CÁC QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍTPC Total Plate Count/ APC Aerobic Plate Count • Định nghĩa – VSV hiếu khí là vi sinh vật phát triển và tạo được khuẩn lạc có thể nhìn thấy trong điều kiện có

CÁC QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

VI SINH VẬT

TS NGUYỄN TIẾN DŨNG

TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

TPC (Total Plate Count)/ APC (Aerobic Plate Count)

• Định nghĩa

– VSV hiếu khí là vi sinh vật phát triển và tạo được khuẩn lạc có thể nhìn thấy trong điều kiện có O2

– Tổng số vi sinh vật hiếu khí là số khuẩn lạc hình thành được nhìn thấy trong một khối lượng mẫu

– Số đơn vị hành thành khuẩn lạc (cfu – colony forming unit) là số khuẩn lạc được nhìn thấy trong môi trường nuôi cấy

2

• Số TPC thấp hơn rất nhiều so với mật độ

vi sinh vật trong mẫu

NGUYÊN TẮC

• Định lượng TPC bằng phương pháp đếm

khuẩn lạc theo nguyên tắc sau:

- Mẫu được đồng nhất, pha loãng theo từng bậc 10

- TPC được định lượng theo phương pháp đổ đĩa:

- 1ml mẫu (dd mẫu đã pha loãng) cấy vào đĩa petri trống vô trùng

- Môi trường agar không chọn lọc được đun chảy và làm nguội đến 45±1oC được đổ vào trong đĩa, lắc đều

- Ủ đĩa ở 25-30oC trong 72 ±6giờ

- Đếm tất cả các khuẩn lạc nhìn thấy được

MÔI TRƯỜNG

• Dung dịch pha loãng

• Môi trường không chọn lọc

• - Plate count agar

• - Nutrient agar

• - Standard count agar

QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH

Cấy 1ml dd mẫu đã pha loãng vào đĩa petri

trống vô trùng Cấy 3 độ pha loãng liên tiếp,

mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa

Đỗ vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 15-20ml môi trường PCA đã đun chảy và làm nguội đến 45oC Lắc

cho mẫu khuếch tán vào môi trường

QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH

VẬT HIẾU KHÍ (tt)

7

Để đĩa trên mặt phẳng ngang cho môi trường đông đặc

Lật ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 30 ± 1 o C trong 72 ± 6 giờ

Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa Chọn các

đĩa có khoảng 15 –300 khuẩn lạc / đĩa để tính kết quả

Tổng số vi sinh vật hiếu khí / g (TPC)

TPC =

n1V1F1 + …+ niViFi N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa

n: số đĩa tại mỗi nồng độ

V: thể tích cấy vào đĩa (=1)

F: độ pha loãng

TÍNH KẾT QUẢ

• Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong

khoảng 25-250KL hay 30-300 KL để tính kết quả

• Số CFU/g(nl) =

• Nếu ở độ pha loãng thấp nhất hay cao

nhất mà có số đếm ngoài giới hạn trên thì kết quả sẽ được đánh dấu

8

N

n1V1f1+…+niVifi

ĐỊNH LƯỢNG BÀO TỬ VI SINH VẬT

KỴ KHÍ SINH H2S (CLOSTRIDIA)

• Định nghĩa

– Thuộc giống Clostridium, phát triển trong

điều kiện kỵ khí – Hình que, gram dương, di động (trừ C

perfingens) – Tạo bào tử bền nhiệt – Tạo được H2S từ nguồn Sulphite – Tạo được enzym protease ngoại bào

10

• Vi sinh vật chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm, chỉ thị ô nhiễm ngầm, lâu ngày

• Vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm

• Trong giống có nhiều loài tạo độc tố

gây ngộ độc thực phẩm như: C

botulinum, C perfrigens…

Ý NGHĨA

ĐỊNH LƯỢNG CLOSTRIDIA

Nguyên tắc

• Mẫu được xử lý nhiệt để loại bỏ tế bào sinh dưỡng, chọn lọc bào tử

• Nuôi cấy kỵ khí trong môi trường có Na2S2O3 là

cơ chất tạo H2S.

