các phương pháp phân tích vi sinh vật

PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA• Mục đích sử dụng trong định lượng VSV • Kỹ thuật – Môi trường agar được đun chảy và làm nguội đến 45±1 o C – Cấy t i đa 1ml dịch mẫu hay dịch pha loãng vào đĩa petri

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

2 Phương pháp trên cơ sở kỹ thuật sinh học

phân tử

PHÂN TÍCH VSV BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

• Phương pháp đổ đĩa (pour plate)

• Phương pháp cấy bề mặt (spread)

• Phương pháp MPN (most probable number)

• Phương pháp nuôi cấy kỵ khí

PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA

• Mục đích sử dụng trong định lượng VSV

• Kỹ thuật

– Môi trường agar được đun chảy và làm nguội đến 45±1 o C – Cấy t i đa 1ml dịch mẫu hay dịch pha loãng vào đĩa petri ối đa 1ml dịch mẫu hay dịch pha loãng vào đĩa petri trống vô trùng (Þ 9 – 10cm)

– Đổ 10-15ml môi trường vào đĩa

– Lắc ngược và xuôi chiều kim đồng hồ

– Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho môi trường đông đặc

– Ủõ ngược đĩa, trong điều kiện và thời gian xác định

PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA

• Ưu điểm

– Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml)

– Xác định được các VSV cần dinh dưỡng tiếp xác từ nhiều phía

– Cho phép đếm được mật độ VSV cao, khoảng 150 - 300 khuẩn lạc

Nhược điểm

- Không định lượng được những VSV quá nhạy nhiệt

- Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nhất định

- Khó làm thuần một dòng VSV

PHƯƠNG PHÁP CẤY BỀ MẶT

• Môi trường phải được chuẩn bị trên đĩa

trước 1-2 ngày để khô mặt

• Phương pháp

– Cấy 0,1 – 0,3ml vào đĩa môi trường (đĩa Þ 90mm) Cấy tối đa 1ml vào đĩa môi trường (đĩa Þ 140mm) – Trải đều mẫu lên bề mặt môi trường bằng que

trang tam giác

– Để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô mặt

– Lật ngược đĩa để ủ

PHƯƠNG PHÁP CẤY BỀ MẶT

• Ưu điểm

– Định lượng được các VSV nhạy nhiệt

– Có thể nhận dạng đựơc dạng khuẩn lạc đặc trưng – Dễ dàng làm thuần chủng VSV mục tiêu

PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER)

• Khái niệm

– Còn gọi là phương pháp pha loãng tới hạn

– Giá trị kết quả nhận được là số lượng VSV mục tiêu có xác suất cao nhất theo nguyên tắc thống kê

– Giá trị MPN là giá trị có xác xuất cao nhất

• Hệ thống MPN

– Gồm 3 hoặc 5 lần lặp lại ở mỗi nồng độ

– Lặp lại ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp

– Chọn các độ pha loãng sao cho trong hệ thống có cả ống dương tính và ống âm tính

– Kết quả MPN có độ chính xác cao nhất khi số ống dương tính và âm tính trong hệ thống tương đương nhau

PHƯƠNG PHÁP MPN

Chia theo số lượng ống trong hệ thống

- Hệ thống 9 ống: mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần

- Hệ thống 15 ống: mỗi độ pha loãng lặp lại 5 lần

Sự tạo hơi: Coliforms, E coli …

Sự đổi màu: S aureus

Đặc điểm

Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớn

HỆ THỐNG MPN

• Hệ thống 9 ống

10ml môi trường nồng độ thường

(đơn)

Hệ thống 15 ống

ĐỊNH LƯỢNG F COLIFORM BẰNG PP MPN

ĐỊNH LƯỢNG F COLIFORM BẰNG PP MPN(tt)

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

2.2 2.3

3.3 10ml EC

j j

j

j

m g

t m

t

g g

MPN

) (

/

GIỚI HẠN TIN CẬY

CHỈ SỐ MPN CƠ BẢN

• Là chỉ số tra được từ bảng kết quả MPN có số

lượng mẫu trong t ng dãy lặp lại như sau: ừng dãy lặp lại như sau:

CÔNG THỨC CHUYỂN ĐỔI

KẾT QUẢ MPN

• Cs = M x F/V 0 x V s

Cs: là khả năng lớn nhất của vi sinh vật cĩ trong thể tích Vs

M : chỉ số MPN tra từ bảng đối với độ pha lỗng cơ bản V0

F : nghịch đảo hệ số pha lỗng tương ứng với độ pha lỗng thấp nhất của dãy

Vs: Thể tích chuẩn được chọn để biểu thị mật độ vi sinh vật

• Nếu tính kết quả là MPN/g thì V s = 1

• Nếu tính kết quả là MPN/100g thì Vs = 100

V 0 : Thể tích mật độ pha lỗng cơ bản ( V 0 = 10)

•

PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC

• Kích thước lổ lọc 0,47µm hay 0,22µm

• Đường kính và hình dạng màng lọc phụ thực vào đường kính phểu lọc

• Đường kính màng thường là 45mm

THIẾT BỊ LỌC NHIỀU PHỂU

(MULTIFOLDER)

CÁC BỘ PHẬN CỦA THIẾT BỊ LỌC VSV

PHƯƠNG PHÁP LỌC VSV

• Phểu lọc, giá đở màng lọc phải được vô trùng sau mỗi lần lọc

• Mật độ VSV trong dịch lọc thích hợp:

