Phân lập, tuyển chọn các chủng sinh tổng hợp protease từ nấm ký sinh côn trùng

1 tr-ờng đại học vinh khoa hoá học đồ án tốt nghiệp Tên đề tài: Phân lập, tuyển chọn chủng sinh tổng hợp protease từ nấm ký sinh côn trùng Giỏo viờn hng dn : ThS Đào Thị Thanh Xuân Lê ánh TuyÕt Sinh viên thực : Lớp : 47K - Hóa Vinh, tháng 10 năm 2010 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới ThS Đào Thị Thanh Xuân, giảng viên khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh ln tận tình hướng dẫn, động viên em suốt trình nghiên cứu hoàn thành đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn TS Trần Đình Thắng, Trưởng môn Công nghệ Thực phẩm, cô giáo Hồ Thị Hải n - cán hướng dẫn thí nghiệm Phịng Cơng nghệ Thực phẩm, thầy Phịng hóa hữu cơ, Phịng hóa vơ Trung tâm kiểm định chất lượng thực phẩm Trường Đại học Vinh tạo điều kiện tận tình giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu hồn thành đồ án tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn đến bạn lớp 47K Công nghệ Thực phẩm 49K Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Vinh, người bên tôi, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi học tập, nghiên cứu hồn thành đồ án Và sau cùng, xin gửi lời cảm ơn vơ hạn đến gia đình người thân, người sinh thành, dưỡng dục nuôi dạy nên người Vinh, ngày tháng năm 2010 Sinh viên thực Lê Ánh Tuyết MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH SÁCH HÌNH VẼ iv DANH SÁCH BẢNG BIỂU v DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU vii CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 T ng quan nấm k sinh côn trùng 1.1.1.Giới thiệu chung nấm k sinh côn trùng 1.1.2.Cơ chế tác động c a nấm lên thể côn trùng 1.1.3 ng dụng c a nấm k sinh côn trùng 1.1.4 Tình hình nghiên cứu nấm k sinh trùng Việt Nam giới 1.2 T ng quan enzyme 10 1.2.1 Giới thiệu enzyme 10 1.2.2 Giới thiệu protease 12 1.2.2.1 Giới thiệu chung protease 12 1.2.2.2 Lịch sử nghiên cứu protease 13 1.2.2.3 Phân loại protease 16 1.2.2.4 Nguồn thu protease 16 1.2.2.5 Các yếu tố hóa l ảnh hưởng đến q trình sinh t ng hợp protease 20 1.2.2.6 ng dụng c a protease 23 CHƯƠNG NGU N LI U V PHƯƠNG PHÁP NGHI N C U 26 2.1 Quy trình nghiên cứu 26 2.2 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phương pháp chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, môi trường lên men 27 2.3.2 Phương pháp nhân sinh khối 29 2.3.3 Phương pháp tuyển chọn ch ng có khả sinh t ng hợp protease cao 33 2.3.4 Phương pháp xác định hoạt độ protease 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHI N C U V THẢO LUẬN 36 3.1 Nghiên cứu phân lập ch ng sinh t ng hợp protease từ tập hợp ch ng thuộc chi Beauveria 36 3.1.1 Phân lập ch ng sinh t ng hợp protease phương pháp xác định vòng th y phân đĩa thạch 36 3.1.2 Phân lập ch ng sinh t ng hợp protease phương pháp xác định hoạt độ theo Anson cải tiến 39 3.2 Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng c a số môi trường khác đến khả sinh t ng hợp protease 41 3.2.1 Nghiên cứu khả sinh t ng hợp protease môi trường MT2 41 3.2.2 Nghiên cứu khả sinh t ng hợp protease môi trường MT3 43 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng c a nguồn dinh dưỡng cacbon đến khả sinh t ng hợp protease 44 3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng c a nguồn dinh dưỡng cacbon maltose đến khả sinh t ng