• Phát hiện H2S bằng Ferric ammonium citrate

• Nuôi cấy trong ống nghiệm hay trong đĩa với điều kiện kỵ khí

• Đếm tất cả các khuẩn lạc màu đen xuất hiện trong ống/ đĩa

12

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG BÀO TỬ VI SINH VẬT

KỴ KHÍ SINH H2S

14

Cấy 1ml mẫu đã pha loãng 10-1 vào ống

nghiệm 18 x 180 mm

Xử lý nhiệt ở 75-80oC trong 15-20 phút

trong bể điều nhiệt

Đổ khoảng 15ml môi trường ISA đã đun

tan và làm nguội ở 45oCĐể yên cho môi trường đông đặc trong ống Đổ 3-5ml môi trường ISA lên trên mặt ống

nghiệm

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG BÀO TỬ VI SINH VẬT

KỴ KHÍ SINH H2S (tt)

Ủ 37 ± 1oC trong 24 giờ

Đếm tất cả các khuẩn lạc màu đen xuất hiện

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các ống

n: số ống tại mỗi nồng độ (=2)

V: thể tích cấy vào ống (=1)

F: độ pha loãng (10-1)

ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM,

F COLIFORM

• Địng nghĩa

– Coliform là vi khuẩn hình que, gram âm,

thuộc họ Enterobacteriaccae, có khả năng lên men lactose và sinh hơi ở 37oC

16

FEACAL COLIFORM

Định nghiã

- Coliform chịu nhiệt : là coliforms có khả năng lên men lactose và sinh hơi ở 44oC Nhóm này còn được goi là Feacal Coliform giả định

(presumtive F coliform)

- Feacal Coliform (xác nhận) : là Coliform chịu nhiệt có phản ứng indol dương tính Còn được

gọi là E coli giả định (presumtive E coli)

- E coli xác định : là feacal coliform có nghiệm pháp IMViC theo trật tự + + - -

SỰ TƯƠNG QUAN COLIFORM – E COLI

18

ColiformColiform chịu nhiệtFeacal Coliform

E coli

Ý NGHĨA CHỈ TIÊU COLIFORM

• Là vi sinh chỉ thị an toàn vệ sinh thực

phẩm vì:

- Có quan hệ họ hàng gần với các VSV gây bệnh đường ruột

- Luôn đồng hành với các vi sinh vật gây

bệnh đường ruột và VSV gây ngộ độc thực phẩm

- Số lượng cao VSV này trong thực phẩm thì khả năng có mặt của vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao

• Số lượng Coliform giảm dần theo thời

gian trong các sản phẩm đông lạnh

NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP ĐẾM

KHUẨN LẠC

• Phương pháp: đổ đĩa (pour plate)

• Môi trường chọn lọc cho Coliform: chứa

laclose, muối mật, chất nhận dạng sự tạo

thành axít

Trong trường hợp vi khuẩn bị yếu hay tổn thương, phải phục hồi bằng môi trường không chọn lọc, không chứa nguồn carbonhydrate khác (vd TSA)

• Khẳng định khuẩn lạc đã đếm bằng môi

trường lỏng chọn lọc cho Coliform

20

CÁC TRƯỜNG HỢP CẦN PHẢI

KHẲNG ĐỊNH

• Mẫu có hệ VSV gây nhiễu trong môi

trường dành cho Coliform: ví dụ: nước

biển, cá và các sản phẩm của cá, rau quả

Các vi sinh vật gây nhiễu: Aeromomas,

Flavobacterium, Erwinia

• Mẫu có chứa nguồn carbohydrate khác lactose: bánh ngọt, nước ngọt, thực phẩm chứa tinh bột …

MÔI TRƯỜNG

• Violet red bile agar (VRB)

Muối mật số 3 1.5g

Neutral red 0.03g Crystal violet 0.002g

pH 7.4 ±0.2

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS

(PP ĐẾM KHUẨN LẠC)

Cấy 1ml mẫu đã pha loãng 10-1 vào đĩa petri

Đổ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến

45oC, lắc đều

Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 1-2 giờ

Đổ vào 10-15ml VRB đã đun tan và làm nguội

đến 45oC  chờ đông đặcLật ngược và ủ ở 37.0 ± 0.5oC trong 24 - 48 giờ

Chọn và đếm các khuẩn lạc có màu đỏ, đến đỏ

đậm, có quầng tủa muối mật, Φ≥0.5mm

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS (PP

ĐẾM KHUẨN LẠC) (tt)

26

Chọn 5 khuẩn lạc đã đếm cấy sang môi trường

BGBL

Ủ 37.0 ± 0.5oC trong 24 -48 giờ

Tỉ lệ xác nhận R

Số KL sinh hơi trong BGBL

R =

Số KL đã cấy

Tổng số Coliforms (cfu/ g) (C)

