Công nghệ sinh học hiện đại (lai phân tử)

PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ NỘI DUNG I CƠ SỞ CỦA SỰ LAI PHÂN TỬ II CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ Lai pha lỏng Lai pha rắn Lai chỗ III TỔNG KẾT KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP LAI I CƠ SỞ CỦA SỰ LAI PHÂN TỬ Khái niệm “nhiệt độ nóng chảy” DNA - Khi phân tử DNA mạch đôi đun lên nhiệt độ vượt q “nhiệt độ nóng chảy” (Tm) hai mạch tách rời phá vỡ liên kết hydro nối liền hai mạch Đường cong TM Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ nóng chảy” DNA - Ảnh hưởng thành phần base phân tử DNA - Ảnh hưởng độ dài đoạn DNA - Ảnh hưởng điểm bắt cặp sai lệch - Ảnh hưởng môi trường phản ứng Khái niệm lai phân tử - Sau hai mạch phân tử DNA tách rời tác động Tm, bắt cặp không xảy nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột - Lúc phân tử DNA tồn môi trường dạng mạch đơn cấu hình khơng gian vơ trật tự Ngược lại, sau hai mạch tách rời, nhiệt độ giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch bắt cặp trở lại -> Hiện tượng gọi lai phân tử (molecular hybridization) Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử - Nồng độ DNA thời gian phản ứng - Nhiệt độ - Độ dài trình tự - Lực ion II CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ “ Các phương pháp lai phân tử đa dạng, chia thành nhóm lớn : - Lai pha lỏng - Lai pha rắn - Lai chỗ Lai pha lỏng a Nguyên tắc: - Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm môi trường lỏng dung dịch đệm - Sự lai phân tử xảy trình tự gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm vài độ 10 * WESTERN BLOT: Là trình proteinprotein kết hợp đặc hiệu với Thường sử dụng Antibody protein có gắn phóng xạ gắn lưu huỳnh để phát protein Mục đích : dùng để phát protein 23 Sơ đồ lai WESTERN BLOT 24 SOUTHERN BLOT ĐIỂM KHÁC NHAU CỦA PHƯƠNG PHÁP NORTHERN BLOT WESTERN BLOT 25 Southern Blot Northern Blot Western Blot Trích DNA từ tế bào Trích RNA từ tế bào Trích protein từ tế bào Cắt với enzyme giới hạn Làm biến tính với formaldehyde Làm biến tính SDS Chạy gel (dùng agarose) Chạy gel (dùng agarose) Chạy gel (dùng polyacrylamide) DNA mang gene X có tính phóng xạ DNA mang gene X có tính phóng xạ Kháng thể chống lại protein X đánh dấu phóng xạ hay enzyme Làm biến tính DNA Chuyển lên màng nitrocellulose (bằng hoạt động mao dẫn) Chuyển lên màng nitrocellulose (bằng hoạt động mao Chuyển lên màng nitrocellulose thường di chạy điện di dẫn) Tắc nghẽn với DNA dư protein dư Tắc nghẽn với RNA dư Tắc nghẽn với protein dư Lai với mẫu dò DNA đánh dấu Lai với mẫu dò DNA đánh dấu Lai với mẫu dò kháng thể đánh dấu Rửa khỏi mẫu dò chưa liên kết (dưới kiểm sốt nghiêm ngặt) Rửa khỏi mẫu dị chưa liên kết (dưới Rửa khỏi mẫu dò chưa liên kết kiểm sốt nghiêm ngặt) Phóng xạ tự ghi 26 Phóng xạ tự ghi Phóng xạ tự ghi hay thể rõ với chất có màu * DOT VÀ SLOT BLOT: - Cho phép định lượng tương đối DNA hay RNA đặc trưng hỗn hợp mà không cần phải tách chúng - Kỹ thuật Dot (dot khe) đơn giản nhiều so với phương pháp khác vì:+ Khơng cần giai đoạn cắt enzyme cắt giới hạn + Không cần chạy điện di - Kỹ thuật Dot dùng nghiên cứu đoạn DNA ngắn 27 Lai chỗ a Nguyên tắc: - Lai chỗ phát triển từ phép lai Southern blot - Kỹ thuật sử dụng mồi đánh dấu (đoạn nucleotide kháng thể) để lai với ADN, ARN với protein tế bào mà không cần tách chiết * Ứng dụng: Định vị gen NST, phát dòng vi khuẩn tái tổ hợp, nghiên cứu RNA chuyên biệt tế bào mô Lai nhiễm sắc thể Các phương pháp thực Lai khuẩn lạc 28 Lai tế bào mô * LAI TRÊN NGHIỄM SẮC THỂ Các NST giai đoạn trung kì xử lí kỹ thuật tế bào học lame.  