hợp protease 44 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng c a nguồn dinh dưỡng cacbon lactose đến khả sinh t ng hợp protease 45 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng c a nguồn dinh dưỡng cacbon fructose đến khả sinh t ng hợp protease 46 3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng c a nguồn dinh dưỡng cacbon sacarose đến khả sinh t ng hợp protease 47 KẾT LUẬN 48 T I LI U THAM KHẢO 49 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình 1.2: Hình 1.3: Hình 1.4: a Cordyceps gracile, b Cordyceps sinensis a B bassiana ve sầu, b Beauveria sp bọ cánh cứng a.Các bào tử c a nấm Beauveria sp., b Beauveria bassiana Chu trình xâm nhiễm c a nấm k sinh trùng Hình 1.5: Một số hình ảnh nấm trùng k sinh rệp sáp Vườn Quốc gia Cát Tiên Hình 1.6: Cấu trúc khơng gian c a protease 12 Hình 1.7: Nguồn thu protease từ thực vật 16 Hình 1.8: Nguồn thu protease từ vi sinh vật 18 Hình 2.1: Các ch ng phát triển MTcb 30 Hình 3.1: Vịng thuỷ phân protein c a ch ng VN1359 môi trường agar-agar casein 35 Hình 3.2: Vịng thuỷ phân protein c a ch ng VN1482 môi trường agar-agar casein 36 Hình 3.3: Vịng thuỷ phân protein c a ch ng VN1485 môi trường agar-agar casein 36 Hình 3.4: Vịng thuỷ phân protein c a ch ng VN1493 môi trường agar-agar casein 36 Hình 3.5: Vịng thuỷ phân protein c a ch ng VN1640 môi trường agar-agar casein 37 Hình 3.6: Vịng thuỷ phân protein c a ch ng VN1641 môi trường agar-agar casein 37 Hình 3.7 : Đường chuẩn tyrosine 38 Hình 3.8: Ảnh hưởng c a mơi trường MT2 đến khả sinh t ng hợp protease c a ch ng 41 Hình 3.9: Ảnh hưởng c a môi trường MT3 đến khả sinh t ng hợp protease c a ch ng 42 Hình 3.10: Ảnh hưởng c a nguồn cacbon maltose đến khả sinh t ng hợp protease c a ch ng 44 Hình 3.11: Ảnh hưởng c a nguồn cacbon lactose đến khả sinh t ng hợp protease c a ch ng 45 Hình 3.12: Ảnh hưởng c a nguồn cacbon fructose đến khả sinh t ng hợp protease c a ch ng 46 Hình 3.13: Ảnh hưởng c a nguồn cacbon sacarose đến khả sinh t ng hợp protease c a ch ng 47 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Lịch sử kết tinh số proteaza 14 Bảng 1.2: Bảng tóm tắt số nấm mốc có khả sinh t ng hợp mạnh protease 18 Bảng 3.1: Hoạt độ protease đo c a 15 ch ng ngày thứ 4, 5, 39 Bảng 3.2: Hoạt độ protease đo c a ch ng môi trường MT2 40 Bảng 3.3: Hoạt độ protease đo c a ch ng môi trường MT3 42 Bảng 3.4: Hoạt độ protease đo c a ch ng môi trường sử dụng nguồn cacbon maltose 43 Bảng 3.5: Hoạt độ protease đo c a ch ng môi trường sử dụng nguồn cacbon lactose 44 Bảng 3.6: Hoạt độ protease đo c a ch ng môi trường sử dụng nguồn cacbon fructose 45 Bảng 3.7: Hoạt độ protease đo c a ch ng môi trường sử dụng nguồn cacbon sacarose 46 DANH MỤC CÁC KÝ HI U, CHỮ CÁI VIẾT TẮT CRABTA – VU : Centre research and biology technology apply Vinh University EPF : Entomology pathogenic fungi PDA: Potato Dextrose Agar YPG : Yeast Pepton Gluco TE : Tyrosine equivalent LỜI MỞ ĐẦU 1.1 Lý chọn đề tài Ngày nay, công nghệ sinh học trở thành ngành khoa học mũi nhọn, có tác động to lớn, góp phần nâng cao cải thiện đời sống người Không cung cấp sản phẩm cần thiết cho sống, đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng hay điều trị bệnh cho người, động vật, thực vật, công nghệ sinh học cho ta chế phẩm hữu hiệu làm hạn chế ô nhiễm môi trường – vấn đề nóng bỏng cấp