<150 khuẩn lạc/màng

• Thể tích dịch lọc trong 1 lần: 50 -100ml

• Nếu thể tích dịch lọc nhỏ hơn thì phải pha loãng bằng dd pha loãng hay nước cất vô trùng

PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC

KHUẨN LẠC VSV TRÊN MÀNG

PHƯƠNG PHÁP MÀNG

PHƯƠNG PHÁP ĐĨA PETRI FILM

Đặt mẫu lên màng Petrifilm

Dàn đều mẫu trên màng

Ủ Petrifilm, đếm trực tiếp hoặc phân lập

Xanh: E coli Đỏ: Coliforms

Different colors with indolyl substrates

loro -3-in dolyl)

5-Io do -3-indolyl

In do

lyl

BC

I (5 -B ro 4-c hlo ro -3 -in do lyl)

G re en (N -M eth yl-3-in do

lyl)

Chromogenic Substrates

PHẢN ỨNG ENZYME TẠO MÀU

CƠ CHẾ TẠO MÀU

Không màu

X Y

Z

N H

X Y

OH Z

N H

X Y

X

Y O

Z

Z

HIỆN MÀU

PHẢN ỨNG CHUNG CỦA CƠ CHẤT TẠO MÀU

O +2

E coli VÀ Coliforms X-GLUC và Salmon-GAL

phát huỳnh quang dưới tia UV

–Clostridium perfringens

Biểu hiện của L monocytogenes trên môi trường ALOA và

Clostridium perfringens phát

huỳnh quan trong môi trường

TSC agar có bổ sung MUP

Pseudomonas phát huỳnh

quan trong môi trường Pseudomonas agar có

Hecxadecyltrimethyl ammonium bromide(cetrimide)

PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG

ATP

• Nguyên tắc

E + LH 2 + ATP E – LH 2 AMP + PPi (1)

E – LH 2 AMP + O 2 Oxyluciferin + AMP + CO 2 + hv (2)

Phản ứng trên có thể viết lại như sau:

E + LH 2 + ATP +O 2 Oxyluciferin + AMP + CO 2 + hv +PPi

E : luciferase

Aùnh sáng phát ra có bước sóng 562nm, có màu vàng.

Mg 2+

PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG

ATP

• Định lượng VSV thông qua số lượng ATP

của VSV trong mẫu

• Số lượng ATP phụ thuộc vào điều kiện dinh dưỡng, trạng thái tế bào

• Không phân biệt được các dòng, loài hay

nhóm VSV khác nhau

PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG ATP

• Ưu điểm

– Cho phép định lượng được tổng số vsv trong mẫu – Cho kết quả định lượng nhanh

– Thích hợp cho việc giám sát vệ sinh trên dây

chuyền sản xuất

PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG

ATP

• Nhược điểm

– Không phân biệt được ATP của VSV và của mẫu – Không phân biệt được các dòng, loài hay nhóm VSV khác nhau

– Cần thiết bị tinh vi, có độ nhạy và độ chính xác cao

– Các hoá chất khó bảo quản, nhạy cảm với ánh sáng

PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG ATP

PHƯƠNG PHÁP ELISA (enzym linked

immunosorbent assay

• Thiết lập trên nguyên tắc của phản ứng kháng nguyên – kháng thể

• Kháng nguyên: đối tượng cần phân tích trong mẫu

• Kháng thể: cố định trong giếng (well) và trong trong kít

• Có hai loại phương phát ELISA

– ELISA thường (thuận)

– ELISA cạnh tranh

PHƯƠNG PHÁP ELISA (enzym linked immunosorbent assay)

• Bộ kít của phản ứng ELISA thuận

+ Có 2 kháng thể trong một phản ứng

- Kháng thể sơ cấp: cố định trong giếng

- Kháng thể thứ cấp tự do có gắn enzym tạo màu + Cơ chất tạo màu với enzym

+ Chất rửa

+ Chất dừng phản ứng enzym

NGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG ELISA THUẬN

Kháng thể thu

kháng nguyên

Cơ chất

Phát quang

PHƯƠNG PHÁP ELISA (enzym linked

immunosorbent assay)

• Bộ kít của phản ứng ELISA cạnh tranh

+ Có 2 kháng thể

- Kháng thể sơ cấp, cố định trong giếng là kháng nguyên của kháng thể sơ cấp

- Kháng thể thứ cấp tự do có khả năng liên kết miễn dịch với kháng thể sơ cấp và chất cần phát hiện, không mang enzym + Chất cạnh tranh có mang enzym

+ Cơ chất tạo màu với enzym

+ Chất rửa

+ Chất dừng phản ứng enzym

SƠ ĐỒ PHẢN ỨNG ELISA CẠNH TRANH

Rửa

Hiện màu

Dừng phản ứng,

ƯU, NHƯỢC ĐIỂM CỦA ELISA

• Ưu điểm

– Nhanh, nhạy

– Dễ dàng tự động hoá

– Có thể thực hiện một lúc nhiều mẫu

PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG MẪU DÒ

• Ngyên tắc

– Trên cơ sở phương pháp lai phân tử

– Có thể phát hiện đối tượng bằng DNA hay RNA – Mức độ chuyên biệt của phương pháp phụthuộc vào sự chuyên biệt của mẫu dò (probes)

– Mẫu dò có thể là mạch RNA hay DNA

Phương pháp Lateral Flow

Test (LFT)

bacterium gold particle

antibody

membrane