N

C = x R

nVf

ĐỊNH LƯỢNG FEACAL COLIFORMS

(PP ĐẾM KHUẨN LẠC)

• Qui trình định lượng F Coliform tương tự qui trình

định Coliform, chỉ khác nhau mấy điểm sau

– Ủ đĩa môi trường VRB ở 44.0 ± 0.5oC trong 24 -48 giờ – Cấy khẳng định vào EC và ủ 44.0 ± 0.5oC trong 24 -48 giờ

– Các khuẩn lạc sinh hơi trên EC được cấy qua môi

trường canh Trypton để thử nghiệm indol

– Khuẩn lạc dương tính khi sinh hơi trên EC và có phản ứng indol dương tính

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS

(PP MPN)

28

Cấy 10ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đôi: 5 ống

Cấy 1ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đơn: 5 ống

Cấy0.1ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đơn: 5 ống

Ủ ở 37.0 ± 0.5oC trong 24-48 giờChọn các ống sinh hơi cấy sang BGBL

Ủ ở 37.0 ± 0.5oC trong 24-48 giờĐếm số lượng ống sinh hơi trong từng dãyTra bảng MPN tương ứng với 5 ống 10ml, 5 ống 1ml, 5

ống 0.1ml Kết quả: MPN/100ml

ĐỊNH LƯỢNG F COLIFORMS

(PP MPN)

Cấy 10ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đôi: 5 ống

Cấy 1ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đơn: 5 ống

Cấy0.1ml mẫu nước vào ống 10ml LSB đơn: 5 ống

Ủ ở 37.0 ± 0.5oC trong 24-48 giờChọn các ống sinh hơi cấy sang EC

Ủ ở 44.0 ± 0.5oC trong 24-48 giờChọn các ống sinh hơi trên EC để cấy sang Endo agar

Ủ ở 37.0 ± 0.5oC trong 24giờ

ĐỊNH LƯỢNG F COLIFORMS

(PP MPN) (tt)

30

Chọn các khuẩn lạc dẹt, có ánh kim, cấy sang

môi trường canh trypton

Ủ 37.0 ± 0.5oC trong 24 giờ

Đếm số lượng ống có vi khuẩn cho phản ứng

indol (+) tương ứng trên mỗi dãy môi trường LSB

Tra bảng MPN tương ứng với 5 ống 10ml, 5 ống

1ml, 5 ống 0.1ml Kết quả: F coliform

(MPN/100ml)

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN, MỐC

ĐẶC ĐIỂM

- Nấm men hay mốc đều kháng kháng sinh

- Khuẩn lạc nấm mốc có dạng sợi, có màu của bào tử

Bào tử, khuẩn ty hay tế bào đơn đều có thể hình

thành khuẩn lạc mới

- Khuẩn lạc nấm men thường to, tròn khô, có

màu trắng đục, tế bào có hình cầu hay hình

trứng.

Có thể tạo bào tử đơn nhân

Chỉ tăng trưởng trong điều kiện hiếu khí

32

ĐẶC ĐIỂM (tt)

• Nhiệt độ thích hợp: 20 - 28oC

• Hoạt tính nước thích hợp: khoảng 85%

Một số loài có thể phát triển trong mẫu có hoạt tính nước 60 - 70%

• Có thể phát triển ở dãi pH 2 – 9, pH thích hợp là 4 - 6.5

VAI TRÒ TRONG THỰC PHẨM

• Nấm mốc có lợi

• Nấm mốc có hại

– Gây hư hỏng thực phẩm: thay đổi mùi vị, màu sắc, kết cấu …

– Tạo độc tố: aflatoxin …

34

DRBC (Dichloran rose bengal chloramphenycol agar): sử dụng cho mẫu có hoạt tính nước cao: sữa, trái cây, rau quả tươi …

Dung dịch khử trùng: Disodium hipocholride 0.4% (dùng để khử trùng trong phân lập nấm mốc)

Dichloran glycerol agar (DG18):

Dichloran rose bengal chloramphenicol

0.025g

CuSO4 5H2O

0.005g Chloramphenicol

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN, MỐC

38

10g mẫu + 90g dd pha loãng (1g pepton trong 1lít

nước), đồng nhất trong 30 giây Nếu là mẫu khô,

ngâm khoảng 30 phút trước khi đống nhất

Pha loãng đến nồng độ phù hợp (10-1, 10-2, 10-3)

