phương pháp lai phân tử

Khái niệm “nhiệt độ nóng chảy” DNA: Khi phân tử DNA mạch đôi đun lên nhiệt độ vượt q “nhiệt độ nóng chảy” (Tm) mạch tách rời phá vỡ liên kết hidro nối liền mạch Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn xảy đột ngột sau nhiệt độ dao động xung quanh Tm, tính “cộng hưởng” phản ứng Hiện tượng “cộng hưởng” giống dây kéo, ta tác động lực kéo ngưỡng định hồn tồn khơng có tác dụng Nhưng lực kéo đủ mạnh để làm bật nút nhỏ tồn dây kéo bung mà không cần thêm lực tác động Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị mật độ quang (OD) bước sóng 260nm Giá trị mật độ quang tăng lên phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, tượng có tên gọi “hiệu ứng siêu sắc” (hyperchromic effect) Nguyên nhân tượng phân tử DNA mạch đôi, base (thành phần hấp thu ánh sáng bước sóng 260nm) nằm chồng lên mặt phẳng song song; cấu trúc che lấp phần base khiến chúng không hấp thu ánh sáng đơn vị toàn vẹn, khác với DNA mạch đơn Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ nóng chảy” DNA: Hai mạch đơi phân tử DNA bắt cặp với nhờ liên kết hidro Sự tách rời mạch tương ứng với phá vỡ liên kết Do đó, số lượng liên kết yếu tố làm thay đổi tính ổn định chúng làm thay đổi “nhiệt độ nóng chảy” phân tử DNA a Ảnh hưởng thành phần base phân tử DNA: Do số lượng liên kết hidro A T, G C không (A=T; G C) nên thành phần base cấu tạo DNA mạch đơi có ảnh hưởng quan trọng cho bền vững phân tử này, đặc biệt tỷ lệ base G,C Trong điều kiện chuẩn , Tm đánh giá công thức sau: Tm = 69,3 + 0,41 (% G+C) b Ảnh hưởng độ dài DNA: Đọan DNA dài số lượng liên kết hidro nối mạch lớn nhiêu “nhiệt độ nóng chảy” cao Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử DNA tính theo cơng thức sau: ∆Tm = -500/số lượng cặp base Công thức cho thấy ảnh hưởng độ dài quan trọng đoạn DNA ngắn Điều kết tính “hợp tác” đề cập phần c Ảnh hưởng điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch): Những điểm bắt cặp sai lệch (A bắt cặp với C, G bắt cặp với T,…) làm giảm tính ổn định phân tử lai Thông thường người ta ước lượng Tm giảm 0C cho 1% phần trăm bắt cặp sai lệch Nhưng thành phần base, mismatch có ý nghĩa thực tiễn đoạn DNA ngắn d Ảnh hưởng môi trường phản ứng: - Ảnh hưởng nồng độ muối: Sự giảm lực ion ( nồng độ muồi) môi trường làm giảm mạnh: nhiệt độ nóng chảy” Tm giảm khỏang 150C cho logarithm nồng độ ion hóa trị I Các cation hóa trị II cịn có tác động mạnh Như vậy, dung dịch lỗng làm ổn định chuỗi xoắn kép DNA - Ảnh hưởng Formamide: Hóa chất có khả hạ thấp Tm nhiều Đối với đoạn dài 100 cặp nucleotide, giảm Tm ước lượng theo công thức sau: ∆Tm = - 0,6 x (% formamide) Formamide sử dụng phương pháp lai phân tử nhằm làm giảm nhiệt độ lai Nồng độ thong dụng 50% tương ứng với việc hạ Tm xuống 30 0C Trong thực tế, cần lưu tâm đến tất tiêu nêu tính tốn Tm Công thức thực nghiệm sau cho phép tập hợp yếu tố để ước lượng Tm: Tm = 16,6 log [M] + 0,41 (%GC) + 81,5 - %mismatch - 675/chiều dài (cặp base) – 0,65 (% formamide) Công thức cho đọan DNA ngắn 100 cặp nucleotide; trrong [M] biểu thị nồng độ ion Na+ Khái niệm lai phân tử - Sau hai mạch phân tử DNA tách rời tác động Tm, bắt cặp không xảy nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột - Lúc phân tử DNA tồn mơi trường dạng mạch đơn cấu hình khơng gian vô trật tự Ngược lại, sau hai mạch tách rời, nhiệt độ giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch bắt cặp trở lại -> Hiện tượng gọi lai phân tử (molecular hybridization) Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử a Nồng độ DNA thời gian phản ứng: - Nồng độ DNA, nghĩa số lượng trình tự bổ sung, cao xác suất