có thể ứng dụng trong một số kỹ thuật

khác và quan trọng là không cần đòi hỏi nhiều kinh nghiệm ở người thực hiện, laser ngày càng được sử dụng phổ biến(1,8,15)

Tỷ lệ thành công của các nghiên cứu từ hỗ trợ phôi thoát màng thường không thống nhất, có thể do sự khác biệt về đối tượng bệnh nhân, tay nghề của người thực hiện, phương pháp hỗ trợ thoát màng được lựa chọn cũng như khác biệt về thiết kế nghiên cứu đã làm cho việc so sánh kết quả giữa các báo cáo trở nên khó khăn hơn(Error! Reference source not found.) Tuy nhiên, đa số các nghiên cứu đều cho thấy, hỗ trợ phôi thoát màng thật sự có hiệu quả trên một số đối tượng chọn lọc như bệnh nhân lớn tuổi (> 35 tuổi); bệnh nhân TTTON thất bại nhiều lần; bệnh nhân có nồng độ FSH cơ bản cao (≥ 10 mIU/mL); phôi có độ dày màng ZP > 15µm hay trong các chu kỳ chuyển phôi trữ lạnh và chu kỳ trưởng thành trong ống nghiệm (IVM) Nghiên cứu cho thấy nếu một trung tâm TTTON có tỷ lệ thành công 25%, việc áp dụng kỹ thuật hỗ trợ thoát màng trên các bệnh nhân có chỉ định có thể giúp tỷ lệ có thai tăng lên 28% - 39%(Error! Reference source

not found.)

Hiệu quả của từng phương pháp hỗ trợ phôi thoát màng cũng đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới và kết quả cũng còn nhiều khác biệt(Error! Reference

source not found.)

Gần đây nhất, Feng và cs đã ghi nhận laser và acid Tyrode có hiệu quả tương đương trong hỗ trợ phôi thoát màng, và hiệu quả cao hơn nhóm sử dụng phương pháp cơ học và nhóm chứng(Error! Reference source not found.).

Tại Việt nam, trong hơn 10 năm phát triển của TTTON, nhiều tiến bộ trên thế

giới đã được áp dụng và triển khai hiệu quả, cả về lâm sàng lẫn labo, với mục tiêu tăng tỷ lệ thành công của một chu kỳ điều trị Với xu hướng đó, chúng tôi đã triển khai áp dụng kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng tại IVF Vạn Hạnh từ tháng 5/2008 Ban đầu, chúng tôi sử dụng phương pháp dùng acid Tyrode, sau đó, từ tháng 7/2008, chúng tôi đã áp dụng công nghệ laser để hỗ trợ phôi thoát màng Kết quả bước đầu cho thấy tỉ lệ thai lâm sàng tăng khoảng 7% ở các chu kỳ TTTON có thực hiện hỗ trợ phôi thoát màng so với không thực hiện(Error!

Reference source not found.)

Chúng tôi cũng đã ghi nhận những thuận lợi và bất lợi của cả 2 phương pháp trong quá trình triển khai thực hiện Phương pháp dùng acid Tyrode ra đời trước công nghệ laser, hiện nay vẫn được sử dụng rộng rãi ở nhiều trung tâm TTTON trên thế giới, tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi kỹ năng và sự chính xác cao của người thực hiện Phương pháp dùng laser mới được áp dụng sau này, cũng đã chứng minh những ưu việt của nó như qui trình thao tác đơn giản hơn nhiều, nhưng chi phí đầu tư và bảo dưỡng khá lớn Trong điều kiện các trung tâm TTTON tại Việt Nam, việc chọn lựa phương pháp nào để hỗ trợ phôi thoát màng nhằm tăng tỉ lệ có thai cho các chu kỳ điều trị TTTON cần được xem xét về nhiều khía cạnh như hiệu quả, độ an toàn, kỹ năng người thưc hiện và chi phí đầu tư

Nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành để so sánh hiệu quả của 2 phương pháp hỗ trợ phôi thoát màng, sử dụng laser và acid Tyrode trên bệnh nhân

TTTON với mong muốn cung cấp thêm những chứng cứ khoa học về kỹ thuật này trên bệnh nhân Việt Nam, làm cơ sở cho việc phát triển hỗ trợ phôi thoát màng ở Việt Nam

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu

Đây là một nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, ngẫu nhiên, mù đôi có nhóm chứng

Dân số nghiên cứu

Bệnh nhân làm TTTON-chuyển phôi tươi tại IVF Vạn Hạnh trong thời gian từ tháng 07/2008 đến tháng 10/2008 Bệnh nhân được nhận vào nghiên cứu khi thỏa các tiêu chuẩn sau đây:

TTTON, chu kỳ chuyển phôi tươi Có chuyển phôi

Có ít nhất một trong các chỉ định làm hỗ trợ phôi thoát màng: Người vợ > 35 tuổi

Thất bại ít nhất 01 chu kỳ TTTON Nồng độ FSH cơ bản ≥ 10 mIU/mL Độ dày màng ZP > 15µm

Đồng ý tham gia nghiên cứu (có ký cam kết) Tiêu chuẩn loại trừ bao gồm:

