cho những vi sinh vật có kích thước lớn nấm men, tảo... Mục đích: xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật trong mẫu. Nhược điểm: không phân biệt được tế bào sống và chết , dễ nhầm lẫn với các hạt vật thể khác, độ chính xác không cao, không thích hợp cho huyền phù có mật độ thấp. 1.1. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Lựa chọn khu vực đếm hồng cầu trên buồng đếm. Có nhiều loại buồng đếm khác nhau như Goriaep, Thomacho những vi sinh vật có kích thước lớn nấm men, tảo... Mục đích: xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật trong mẫu. Nhược điểm: không phân biệt được tế bào sống và chết , dễ nhầm lẫn với các hạt vật thể khác, độ chính xác không cao, không thích hợp cho huyền phù có mật độ thấp. 1.1. Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Lựa chọn khu vực đếm hồng cầu trên buồng đếm. Có nhiều loại buồng đếm khác nhau như Goriaep, Thoma
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT I Phương pháp truyền thống Phương pháp đếm trực tiếp - Áo dụng cho vi sinh vật có kích thước lớn nấm men, tảo - Mục đích: xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật mẫu - Nhược điểm: không phân biệt tế bào sống chết , dễ nhầm lẫn với hạt vật thể khác, độ xác khơng cao, khơng thích hợp cho huyền phù có mật độ thấp 1.1 Đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu - Lựa chọn khu vực đếm hồng cầu buồng đếm Có nhiều loại buồng đếm khác Goriaep, Thoma, Neubauer Smic., có đặc điểm chung đếm hồng cầu đếm khu vực (5 vng lớn), khu vực bốn góc khu vực buồng đếm Mỗi khu vực đếm gồm 16 ô vng nhỏ Bằng vật kính x 40, đếm tất hồng cầu nằm gon khu vực ô vuông lớn hồng cầu nằm cạnh ô vuông lớn - Khi thực quan sát đếm vi sinh vật, cho thêm vài giọt formalin vào mẫu, trộn Pha loãng mẫu dung dịch pha loãng 0,1% peptone 0,1% laurylsulphate 0,01% methyl blue cho ô nhỏ buồng đếm chứa từ 10 tế bào - Mật độ tế bào huyền phù mẫu là: N/ml = 0,25a × 106 tế bào/ml Trong a số tế bào bình quân ô vuông lớn 1.2 Đếm trực tiếp buồng đếm Breed - Rất hữu ích việc đếm tổng số vi sinh vật vật phương pháp đếm trực tiếp Buồng đếm Breed có vùng diện tích 1cm2 đánh dấu - Dùng bơm tiêm hay que cấy vòng cho khoảng 0,01ml mẫu cần đếm vào vùng , sấy khô lửa sau nhuộm với methyl blue - Khi đếm cho dầu nhúng lên diện tích vùng cần đếm Mật độ vi sinh vật là: N/ml = 4a × 104/ π d2 Trong a số tế bào vùng đếm, d đường kính vùng đếm 1.3 Đếm trực tiếp kính hiển vi huỳnh quang - Ưu điểm: ước đoán số lượng thật loài vi sinh vật khác diện mẫu ; phản ánh sinh khối vi sinh vật - Mục đích: xác định trực tiếp vi sinh vật kính hiển vi huỳnh quang cách nhuộm phát huỳnh quang khác acridin cam (AODC), 4',6dianidino-2-phenyl-indol (DAPI), fluorescein isothiocyanate (FITC) Phương pháp đếm khuẩn lạc - Mục đích: Xác định số lượng tế bào vi sinh vật, sống diện mẫu Tế bào sống tế bào có khả phân chia tạo thành khuẩn lạc môi trường chọn lọc - Nhược điểm: dễ cho sai số lớn nên cần thực lặp lại hai đĩa Do khả nhiều tế bào hình thành chung khuẩn lạc nên số đếm khuẩn lạc không thiết trùng lặp với số tế bào ban đầu đưa lên môi trường nên kết đếm mật độ tế bào thường trình bày số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml thay số tế bào/ml Đây phương pháp tốt để xác định tế bào sống Pha loãng mẫu theo dãy thập phân Mẫu pha loãng thành dãy nồng độ thập phân 1/10, 1/100, 1/1000 Mỗi bậc pha loãng 1/10 thực cách dùng 1ml mẫu ( dung dịch có độ pha lỗng trước đó) thêm vào ml nước môi trường ống nghiệm Sau lắc kĩ độ pha lỗng 1/10 Có thể tiến hành Có thể tiến hành thể tích khác, ví dụ 0,5 ml + 4,5 ml ống nghiệm 0,1 ml + 0,9 ml ống Eppendorf 3 Phương pháp MPN (Most Probable Number) - Phương pháp MPN ( phương pháp có