NST cố định lame đem lai với mẫu dị có đánh dấu phóng xạ Để phát phân tử lai, người ta phủ lên lame huyền dịch (emulsion) nhạy cảm với tia xạ Sau thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch Lame quan sát kính hiển vi, kết thể thành hạt nằm lớp huyền dịch vị trí có phân tử lai 29 * LAI TRÊN KHUẨN LẠC  Mỗi khuẩn lạc để lại vài tế bào vi khuẩn màng lai  Màng lai xử lí NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn làm biến tính DNA  Cố định DNA màng tiến hành phương pháp lai phương pháp lai pha rắn khác  Kết phép xác định dịng vi khuẩn cần tìm hộp petri ban đầu Dịng thu nhận phân tích 30 * LAI TRÊN TẾ BÀO VÀ MƠ MỤC ĐÍCH: Trong tế bào mô, RNA, đặc biệt mRNA có Mơ xử lí phương pháp mô học (cố phân bố không gian xác định Sự phân bố không gian định, khử nước ; tẩm parafin, cắt thành lát liên quan đến chức điều hòa tương tác mỏng từ đến 10 micromet trải lame) Kết mRNA với thành phần khác tế bào mô Để đọc trực tiếp lame nhờ kính hiển nghiên cứu mRNA tách chiết tinh không vi cho phép thu nhận thông tin vừa kể, người ta dùng phương pháp lai tế bào mơ 31 * ỨNG DỤNG: - Đối tượng có tổ chức phức tạp (não bộ), pp giúp định vị xác vị trí phân bố mRNA nhóm tế bào chuyên biệt tổ chức - Khi phối hợp pp miễn dịch tế bào lai chỗ, giúp phát đồng thời mRNA protein xác định mối tương qua hoạt động phiên mã dịch mã gen - Bằng cách lai nhiều lát cắt có cấu trúc gần đồng với nhiều mẫu dò khác xác định vị trí, phân bố tương tác mRNA tham gia vào trình sống 32 TỔNG KẾT KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP LAI III * PHÂN BIỆT: Lai pha lỏng Nguyên tắc Phương pháp sử dụng phổ biến 34 Lai pha rắn Lai chỗ - Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm - Giống pha lỏng điểm khác biệt trình tự -Lai chỗ phát triển từ phép lai Southern blot môi trường lỏng dung dịch đệm bổ sung (trình tự đích, trình tự cần tìm) cố định -Kỹ thuật sử dụng mồi đánh dấu (đoạn -Sự lai phân tử xảy trình tự giá thể rắn (màng nitrocellulose hay nylon) nucleotide kháng thể) để lai với ADN, ARN gặp chuyển động nhiệt nhiệt - Vì vận tốc lai pha rắn gấp 10 lần vận với protein tế bào mà không cần tách độ môi trường thấp Tm vài độ tốc lai pha lỏng chiết - Phương pháp dùng quang phổ kế - Southern blot - Lai khuẩn lạc - Phương pháp dùng Nuclease N1 - Northern blot - Lai nhiễm sắc thể - Phương pháp sắc kí hydroxylapatite - Western blot - Lai tế bào mô - Dot (slot) blot * PHÂN BIỆT: Lai pha lỏng Ứng dụng 35 Lai pha rắn Lai chỗ - Tính tỉ lệ % trình tự giống loài - Lập đồ giới hạn gen - Định vị xác vị trí phân bố gần - Phát đa dạng trình tự (fragment mRNA nhóm tế bào chun biệt tổ - Phân tích trình tự lặp lại polymorphism) gen chủng hay cá chức - So sánh kích thước gen khơng chứa thể khác qua so sánh đồ giới hạn chúng - Xác định mối tương qua hoạt động phiên trình tự lặp lại - Phát đột biến đoạn, đột biến điểm hay tái mã dịch mã gen tổ hợp gen chúng làm thay đổi đồ giới - Xác định vị trí, phân bố tương tác hạn mRNA tham gia vào trình sống Kết luận chung tầm quan trọng: “ - Lai xun lồi - So sánh kích thước gen khơng chứa trình tự lặp lại - Lập đồ giới hạn gen, phát đột biến - Tìm hiểu phân bố mRNA, ảnh hưởng đến chức năng, điều hòa biểu tương tác chúng đến thành phần khác tế bào mô 36 Cảm ơn cô bạn lắng nghe! 37 ... LAI PHÂN TỬ II CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ Lai pha lỏng Lai pha rắn Lai chỗ III TỔNG KẾT KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP LAI I CƠ SỞ CỦA SỰ LAI PHÂN TỬ Khái niệm “nhiệt độ nóng chảy” DNA - Khi phân. .. -> Hiện tượng gọi lai phân tử (molecular hybridization) Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử - Nồng độ DNA thời gian phản ứng - Nhiệt độ - Độ dài trình tự - Lực ion II CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN... ban đầu Dịng thu nhận phân tích 30 * LAI TRÊN TẾ BÀO VÀ MƠ MỤC ĐÍCH: Trong tế bào mơ, RNA, đặc biệt mRNA có Mơ xử lí phương pháp mơ học (cố phân bố không gian xác định Sự phân bố không gian định,