thiết Trong năm gần đây, ngành công nghệ sinh học có nhiều bước đột phá mới, mang lại lợi ích kinh tế to lớn cho quốc gia Vì vậy, cơng nghệ sinh học nhận ưu tiên đầu tư lớn cho nghiên cứu kế hoạch mang tính ứng dụng Một lĩnh vực quan tâm nhiều c a ngành công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme, có protease Protease enzyme sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác công nghiệp, nông nghiệp, y học, nghiên cứu khoa học…, chiếm đến 60% lượng enzyme sử dụng giới Trước đây, phần lớn protease thu từ nội tạng động vật, thực vật, ngày dần thay protease thu từ vi sinh vật Có thể nói vi sinh vật nguồn nguyên liệu thích hợp để sản xuất enzyme quy mơ lớn nguồn ngun liệu rẻ tiền, phong phú dễ tìm kiếm Nguồn thu protease từ vi sinh vật ch yếu vi khuẩn, nấm xạ khuẩn, nấm k sinh trùng nguồn nguyên liệu mới, nhận nhiều quan tâm c a nhà nghiên cứu Nấm k sinh trùng (EPF) nhóm đặc biệt giới nấm, khơng có tính đa dạng sinh học cao mà cịn có vai trị quan trọng nhiều lĩnh vực, đặc biệt phòng trừ sâu hại trồng y dược Theo nghiên cứu, phần lớn số lồi nấm trùng ghi nhận châu Á, đó, Thái Lan có số lượng ch ng loại phong phú với 400 lồi nấm kí sinh trùng (Morakot, 2003), nhiên chưa có cơng bố thức đa dạng phân bố c a nhóm nấm nước khu vực, đặc biệt Việt Nam Thực tế nước ta, chế phẩm enzyme hầu hết phải nhập từ nước ngồi có giá thành cao nên việc ứng dụng chế phẩm enzyme sản xuất chưa rộng rãi Do vào nguồn nguyên liệu điều kiện có Việt Nam, hướng dẫn c a ThS Đào Thị Thanh Xuân, chọn đề tài " Phân lập, tuyển chọn chủng sinh tổng hợp protease từ nấm ký sinh côn trùng " từ góp phần chọn ch ng điều kiện thích hợp cho q trình tách – tinh chế protease từ nấm k sinh côn trùng sau Mục đích nghiên cứu Đề tài nghiên cứu tiến hành nhằm mục đích : - Phân lập, tuyển chọn ch ng nấm thuộc chi Beauveria có khả sinh t ng hợp protease - Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh t ng hợp protease môi trường dịch thể - Xác định ch ng điều kiện tối ưu để trình tách - tinh chế protease thu hiệu suất cao Đối tượng, phạm vi nội dung nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Các ch ng thuộc chi Beauveria nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Vinh (CRABTA – VU) thu thập mặt đất c a rừng nguyên sinh thuộc Vườn Quốc gia Pù Mát – Nghệ An từ tháng 07 năm 2008 3.2 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành phịng thí nghiệm Cơng nghệ Thực phẩm, khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh thời gian từ tháng năm 2010 đến tháng 12 năm 2010 3.3 Nội dung nghiên cứu Đề tài tiến hành với nội dung sau : - Phân lập, tuyển chọn ch ng nấm thuộc chi Beauveria có khả sinh t ng hợp protease phương pháp định tính định lượng - Đánh giá khả sinh t ng hợp protease c a ch ng nấm thuộc chi Beauveria môi trường khác sau 3, 4, 5, 6, ngày ni, từ lựa chọn mơi trường thích hợp - Thay nguồn dinh dưỡng cacbon glucose đường maltose, lactose, fructose sacarose, xác định nguồn dinh dưỡng cacbon thích hợp cho ch ng 10 - Từ ch ng tuyển chọn sơ bộ, lựa chọn ch ng có hoạt tính cao xác định thời điểm thu nhận tối thích nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho trình nghiên cứu Ý nghĩa thực tiễn đề tài Kết c a đề tài tạo tiền đề cho nghiên cứu sâu enzyme từ ch ng nấm thuộc chi Beauveria sau 49 lượng axit amin tạo thành phản