số xác suất cao nhất, số tối khả) gọi phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ Đây phương pháp dùng để xác định số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn diện đơn vị thể tích mẫu Đây phương pháp định lượng dựa kết định tính hàng loạt thí nghiệm lặp lại độ pha loãng khác - Quy trình định lượng: Cho vào ống nghiệm có chứa mơi trường thích hợp cho tăng trưởng đối tượng vi sinh vật cần định lượng cho thể tích dung dịch mẫu xác nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp Ủ nhiệt độ thời gian thích hợp Dựa vào biểu ống nghiệm sinh hơi, đổi màu, đục, Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính độ pha loãng Sử dụng số liệu tra bảng Mac Crady suy mật độ vi sinh vật trình bày dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu II Phương pháp miễn dịch sinh học phân tử Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) - Mục đích: để xác định có mặt kháng ngun mục tiêu kháng thể mục tiêu có mặt mẫu phân tích - Nguyên tắc kỹ thuật: sử dụng kháng thể đơn dòng (kháng thể sơ cấy) phủ bên ngồi đĩa giếng nhằm mục đích thu giữ kháng nguyên mục tiêu Các kháng nguyên thu giữ phát cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn enzyme phát tín hiệu horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase Khi bổ sung chất đặc hiệu enzyme vào giếng enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chất để tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi đổi màu, phát định lượng kháng ngun - Mơ hình ELISA sandwich Phương pháp lai phân tử (Hibridization) - Phương pháp sử dụng mẫu dò - Mục đích: phát vi sinh vật thực phẩm dựa phát đoạn gen đặc trưng vi sinh vật - Cở sở phương pháp sử dụng mẫu dò q trình lai phân tử - Quá trinh bao gồm tách rời hai mạch đôi chuỗi xoắn kép DNA nhiệt độ vượt nhiệt độ nóng chảy (Tm) phân tử DNA tái bắt cặp đoạn DNA có trình tự nucleotide bổ sung nhiệt độ bình thường trở lại Một hai mạch DNA bổ sung (gọi DNA mục tiêu - DNA tế bào vi sinh vật) cố định giá thể rắn nằm tế bào hay mơ) Sự lai phân tử xảy DNA RNA Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố: nồng độ DNA môi trường, nhiệt độ thời gian phản ứng, kích thước trình tự lai lực ion mơi trường Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) - phương pháp in vitro - Mục đích: nhận biết phát đoạn gen cụ thể đoạn gen - Ứng dụng: để phát hiện, tạo đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát mầm bệnh vi sinh vật có thực phẩm - Phương pháp PCR phương pháp tổng hợp DNA dựa khuôn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA Tất enzyme polymerase cần mồi chuyên biệt để tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn + Mạch khn thường trình tự DNA gen ( gọi trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu + Mồi đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn nhờ hoạt động enzyme polymerase đoạn nối dài hình thành mạch + Đoạn DNA nằm hai mồi khuếch đại thành số lượng đến mức thấy sau nhuộm ethidium bromide thu nhận đoạn DNA cho mục đích tái thao tác gen - Phản ứng PCR gồm nhiều chu kì lặp lại khác Mỗi chu kỳ gồm có bước ... phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ Đây phương pháp dùng để xác định số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn diện đơn vị thể tích mẫu Đây phương pháp định... tiếp kính hiển vi huỳnh quang - Ưu điểm: ước đoán số lượng thật loài vi sinh vật khác diện mẫu ; phản ánh sinh khối vi sinh vật - Mục đích: xác định trực tiếp vi sinh vật kính hiển vi huỳnh quang... dụng số liệu tra bảng Mac Crady suy mật độ vi sinh vật trình bày dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu II Phương pháp miễn dịch sinh học phân tử Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)