Cấy 0.1-0.3ml lên bề mặt môi trường DRBC/DG18, trang đều bằng que tam giác

Ủ ngửa đĩa trong bao PE hở miệng ở 25.0 ±

0.5oC trong 3-4 ngày Đếm tất cả khuẩn lạc nấm men, nấm mốc xuất

hiện trên đĩa Tính kết quả men, mốc

E COLI

• Định nghĩa: Là F coliform có nghiệm pháp

IMViC + +

-– Sống hiếu khí tuỳ nghi trong đường tiêu hoá

của người và động vật

– Tồn tại vô hại trong đường tiêu hoá, có tác

dụng ổn định sinh lý đường ruột

– Đóng vai trò là vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ

sinh thực phẩm và môi trường

– Một số ít dòng của E coli có khả năng gây

bệnh cho người và động vật  enterovirulent

E.coli (EEC)

CÁC DÒNG E COLI GÂY BỆNH

• Hầu hết các dòng gây bệnh đều mang plasmid có chứa các gen gây bệnh

• Các dòng gây bệnh thường gặp

- Enterotoxigenic E coli (ETEC) sình hơi, đau bụng

- Enteropathogenic E coli (EPEC)tiêu chảy ở trẻ em

- Enterohemorrhagic E coli (EHEC)/ Verocytocin E coli (VTEC) hay E coli O157:H7  xuất huyết tiêu hóa

- Enteroinvasive (EIEC)  triệu chứng của bệnh lỵ

- Enteroadherent E coli (EAEC): một dòng gây bệnh mới

40

SỰ PHÂN BỐ CỦA E COLI

– Dễ dàng tìm thấy trong môi trường nước,

đất bị ô nhiễm, phân hay chất thải

– Có thể tồn tại 2-3 tháng trong nước ở nhiệt độ thường

– Trong các thực phẩm đông lạnh số lượng E

coli bị giảm theo thời gian Sau 2 tháng có

thể không tìm thấy E coli trong sản phẩm

ĐỊNH TÍNH E COLI

• Nguyên tắc

– Tăng sinh trong môi trường chọn lọc cho Coliform

ở 44oC Môi trường tăng sinh chọn lọc có thể là

Lauryl Sulphate Broth, Brilliant Green Bile

Lactose Broth, EC Broth …

– Phân lập trên môi trường chọn lọc phân biệt cho F coliform: Eosin Methyl Blue Agar, Endo Agar,

Mac Conkey Agar …

– Khẳng định sinh hoá theo nghiệm pháp IMViC

42

QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH E COLI

44

Lấy 1g (1ml) mẫu vào 10ml môi trường BGBL

Chọn các ống sinh hơi cấy sang Eosin methyl blue agar

Mẫu không sinh hơi được coi là âm tính E coli

Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim tím, đường kính khoảng

1mm để cấy sang TSA hay BHI

E coli trên môi trường Eosin

methyl blue agar

QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH E COLI (tt)

46

Ủ ở 37.0 ± 0.5oC qua đêm

Kết luận: Phát hiện (không phát hiện)

E coli/g

Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm

sinh hoá: Canh trypton (1), MRVP (2), Simmon

Citrate (1) để thử nghiệm pháp IMViC

E coli có biểu hiện sinh hoá: Indol (+), MR

(+), VP (-), Citrate (-) Một trong số các phản

ứng trên sai là không phải E coli

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

• Định nghĩa

– Thuộc họ Microccaceae

– Tế bào có hình cầu, thường tụ thành từng chùm

hay từng đôi

– Sống hiếu khí tuỳ nghi

– Phản ứng catalase, coagulase dương tính

– Phản ứng Oxydase âm tính

– Hầu hết có khả năng tan huyết (95%)

– Có khả năng lên men tạo axit từ mannitol

– Có thể phát triển trong môi trường đến 10%

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

• Hầu hết S aureus đều có thể tạo

protease và lipase ngoại bào

• Một số S aureus có phản ứng coagulase

âm tính

• S intermedius và S hyicus có phản ứng

coagulase dương tính nhưng không cho khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường

Baird Paker agar, không tan máu trên

môi trường thạch máu

SỰ PHÂN BỐ TRONG TỰ NHIÊN

• Thường tìm thấy trên da, tóc hay các nơi ẩm thấp ở người và động vật máu nóng

• Các vết trầy xước hay lở loét là nơi tập trung của S aureus

• Nhiễm vào thực phẩm chủ yếu qua việc chế biến,

sản xuất không hợp vệ sinh

• Phát triển được ở nhiệt độ 10 - 45oC, pH 4.6 – 9.3, tối thích ở 37oC và pH 7

• Cạnh tranh yếu với các VSV khác

• Bị ức chế ở mẫu có hoạt tính nước <86% hay nồng độ nuối 25%

• Enterotoxin được tạo ra ở 15oC, tối đa ở 37oC

• Độc tố bền ở 100oC trong 30 phút 50

ĐỊNH LƯỢNG S AUREUS

• Nguyên tắc

– Cấy lượng mẫu xác định trên môi trường chọn lọc chuyên biệt Ủ ở 37oC

– Các KL đặc trưng trên môi trường chọn lọc

được thử nghiệm phản ứng coagulse

– S aureus có phản ứng coagulase dương tính

làm vón cục huyết tương

ĐỊNH TÍNH S AUREUS

• Nguyên tắc

– Tăng sinh 1g (ml) trong môi trường chọn lọc

cho S aureus trong 24-28 giờ / 37oC

– Mẫu có biểu hiện dương tính được phân lập

trên môi trường chọn lọc

– Khẳng định các khuẩn lạc nghi ngờ bằng

phản ứng coagulase làm ngưng kết huyết

tương

52

54

QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S AUREUS

56

Cấy 0.1-0.3ml dd mẫu đã pha loãng (10-1) lên bề mặt môi trường Baird parker agar, trang đều bằng

que tam giác

Ủ ngược đĩa ở 37.0 ± 0.5oC trong 48 giờ

Đếm số KL đặc trưng (Nt) và số khuẩn lạc không

đặc trưng (Na)

Chuyển ít nhất 5 KL đặc trưng và 5 KL không đặc

trưng sang môi trường TSA

Ủ ở 37.0 ± 0.5oC qua đêm

QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S AUREUS (tt)

Cấy chuyển vào ống chứa 0.3ml huyết tương,

Kết quả: Số S aureus (S cfu/g)

1

S = (NtRt + NaRa)

nVf

Ủ ở 37.0 ± 0.5oC và theo dõi sau 2,4,6,8 giờ Nếu

không có biểu hiện dương tính sẽ ủ tiếp đến 24 giờ Xác định tỉ lệ dương tính Rt (KL đặc trưng) và Ra

(KL không đặc trưng)

QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH S AUREUS

58

Cấy 1g (1ml) vào ống nghiệm chứa 10ml MSB

Ủ ở 37.0 ± 0.5oC trong 24 - 48 giờ

Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang TSA

Ủ ở 37.0 ± 0.5oC trong khoảng 48 giờ

Chọn ống nghiệm dương tính: môi trường chuyển

sang vàng để cấy chuyển sang Baird Parker agar

Mẫu không chuyển vàng là âm tính S aureus

QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH S AUREUS (tt)

60

Cấy chuyển vào ống chứa 0.3ml huyết tương,

Kết quả: S aureus dương tính khi có ngưng kết

huyết tương

Ủ ở 37.0 ± 0.5oC và theo dõi sau 2,4,6,8 giờ Nếu

không có biểu hiện dương tính sẽ ủ tiếp đến 24 giờ

Ủ ở 37.0 ± 0.5oC qua đêm

Kết luận: Phát hiện (không phát hiện) S aureus/g

Coagulase test

• Thuộc họ Enterobacteriaceae, có hình que, gram

âm, không sinh bào tử, sống hiếu khí tuỳ nghi

nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí

• Hầu hết đều có khả năng di động bằng tiên mao

(trừ S.pollurum/galinarum và các thể đột biến)

• Hầu hết có khả năng tạo H2S (trừ S typhi)

• Có khả năng lên men và sinh axít từ glucose,

mannitol nhưng không có khả năng này đối với

lactose, sucrose

• Không tạo indol

• Có khả năng tạo enzym lysine decarboxylase

62

PHÂN LOẠI SALMONELLA

• Có hai loài chính :

– Salmonella enterica: có 6 loài phụ gồm I, II,

IIIa, IIIb, IV, VI Các loài gây bệnh chủ yếu

tập trung trong S enterica I

– Salmonella bongori (V)

– Salmonella II, IIIa, IIIb, IV, VI và V thường

tìm thấy trong động vật máu lạnh Rất hiếm

khi tìm thấy trong động vật máu nóng

– Tên thường gọi: S typhi, S enteritidis … là tên

kiểu huyết thanh