Đang tải... (xem toàn văn)
Vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae,Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii, and Pseudomonas nitroreducens. Các loài này phần lớn thuộc nhóm vi sinh vật kị khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn. Vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae,Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii, and Pseudomonas nitroreducens. Các loài này phần lớn thuộc nhóm vi sinh vật kị khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn.
Sàng lọc vi sinh vật phân rã rơm lúa hoạt động enzyme cellulase chúng GVHD: Phan Thị Huyền Võ Thị Tú Như 1512369 Trần Thị Loan Anh 1510110 Lương Đình Hồn 1511101 Huỳnh Hải Danh 1510396 Nguyễn Thị Phương Thủy 1513368 RƠM LÚA Cấu tạo Chứa khoảng 39% cellulose, 27% hemicellulose 12% lignin Cellulose hemicellulose Khi thủy phân chất hóa học hay enzym, biến đổi thành glucose đường lên men đc để sản xuất etanol 22% CELLULOSE Cấu tạo Thành phần tế bào bền chắc, bao bọc tế bào thực vật Trên quy mơ tồn cầu, thực vật tạo khoảng 100 tỷ cellulose năm Cellulose polymer -Dglucose Phân tử Cellulose không phân nhánh Các phân tử cellulose nằm song song liên kết với nhóm hydroxyl 22% CELLULASE Cấu tạo Cơ chế tổng quát đề xuất phản ứng thủy phân cellulose phức hệ enzyme C1: Exocellulase; Cx: Endocellulase 22% Cellulase enzym đa cấu tử gồm: exoglucanase hay C1 (EC 3.2.1.91), endoglucanase hay Cx (EC 3.2.1.4) β-glucosidase (EC 3.2.1.21) hoạt động phối hợp để thủy phân cellulose thành glucose Cellulase ứng dụng để cải thiện gía trị dinh dưỡng thức ăn gia súc, gia cầm; chế biến thực phẩm; trích ly chất từ thực vật, từ thuốc; đường hóa phế liệu giàu cellulose để sản xuất ethanol Một số vi sinh vật phân rã rơm lúa Vi khuẩn Vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae,Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii, and Pseudomonas nitroreducens Các lồi phần lớn thuộc nhóm vi sinh vật kị khí, chúng phân lập chủ yếu từ ruột loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn 22% Một số vi sinh vật phân rã rơm lúa Xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi nấm Chúng vi sinh vật hiếu khí có mặt khắp nơi tự nhiên ADN xạ khuẩn giàu G+C chiếm 57-75 % [22] Chúng chiếm ưu đất phèn khơ [23] Xạ khuẩn biết đến nhiều sản phẩm chuyển hóa bậc hai, bật loại kháng sinh streptomycin, gentamicin, rifamycin erythomycin Ngồi ra, xạ khuẩn có vai trò quan trọng công nghiệp dược phẩm nông nghiệp Streptomyces giống chủ đạo xạ khuẩn, vi sinh vật sản sinh cellulase quan tâm nghiên cứu Một số loài đáng ý thuộc giống Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces lividans Thermoactimnomyces tìm thấy trầm tích đại dương, Streptosporangium quặng apatit lồi có khà phân hủy cellulose 22% Một số vi sinh vật phân rã rơm lúa Nấm Nấm sinh vật có chế sinh hóa độc đáo phân giải chất tạo sản phẩm bậc hai đặc biệt, nhóm nghiên cứu nhiều lĩnh vực phân hủy cellulose [30] Các cellulase từ nấm thường có hoạt lực cao dường khơng có dạng vật lý phức