QUY TRÌNH PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG BỆNH TIÊU CHẢY TRÊN HEO CON Sơ đồ quy trình phân lập Mẫu Nem chua truyền thống Đồng mẫu Pha lỗng cấy trang mơi trường thạch MRS agar Tăng sinh canh trường MRS với khuẩn lạc đặc trưng Cấy ria môi trường MRS agar Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa vi khuẩn lactic Đặc điểm có lợi Định danh Thuyết minh quy trình: 2.1 Bước 1: Nguồn mẫu: - Mẫu: nem chua truyền thống nhà làm - Bảo quản mẫu: túi nhựa PE vô trùng 2.2 Bước 2: Đồng mẫu - Chuẩn bị: dung dịch canh trường BPW tiệt trùng làm nguội - Yêu cầu: + lấy mẫu xử lí mẫu điều kiện vô trùng + mẫu phải đảm bảo đồng Khả sinh acid lactic Khả kháng vi khuẩn gây bệnh - Cân 10g mẫu với 90ml dung dịch BPW chuẩn bị trước cho vào túi nhựa PE vơ trùng, ghép mí bao nhựa PE vơ trùng Sau tiến hành đồng mẫu thiết bị thủ công Ta thu mẫu dịch huyền phù nồng độ 10-1 2.3 Bước 3: Pha lỗng cấy trang mơi trường thạch MRSA * Pha loãng: - Chuẩn bị: ống nghiệm chứa 9ml dung dịch nước muối sinh lí vơ trùng - Dùng micropipet hút 1ml dung dịch mẫu túi nhựa PE cho vào ống nghiệm nước muối sinh lí vô trùng chuẩn bị trước, ta thu ống nghiệm dung dịch pha loãng 10 -2 Tiếp tục ta pha loãng nồng độ 10-5 , 10-6, 10-7 - Yêu cầu: + Thực điều kiện vô trùng + trước hút chuyển đổi nồng độ phải lắc * Cấy trang: - Chuẩn bị đĩa petri có chứa môi trường thạch MRS agar hấp khử trùng - Hút 0,1 ml dung dịch pha loãng nồng độ pha loãng 10 -5 , 10-6, 10-7 thực phương pháp cấy trang điều kiện vô trùng, yêu cầu thu khuẩn lạc rời rạc, trang khơ, khơng nát thạch Sau đem ủ nhiệt độ 30ºC 24h-48h - Xác định khuẩn lạc: đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn lactic tròn, lồi, bóng, trắng đục 2.4 Bước 4: Tăng sinh - Bắt khuẩn lạc nghi ngờ vi khuẩn lactic với đặc điểm khuẩn lạc đặc trưng - Khuẩn lạc sau đem tăng sinh canh trường MRS hấp tiệt trùng, thực thao tác điều kiện vơ trùng Sau đem lắc 150-200 vịng/phút 24h-48h 2.5 Bước 5: Cấy ria - Mẫu sau tăng sinh, Thực phương pháp cấy ria đĩa petri có chứa mơi trường MRS agar hấp tiệt trùng, thực điều kiện vô trùng, yêu cầu thu khuẩn lạc rời rạc, đường cấy liên tục, khơng làm rách thạch Mục đích làm giữ giống 2.6 Bước 6: Xác định đặc điểm sinh lí, sinh hóa vi khuẩn - Hình thái khuẩn lạc: trịn, có màu trắng đục, lồi, bóng - Nhuộm Gram: vi khuẩn Lactic vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, khơng sinh bào tử -Các đặc điểm sinh hóa: stt Phản ứng sinh hóa catalase citrate Di động oxidase Sinh Lên menFructose Lên men Glucose Lên men Lactose Sucrose 10 VP 11 Indol 12 MR 13 Gelatin 2.6 Bước 6: Xác định đặc điểm có lợi Kết + + + + - a) Xác định khả sinh acid lactic giúp giảm pH *Định tính: - Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lactic môi trường thạch MRS agar có bổ sung thêm CaCO3 + Chuẩn bị môi trường MRS agar hấp khử trùng để nguội (50-55ºC) Sau tiến hành phương pháp đổ đĩa đĩa petri hấp khử trùng, thực thao tác điều kiện vô trùng Đem ủ nhiệt độ 30ºC 24h-48h + Quan sát khuẩn lạc: vi khuẩn lactic đĩa petri xuất khuẩn lạc trắng đục, trịn, lồi, có bờ láng xung quanh khuẩn lạc có vịng suốt tiết acid phân giải CaCO3 - Sử dụng thuốc thử Uffelmann: + Tăng sinh vi khuẩn phân lập canh trường MRS hấp tiệt trùng thực điều kiện vơ trùng Đem lắc 150-200 vịng, 24h-48h + Thử nghiệm cách nhỏ vài giọt thuốc thử Uffelmann vào dịch sau tăng sinh, dịch chuyển sang màu vàng kết luận dung dịch có acid lactic *Định lượng: - Sử dụng phương pháp chuẩn độ acid-base: +Lấy 10ml dịch lên men li tâm bỏ sinh khối, bổ sung thêm 20ml nước cất 2-3 giọt phenolphtalein 1% Sau chuẩn độ dung dịch NaOH 0,1N đến kkhi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt bền 30 giây dừng lại Ghi lại kết thể tích NaOH (ml) dùng Lượng acid tính theo công thức sau: Cacid= (VNaOH.CNaOH)/Vacid b) Khả kháng vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn lactic vừa phân lập Vi kkuẩn gây bệnh phân lập từ phế phẩm Tăng sinh heo bị bệnh tiêu chảy Tăng sinh Xác định mật độ phương pháp đo OD bước sóng 600nm Tính tóan theo cơng thức A=OD600nm*1,02*109 (cfu/ml) Đưa mật độ 107 (áp dụng công thức Xác định mật độ phương pháp đo OD bước sóng 600nm Tính tóan theo cơng thức A=OD600nm*1,02*109 (cfu/ml) Đưa mật độ 106 (áp dụng công thức C1V1=C2V2) C1V1=C2V2) Cấy trang môi trường MRS agar hấp tiệt trùng Đem ủ nhiệt độ 37 24-48h Cấy trang môi trường TSA agar hấp khử trùng Đục lỗ thạch Đục lỗ thạch Lắp khối thạch chứa vi khuẩn lactic vào giếng môi trường chứa vi khuẩn gây bệnh vừa trang xong - Sau lắp giếng thạch xong Đem ủ nhiệt độ 37 24-48h - - Yêu cầu: Các đĩa thạch phải tương đối Kết luận: Vòng đối kháng lớn khả kháng vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn lactic mạnh 2.7 Bước Định danh - Phương pháp PCR - Giải trình tự gene - RFLP ... Ghi lại kết thể tích NaOH (ml) dùng Lượng acid tính theo cơng thức sau: Cacid= (VNaOH.CNaOH)/Vacid b) Khả kháng vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn lactic vừa phân lập Vi kkuẩn gây bệnh phân lập từ phế... bị bệnh tiêu chảy Tăng sinh Xác định mật độ phương pháp đo OD bước sóng 600nm Tính tóan theo cơng thức A=OD600nm*1,02*109 (cfu/ml) Đưa mật độ 107 (? ?p dụng công thức Xác định mật độ phương pháp. .. tính: - Sử dụng phương pháp ni cấy vi khuẩn lactic mơi trường thạch MRS agar có bổ sung thêm CaCO3 + Chuẩn bị môi trường MRS agar hấp khử trùng để nguội (5 0-55ºC) Sau tiến hành phương pháp đổ đĩa