Các chu kỳ có xin trứng Các chu kỳ IVM

Có < 2 phôi vào ngày chuyển phôi

Độ dày NMTC < 7mm vào ngày chuyển phôi Có bất thường, dị dạng tử cung

Yếu tố đánh giá kết quả

Tỷ lệ thai sinh hóa Tỷ lệ thai lâm sàng Tỷ lệ làm tổ của phôi Tỷ lệ đa thai

Phương pháp tiến hành

Bệnh nhân được kích thích buồng trứng bằng phác đồ down regulation, bắt đầu từ N21 vòng kinh, sử dụng agonist và recFSH Trứng sau chọc hút được thụ tinh bằng phương pháp ICSI Phôi được nuôi cấy trong điều kiện 37oC, 6%CO2: 7%O2: 87%N2 Chuyển phôi hai ngày sau chọc hút Toàn bộ quá trình tạo phôi, nuôi cấy và chuyển phôi được thực hiện với hệ môi trường Medicult,

Đan mạch

Vào ngày chuyển phôi, bệnh nhân có chỉ định hỗ trợ thoát màng sẽ được bác sỹ tư vấn đầy đủ về kỹ thuật Nếu đồng ý, bệnh nhân được hướng dẫn ký cam kết và được phân bố ngẫu nhiên vào nhóm hỗ trợ thoát màng bằng laser hay bằng acid Tyrode Toàn bộ quá trình thực hiện ngẫu nhiên do một nhân viên không thuộc khoa Hiếm muộn đảm trách và được làm mù đối với bệnh nhân và bác sỹ lâm sàng

Tất cả phôi trước khi thoát màng đều được đo chiều dày của màng ZP, sử dụng phần mềm của hệ thống Zilos-tk laser (Hamilton Thorne, Mỹ) Trong cả hai nhóm bệnh nhân, hỗ trợ thoát màng được thực hiện bằng cách làm mỏng màng zona pellucida (zona thinning) và được tiến hành ít nhất 1 tiếng trước khi chuyển phôi Tất cả trường hợp thoát màng bằng laser và acid Tyrode trong thời gian nghiên cứu đều do một chuyên viên phôi học có kinh nghiệm thực hiện

Hỗ trợ thoát màng bằng acid Tyrode

Phôi được cho vào đĩa petri 60 (Becton Dickinson, Mỹ), bên trong có chứa 3-4 giọt môi trường Sperm Preparation và 1 giọt acid Tyrode (Medicult, Đan mạch) Mỗi giọt môi trường sẽ chứa một phôi Một hệ thống kim giữ trứng và kim hỗ trợ thoát màng (Humagen, Mỹ) được chuẩn bị sẵn Sử dụng kim giữ trứng để cố định phôi sao cho kim AH tiếp xúc phôi ở vị trí có khoang PVS

rộng nhất hay nơi có nhiều fragment nhất Acid Tyrode trong kim AH được bơm từ từ xung quanh một phạm vi nhỏ của màng ZP (khoảng 30-40µm) cho đến khi màng ZP mỏng đi khoảng 50% so với ban đầu Rửa phôi ngay sau đó với môi trường nuôi cấy (ISM1, Medicult, Đan mạch) 3-4 lần trước khi chuyển phôi vào hộp cấy để chờ chuyển phôi

Hỗ trợ thoát màng bằng laser

Hỗ trợ thoát màng được tiến hành trong dĩa petri 60 (Becton Dickinson, Mỹ), bên trong có chứa 3-4 giọt môi trường Sperm Preparation (Medicult, Đan mạch) Mỗi giọt môi trường sẽ chứa một phôi Sử dụng tia laser từ hệ thống Zilos-tk (Hamilton Thorne, Mỹ) Chiều dài của vùng làm mỏng vào khoảng 30-40µm, với độ rộng khoảng 50% chiều dày của màng ZP Ngay sau khi hoàn tất, phôi được rửa trong dĩa petri 35 (Becton Dickinson, Mỹ), với các giọt môi trường ISM1 (Medicult, Đan mạch) và được chuyển vào hộp cấy để chờ chuyển phôi

Khoảng 15 phút trước khi chuyển phôi, phôi được cho vào môi trường UTM (Medicult, Đan Mạch) Toàn bộ bệnh nhân được chuyển phôi bằng catheter Tulip 4000 (Gynetics, Bỉ) dưới hướng dẫn của siêu âm ngả bụng

Hỗ trợ giai đoạn hoàng thể sau chuyển phôi trong hai tuần bằng estradiol và progesterone ngoại sinh Hai tuần sau chuyển phôi, bệnh nhân được thử beta-hCG, trên 25 mIU/mL được xem là dương tính Thai lâm sàng được xác nhận

khi có hình ảnh của ít nhất một túi thai với hoạt động tim thai vào ba tuần sau thử máu

Thu thập và phân tích số liệu

Số liệu được thu thập qua bảng câu hỏi có sẵn Quản lý và phân tích số liệu bằng phần mềm SPSS Sử dụng các phép kiểm thống kê X2 và t-test để so sánh các giá trị phần trăm và trung bình giữa hai nhóm bệnh nhân Trong tất cả trường hợp, p < 0.05 được xem là ngưỡng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

KẾT QUẢ

Trong thời gian từ tháng 07/2008 đến tháng 10/2008, có 200 bệnh nhân thỏa tiêu chuẩn nhận vào nghiên cứu và được phân bố ngẫu nhiên vào hai nhóm, nhóm sử dụng laser (100 bệnh nhân) và nhóm sử dụng acid Tyrode (100 bệnh nhân) Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về một số đặc điểm của bệnh nhân ở hai nhóm điều trị như tuổi trung bình, số lần thực hiện IVF, nồng độ FSH cơ bản cũng như nguyên nhân vô sinh (bảng 1)

Bảng 1 Đặc điểm bệnh nhân của hai nhóm