tạp enzyme từ vi khuẩn Acremonium spp., Chaetomium spp., Trichoderma reesei, Trichoderma viride, penicillium pinophilum, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng quy trình phân hủy cellulose nhiều mơi trường khác [7, 30] 22% Một số vi sinh vật phân rã rơm lúa Bacillus sp Bacillus sp 22% PA1: Serratia sp PA2: Pseudomonas sp PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Chọn mẫu để bắt đầu sàng lọc 10g Mỗi mẫu pha loãng lấy 0,1ml truyền NA 0,1% mẫu cellulose agar hay 2% rơm agar nước Ủ 3-5 ngày 37°C thải Thu thập khuẩn lạc nấm đất Vi khuẩn nằm rải rác ổn định môi trường thạch Sàng lọc vi khuẩn phân hủy cellulose 90ml NaCl Vortex 0.85% phút 22% PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Chuẩn bị enzyme thơ Một vòng lặp vi khuẩn phân lập cấy 25 ml môi trường 0,1% cellulose, ủ 24 37 o C, 150 vòng / phút Dịch tế bào đo OD 600 điều chỉnh tới OD 600 = 0,1, sau ml dung dịch tế bào điều chỉnh tiêm vào 45 ml môi trường 0,1% cellulose ủ 24 37 oC, 150 vòng / phút 10 ml dung dịch tế bào ly tâm 10 phút 4°C với 5.000 vòng / phút Dịch chứa enzym thô sử dụng để khảo sát hoạt động cụ thể enzyme 22% Phân tích hoạt động cụ thể cellulase 10 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Tổng lượng protein enzym thô xác định phương pháp Lowry nồng độ protein (mg / ml) sau sử dụng để tính tốn hoạt độ cụ thể (UI / mg protein) Các enzyme thô sau kiểm tra khả thủy phân chất sau: Giấy lọc 1x1cm (Whatman No.1), 1% carboxymethyl cellulose (1% CMC) 0,1% cellobiose 22% Khảo nghiệm hoạt động cụ thể cellulase 11 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Tất chất phân tán dung dịch đệm natri acetate 0,2 M pH Mỗi phản ứng chuẩn bị ủ 30°C 50°C cách trộn ml enzym thô với ml đệm, ủ sử dụng giấy lọc chất 10 phút CMC cellobiose sử dụng làm chất Giảm đường đo phương pháp Somogyi-Nelson (Nelson, 1944) (cho giấy lọc CMC) phương pháp DNS (Miller, 1959) (cho cellobiose) Các hoạt động enzyme báo cáo đơn vị UI/ ml enzym thô 22% Khảo nghiệm hoạt động cụ thể cellulase 12 Tuyển chọn loại vi sinh vật sinh tổng hợp từ cellulose Từ tám mẫu thử ( chất bẩn nước thải ): + 11 chủng vi khuẩn ( BC1-11) chủng vi nấm ( FC1-9) tìm thấy 0.1% cellulose agar ( nguồn carbon lấy từ cellulose ) + 19 chủng vi khuẩn (BR1-19) 20 chủng vi nấm ( FR1-20) phát 2% RƠM agar ( rơm qua tiền xử lý ) Do đó, tổng số chủng 59, 30 chủng vi khuẩn 20 chủng vi nấm Những chủng lựa chọn để nghiên cứu sâu hoạt tính phân hủy cellulase chúng 22% 13 Khảo sát hoạt tính thủy phân cellulase với nhiều chất khác Summary of bacteria (B) or fungi (F) isolates with high specific activity of filter paper cellulase 0.04 (FPase) 0.03 0.03 0.03 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 FR9 BR4 0.01 0.01 FR14 BR15 BR11 22% Hoạt tính giấy lọc ( Hoạt tính FPase ) Chúng ta đo hoạt tính enzyme thủy phân giấy lọc Đối tượng enzyme exoglucanase Vàiđều chủng vi khảo sinh vật Tất chủng sát cho hoạtthấy tính hoạt tính FPaseendoglucanase cao 30 độ C exoglucanase, beta-vài cho thấy hoạtCác tínhchất