tiếp xúc với tăng ;  tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên - Thời gian phản ứng dài xác suất tiếp xúc lớn số lượng phân tử lai tăng dần tồn trình tự bổ sung tái bắt cặp b Nhiệt độ: Tốc độ phhản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ Thông thường phản ứng lai cực đại nhiệt đố thấp Tm nucleic acid độ 25% c Độ dài trình tự : Tốc độ lai tăng tỷ lệ thuận với bậc độ dài trình tự bổ sung d Lực ion: Nồng độ NACl 1M làm tằng tốc độ phản ứng lên từ đến 10 lần Nồng độ NaCl vượt 1,2M lại hồn tồn khơng cịn tác dụng Lai pha lỏng a) Nguyên tắc: - Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm môi trường lỏng dung dịch đệm - Sự lai phân tử xảy trình tự gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm vài độ b) Phân tích định lượng phân tử lai: có phương pháp thường dùng  Phương pháp dùng quang phổ kế DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu DNA mạch đơn Sự chuyển từ DNA mạch đôi sang dạng mạch đơn xác định thông qua giá trị mật độ quang (OD) bước song 260nm Giá trị mật độ quang tăng lên phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn – tượng gọi “hiệu ứng siêu sắc” “Hiệu ứng siêu sắc”: nhuộm tím phân tử DNA, đem chúng đun nóng lên làm lạnh từ từ kết phân tử DNA trở nên tím đậm lúc đầu chút Nếu hạ nhiệt độ cách đột ngột chúng trở nên đậm tượng mạch đơn DNA hấp thu tia UV mạnh DNA mạch đôi (phần ko chèn vào powerpoint nha, để ảnh tự nói)  Phương pháp dung Nuclease S1 Nuclease S1 enzyme có khả thủy giải nucleic acid mạch đơn DNA hay RNA Dung dịch phản ứng lai trích phần, đem xử lý với Nuclease S1 Các mạch đơn bị thủy giải, sản phẩm pứ oligonucleotides nhóm nucleotide 5’ phosphoryl Các nuleic lại thu nhận qua phương pháp tủa đem định lượng  Phương pháp sắc kí hydroxylapatite Hydroxylapatite tinh thể phosphate calci Kĩ thuật sử dụng mồi đánh dấu để lai với DNA, RNA với protein tế bào mà không cần tách chiết Sau hỗn hợp bị đốt nóng, chúng làm lạnh để mạch đơn va chạm ngẫu nhiên Các hỗn hợp ủ khoảng 120h 60oC dung dịch đệm Natri phosphate Nhiệt độ quan trọng nhiệt độ thấp, bắt cặp sai lệch thường xuyên Tại 60oC, DNA bắt cặp với mạch bổ sung đa số base đủ cho mạch kép bền vững nhiệt độ (phần vậy) Kế tiếp, mẫu thể lai mạch đôi khác tạo thành đặt vào cột hydroxylapatite dìm chậu nước 55oC Khi thể lai tan chảy, rửa cho vào lọ xác định Cuối cùng, đường cong tan chảy vẽ với kết thí nghiệm d) Các ứng dụng phương pháp lai dung dịch:  Tính tỉ lệ % trình tự giống lồi gần Việc lai DNA đo mức độ tương đồng DNA loài khác Những DNA lai tương đồng nhiều tan chảy nhiệt độ cao Kĩ thuật cho thấy người tinh tinh mang DNA giống nhiều so với DNA đười ươi hay khỉ đột  Phân tích trình tự lặp lại Trong trình tự DNA, trình tự lặp lại nhiều lần có nhiều may gặp mạch bổ sung so với trình tự Bộ gene Eukaryote có trình tự lặp lại cao Prokaryote  So sánh kích thước gen khơng chứa trình tự lặp lại Ở Prokaryote, gene khơng chứa trình tự lặp lại nên động học lai tất trình tự Tính chất sử dụng để so sánh kích thước gene loài sinh vật Prokaryote  Ưu điểm: hiệu q trình lai cao, q trình phân tích định lượng phân tử lai xác  Nhược điểm: quy trình làm phức tạp, khó thực hiện; khó tách phân tử lai khỏi q trình; xảy tái bắt cặp hai mạch phân tử Lai pha rắn : 2-1 Nguyên tắc - Cùng nguyên tắc với lai pha lỏng - Điểm khác biệt trình tự bổ sung (trình tự đích, trình tự cần tìm) cố định giá thể rắn (màng nitrocellulose hay nylon) Ưu điểm + Thao tác dễ dàng + Tách trực tiếp ADN hay ARN gốc dung dịch thuốc thử + Ngăn tái bắt cặp mạch phân tử Khuyết điểm + Phân tích định lượng phân tử lai xác + Hiệu thấp + Vận tốc lai pha rắn