ứng th y phân phản ứng màu với thuốc thử Folin, dung dịch phản ứng có màu xanh da trời, đo cường độ màu c a dung dịch bước sóng λ = 656 – 670 Dựa vào đồ thị đường chuẩn tyrosine để tính lượng sản phẩm tương ứng enzyme xúc tác tạo nên Đơn vị hoạt độ lượng enzyme chuyển hóa lượng casein thành dạng khơng bị kết t a axit TCA tương đương với Micromol tyrozine 300C thời gian phút Từ dung dịch Tyrosine chuẩn 1μM/l, xây dựng đường chuẩn với dung dịch tyrosine có nồng độ từ 0,2 – 3,0μM/l, kết thu đường chuẩn tyrosine sau: Hình 3.7 : Đ ờng chuẩn tyrosine Các ch ng nuôi lắc MT1 (mơi trường YPG b sung khống chất), điều kiện pH – 7,5, nhiệt độ 300C với tốc độ lắc 180vòng/phút, tiến hành thu dịch lọc canh trường đo hoạt lực protease vào ngày thứ 4, Kết thể bảng sau : 50 Bảng 3.1: Hoạt độ protease đo 15 chủng ngày thứ 4, 5, Hoạt độ protease (U/ml) Ngày Chủng Vn1359 0,21 0,26 0,24 Vn1476 0,02 0,05 0,04 Vn1478 0,01 0,03 0,021 Vn1482 0,28 0,39 0,38 Vn1485 0,07 0,18 0,17 Vn1492 0,04 0,07 0,06 Vn1493 0,15 0,21 0,19 Vn1640 0,13 0,22 0,21 Vn1641 0,32 0,34 0,31 Vn1664 0,009 0,02 0,01 Vn1677 0,007 0,01 0,01 Vn1681 0,01 0,02 0,013 Vn1702 0,01 0,04 0,02 Vn1727 0,005 0,01 0,009 Sv 0,003 0,009 0,01 Dựa vào bảng kết ta thấy giống kết phân lập phương pháp xác định vòng th y phân đĩa thạch, xác định hoạt độ Anson cải tiến xác định ch ng có hoạt tính VN1359, VN1482, VN1485, VN1493, VN1640 VN1641 có khả sinh t ng hợp protease Cũng phương pháp ta xác định hoạt độ protease thời điểm khác để xác định thời điểm sinh t ng hợp protease Kết cho thấy thời điểm sau ngày nuôi cấy cho hoạt độ protease cao ch ng 51 3.2 Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng số môi trường khác đến khả sinh tổng hợp protease Trên môi trường phân lập MT1 (mơi trường YPG b sung khống chất) ta tìm ch ng VN1359, VN1482, VN1485, VN1493, VN1640 VN1641 có hoạt tính protease Do ta chọn ch ng để tiến hành nghiên cứu Đối với vi sinh vật, khả sinh t ng hợp protease thay đ i nhiều tùy thuộc vào môi trường Hơn môi trường ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ dạng protease t ng hợp tính chất c a chúng Do ta cần chọn mơi trường để q trình lên men cho protease có hoạt lực cao Mơi trường MT1 mơi trường có đầy đ nguồn dinh dưỡng nitơ, cacbon khống, casein mơi trường đóng vai trị chất, nhiên chưa môi trường tốt cho trình sinh t ng hợp protease c a ch ng Vì nghiên cứu tiếp theo, ta tiến hành khảo sát số loại mơi trường khác để tìm mơi trường tốt cho trình sinh t ng hợp protease Tiến hành nuôi ch ng môi trường MT2 (glucose b sung khoáng – 7,5, nhiệt độ 300C với tốc casein) MT3 (khoáng casein) điều kiện pH độ lắc 180 vòng/phút, sau ngày thu dịch lọc canh trường tiến hành đo hoạt độ protease để so sánh khả sinh t ng hợp protease 3.2.1 Nghiên cứu khả sinh tổng hợp protease mơi trường MT2 (glucose, khống c chất) Các ch ng nuôi cấy môi trường MT2, sau 3, 4, 5, 6, ngày nuôi tiến hành lấy mẫu đo hoạt lực protease phương pháp Anson cải tiến Kết thể bảng sau : Bảng 3.2 : Hoạt độ protease đo chủng môi trường MT2 Hoạt độ protease (U/ml) Chủng Ngày Vn1359 0,14 0,16 0,35 0,34 0,32 Vn1482 0,31 0,34 0,53 0,52 0,35 Vn1485 0,08 0,12 0,21 0,2 0,19 Vn1493 0,09 0,14 0,23 0,22 0,18 Vn1640 0,11 0,16 0,24 0,23 0,21 Vn1641 0,3 0,31 0,36 0,35 0,31 52 Hình 3.8 : Ảnh h ng c môi tr ờng MT2 sinh tổng hợp prote se c n