caonền 50được độ C glucosidase sử dụng : giấy lọc ( whatman No.1 ), Carboxymethy Tuy nhiên,vànhìn chung hoạt tính cellulose Cellobiose chủng giấy lọc tương đối thấp, hoạt tính trung bình vi khuẩn 0,0049 unit/mg protein với nấm 0,0041 unit/mg protein 14 Khảo sát hoạt tính thủy phân cellulase với nhiều chất khác Hoạt tính CMCase Cellobios Việc tuyển chọn thực 0,1% cellulose agar (C) 2% rơm agar (R) 30 độ C 50 độ C Chủng FR14 BR14 có hoạt tính cao 30 độ C, BR15, BR11 FR9 có hoạt tính cao 50 độ C Các chất ''carboxylmethyl cellulase'' ( CMCase) ''cellobiase'' cho ta thấy hoạt tính endoglucanase beta-glucosidase theo thứ tự Một vài chủng VSV có hoạt tính thủy phân cellulose nhiệt độ thấp ( 30C) vài chủng cho hoạt tính cao ơn nhiệt độ cao ( 50C) Chủng có hoạt tính 22% 15 Khảo sát hoạt tính thủy phân cellulase với nhiều chất khác Hoạt tính CMCase Cellobios Chủng vi khuẩn hướng tới việc tổng hợp nhiều enzyme thủy phân cellulose enzyme thủy phân carboxymethyl cellulose hydrolyzing enzymes (CMC), chủng nấm lại có khả tổng hợp số lượng lớn enzymes chủng vi khuẩn Một vài nấm có khả tổng hợp CMCase cellobiase, vài nấm khác có tể tổng hợp hai loại enzymes mức độ giống Hoạt tính CMCase cellobiase trung bình chủng vi khuẩn 0.06 chủng nấm 0,062 unit/mg protein Chủng có hoạt tính 22% 16 Kết luận Áp dụng enzyme cellulolytic phân hủy vật liệu lignocellulosic cần điều phối hoạt động loại xenlulaza khác Như vậy, có cách thực từ việc sử dụng enzym phân lập nghiên cứu - Cách thứ chọn chất phân lập với phạm vi hoạt động riêng cao cá nhân enzyme sử dụng chúng kết hợp giống - Cách khác sử dụng chất phân lập sản xuất nhiều loại enzyme khác nhau, vấn đề điều kiện tăng trưởng tối ưu chất phân lập cách tránh đồng lên men Các hoạt động cụ thể xenlulaza khảo sát nghiên cứu thấp so với nghiên cứu khác báo cáo Tuy nhiên, sản xuất cellulase từ phân lập phải tối ưu hoá điều kiện khác để tăng cường xenluloza suy thối làm cho chúng hữu ích cho ứng dụng khác 22% 17 Kết luận Sàng lọc vi sinh vật cellulolytic từ rơm rạ nghiên cứu Có 29 vi khuẩn phân lập 30 loài nấm phân lập nghiên cứu hoạt động xenlulit Phân lập FR14 cho thấy hoạt động đặc biệt với cellulase lọc giấy cao (FPase) với 0,032 đơn vị protein / mg protein, FR4 cao nhất, Hoạt tính CMCase đặc hiệu với 0,5 đơn vị protein / mg Tốc độ tăng trưởng FC1 với 0.6 đơn vị protein / mg Sản xuất Cellulase từ phân lập phải tối ưu hoá điều kiện khác 22% 18 ... yếu từ ruột loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn 22% Một số vi sinh vật phân rã rơm lúa Xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi nấm Chúng vi sinh vật hiếu khí có... có khà phân hủy cellulose 22% Một số vi sinh vật phân rã rơm lúa Nấm Nấm sinh vật có chế sinh hóa độc đáo phân giải chất tạo sản phẩm bậc hai đặc biệt, nhóm nghiên cứu nhiều lĩnh vực phân hủy... làm cho chúng hữu ích cho ứng dụng khác 22% 17 Kết luận Sàng lọc vi sinh vật cellulolytic từ rơm rạ nghiên cứu Có 29 vi khuẩn phân lập 30 loài nấm phân lập nghiên cứu hoạt động xenlulit Phân lập