ch ng Từ kết cho thấy, môi trường MT2 mơi trường glucose b sung khống chất, khả sinh t ng hợp protease c a ch ng ngày đầu cao Sau ngày hoạt độ protease c a ch ng đạt cao cao so với môi trường MT1, đặc biệt với ch ng VN1482 hoạt độ protease 0,53 (U/ml) cao gấp gần 1,5 lần hoạt độ đạt môi trường MT1 Điều giải thích mơi trường MT2 mơi trường có nguồn dinh dưỡng cacbon glucose có b sung khống chất, casein lúc vừa đóng vai trị chất vừa nguồn dinh dưỡng nitơ, để có nguồn dinh dưỡng nitơ để sinh trưởng phát triển vi sinh vật cần phải sinh t ng hợp protease nhằm th y phân casein thành axit amin 3.2.2 Nghiên cứu khả sinh tổng hợp protease mơi trường MT3 (khống c chất) Các ch ng nuôi cấy môi trường MT3 mơi trường khống chất casein, sau 3, 4, 5, 6, ngày nuôi tiến hành lấy mẫu đo hoạt độ protease phương pháp Anson cải tiến Kết thể bảng sau : 53 Bảng 3.3 : Hoạt độ protease đo chủng môi trường MT3 Hoạt độ protease (U/ml) Ngày Chủng Vn1359 0,07 0,08 0,26 0,26 0,25 Vn1482 0,19 0,25 0,25 0,26 0,24 Vn1485 0,05 0,07 0,14 0,12 0,09 Vn1493 0,05 0,13 0,19 0,18 0,14 Vn1640 0,06 0,09 0,17 0,16 0,14 Vn1641 0,09 0,19 0,33 0,26 0,25 Hình 3.9 : Ảnh h ng c mơi tr ờng MT3 sinh tổng hợp prote se c n ch ng Kết đo cho thấy khả sinh t ng hợp protease c a ch ng môi trường MT3 thấp nhiều so với môi trường MT1 MT2 Điều môi trường MT3 thiếu nguồn dinh dưỡng cacbon nên ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển c a vi sinh vật Từ kết xác định môi trường MT2 môi trường tốt môi trường nghiên cứu ch ng VN1359, VN1482, VN1485, VN1493, VN1640 VN1641 Vì ta chọn mơi trường MT2 môi trường để khảo sát số nguồn cacbon khác nghiên cứu Trong ngày ni hoạt lực protease đạt cao vào ngày thứ ch ng mơi trường Vì nghiên cứu tiếp theo, hoạt độ protease c a ch ng xác định vào ngày thứ 54 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cac on đến khả sinh tổng hợp protease Như biết, nguồn dinh dưỡng cacbon có nghĩa hàng đầu sống c a vi sinh vật Số nguồn cacbon vi sinh vật vô lớn đường sacarose, maltose, lactose, glucose… loài lại sử dụng nguồn cacbon khác Vì cần lựa chọn nguồn cacbon thích hợp cho ch ng Thay đường glucose MT2 loại đường maltose, lactose, fructose, sacarose, tiến hành nuôi điều kiện pH – 7,5, nhiệt độ 300C với tốc độ lắc 180 vòng/phút, sau ngày thu dịch lọc canh trường tiến hành đo hoạt lực protease phương pháp Anson cải tiến để so sánh khả sinh t ng hợp protease c a chúng nguồn dinh dưỡng cacbon 3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dư ng cac on maltose đến khả sinh tổng hợp protease Các ch ng ni cấy mơi trường có nguồn dinh dưỡng cacbon maltose, sau ngày nuôi tiến hành lấy mẫu đo hoạt độ protease phương pháp Anson cải tiến Kết thể bảng sau : Bảng 3.4: Hoạt độ protease đo chủng môi trường sử dụng nguồn cacbon maltose Chủng Hoạt độ protease (U/ml) VN1359 0,31 VN1482 0,48 VN1485 0,16 VN1493 0,18 VN1640 0,21 VN1641 0,34 55 Hình 3.10: Ảnh h ng c nguồn c cbon maltose c n sinh tổng hợp prote se ch ng Kết cho thấy môi trường sử dụng nguồn dinh dưỡng cacbon maltose, khả sinh t ng hợp protease c a ch ng thấp nhiều so với nuôi môi trường sử dụng nguồn cacbon glucose 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dư ng cac on lactose đến khả sinh tổng hợp protease Các ch ng ni cấy mơi trường có nguồn dinh dưỡng cacbon lactose, sau ngày nuôi tiến hành lấy mẫu đo hoạt lực protease phương pháp Anson cải tiến Kết thể bảng sau : Bảng 3.5: Hoạt độ protease đo chủng môi trường sử dụng nguồn cacbon lactose Chủng Hoạt độ enzyme protease (U/ml) VN1359 0,3 VN1482 0,5 VN1485 0,19 VN1493 0,2 VN1640 0,21 VN1641 0,33 56 Hình 3.11: Ảnh h ng c nguồn c cbon lactose c n sinh tổng hợp prote se ch ng Kết nghiên cứu cho thấy sử dụng nguồn dinh dưỡng cacbon lactose, khả sinh t ng hợp protease c a ch ng thấp so với nuôi môi trường MT2 với nguồn dinh dưỡng cacbon glucose 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dư ng cac on fructose đến khả sinh tổng hợp protease Các ch ng ni cấy mơi trường có nguồn dinh dưỡng cacbon fructose, sau ngày nuôi tiến hành lấy mẫu đo hoạt lực protease phương pháp Anson cải tiến Kết thể bảng sau : Bảng 3.6: Hoạt độ protease đo chủng môi trường sử dụng nguồn cacbon fructose Chủng Hoạt độ protease (U/ml) VN1359 0,35 VN1482 0,55 VN1485 0,18 VN1493 0,22 VN1640 0,23 VN1641 0,35 57 Hình 3.12: Ảnh h ng c nguồn c cbon fructose c n sinh tổng hợp prote se ch ng Kết cho thấy sử dụng nguồn cacbon fructose, hoạt độ protease c a ch ng cao thấp so với nuôi mơi trường MT2 Riêng ch ng VN1482 có hoạt độ protease cao đạt 0,55 (U/ml), cao so với ni mơi trường MT2 có nguồn cacbon glucose 3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dư ng cac on sacarose đến khả sinh tổng hợp protease Các ch ng nuôi cấy mơi trường có nguồn dinh dưỡng cacbon sacarose, sau ngày nuôi tiến hành lấy mẫu đo hoạt lực protease phương pháp Anson cải tiến Kết thể bảng sau : Bảng 3.7: Hoạt độ protease đo chủng môi trường sử dụng nguồn cacbon sacarose Chủng Hoạt độ protease (U/ml) VN1359 0,32 VN1482 0,51 VN1485 0,2 VN1493 0,21 VN1640 0,22 VN1641 0,35 58 Hình 3.13: Ảnh h ng c nguồn c cbon sacarose c n sinh tổng hợp prote se ch ng Kết nghiên cứu cho thấy sử dụng nguồn cacbon sacarose, hoạt độ protease c a ch ng cao thấp so với nuôi môi trường sử dụng nguồn dinh dưỡng cacbon glucose Từ kết ta thấy môi trường chứa nguồn dinh dưỡng cacbon glucose môi trường cho hoạt lực protease cao ch ng VN1359, VN1485, VN1493, VN1640 VN1641 Riêng ch ng VN1482, nguồn fructose nguồn dinh dưỡng cacbon thích hợp nguồn cacbon trên, hoạt lực protease môi trường sử dụng nguồn cacbon fructose đạt giá trị cực đại đạt 0,55 (U/ml) 59 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu đến kết luận sau : - Đã phân lập ch ng VN1359, VN1482, VN1485, VN1493, VN1640 VN1641 có khả sinh t ng hợp protease phương pháp xác định vòng th y phân đĩa thạch - Định lượng hoạt tính protease phương pháp Ason cải tiến tìm sau ngày ni cấy ch ng đạt hoạt tính lớn - Thử nghiệm ba môi trường nuôi cấy MT1 (YPG b sung khoáng chất), MT2 (glucose b sung khoáng chất), MT3 (khoáng chất) lựa chọn mơi trường thích hợp cho trình sinh t ng hợp protease c a ch ng môi trường MT2 - Nghiên cứu khảo sát nguồn dinh dưỡng cacbon môi trường MT2 cho thấy glucose nguồn dinh dưỡng cacbon thích hợp cho ch ng VN1359, VN1485, VN1493, VN1640 VN1641 Riêng ch ng VN1482 nguồn fructose nguồn dinh dưỡng cacbon thích hợp - Trong ch ng tuyển chọn ch ng VN1359, VN1482 VN1641 ch ng có khả sinh t ng hợp protease cao n định sau 5, ngày nuôi MT2 Đề xuất hướng nghiên cứu : - Tối ưu hóa đồng thời yếu tố mơi trường, pH, nhiệt độ, tốc độ lắc, thời gian nuôi… để trình ni cấy số ch ng thuộc chi Beauveria cho hoạt lực protease cao - Lựa chọn phương pháp tối ưu để tinh protease sinh t ng hợp từ môi trường dịch thể nuôi cấy số ch ng thuộc chi Beauveria - Nghiên cứu ứng dụng c a protease công nghiệp đời sống 60 T I LI U THAM KHẢO TIẾNG VI T Đỗ Qu Hai, Trần Thanh Phong (2004), Giáo trình enzyme, Nxb Đại học Huế Hà Thị Quyến (2002), Ảnh hưởng c a điều kiện bảo quản giống đến đặc tính sinh học c a vi nấm diệt trùng Metarhizium anisopliae Beauveria bassiana, Hội nghị Côn tr ng học toàn quốc lần thứ 4, Hà Nội 12/4/2002, pp 401 – 405 Lê Tấn Hưng cộng (2010), Nấm côn trùng vườn Quốc gia Cát Tiên: nguồn tài nguyên qu cho ứng dụng sinh học, Hội nghị Kho học ỷ niệm 35 năm Viện Kho học Công nghệ Việt N m – Hà Nội, Hà Nội 26/10/2010 Lương Đức Phẩm (1998), iáo trình cơng nghệ vi sinh v t, Nxb Nơng nghiệp Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phan Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), Enzym vi sinh v t, Nxb Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Đức Lượng (ch biên), Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết (2004), Công nghệ enzym, Nxb Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Lộc cộng (2002), Nghiên cứu, sản xu t ứng dụng hai ch phẩm sinh học quản lý loài sâu h i lúa, Viện lú Đồng sông Cửu Long, pp 274 – 295 Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzym, Nxb Nông nghiệp Tp HCM Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Văn Thành (2005), iáo trình mơn n m học, Trường Đại học Cần Thơ 10 Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp, Phạm Thế Hải (2005), Thần d ợc Đông tr ng h thảo http://vietsciences.net 11 Nguyễn Dương Khuê (2005), Sử dụng nấm Metarhizium anisopliae phòng trừ mối nhà (Coptotetrmes formosanus Shiraki) theo phương pháp lây nhiễm, Hội nghị côn tr ng học toàn quốc lần thứ 5, pp 409 – 414 12 Phạm Văn Lầm (1959), Nấm gây bệnh cho côn trùng, T p chí Bảo vệ thực v t, số 1(169),pp 35 – 37 13 Phạm Thị Thùy, Trần Văn Huy, Nguyễn Duy Mạn (2005), Nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi nấm Beauveria Metarhizium để phòng trừ sâu hại đậu tương đậu xanh Hà Tĩnh năm 2003-2004, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, pp 494 -497 61 14 Trần Ngọc Lân (2009), Đ d ng n m ý sinh côn tr ng ánh giá ý sinh c v ờn quốc gi Mát số loài n m ối với s u h i c y trồng, Đề tài cấp Giáo dục Đào tạo, Mã số: B2007 – 27 – 25 15 Tạ Kim Chỉnh, Hồ Thị Loan, Nguyễn Thị Hà Chi (2005), Một số đặc điểm sinh hóa c a hai ch ng nấm Metarhizium anisopliae Ma.82 Beauveria bassiana Bb.75KC, Hội nghị Cơn tr ng học tồn quốc lần thứ 5, pp 433 – 436 16 Võ Thị Thu Oanh, Lê Đình Đôn, Bùi Cách Tuyến (2007), Đặc điểm sinh học khả gây bệnh c a nấm Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin đối vời sâu khoang (Spodoptera litura F.) hại rau cải xanh (Brassica juncea L.), T p chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 1&2, pp 58-63 17 http://www.scribd.com/doc/44670757/protease 18 http://www.scribd.com/doc/19835831/Enzyme-Hoc TIẾNG ANH 19 Aunstrup, K (1979), Production, isolation and economics of extracellular enzymes AppI Biochem Bioeng 2, pp 27 – 69 20 Charnley A.K., Leger R.J (1991), The role of cuticle degrading enzyme in fugal pathogensis in insects, In the fugal spore and disease initiation plant and animals , Plenium Press, pp 267 – 286 21 David Pramer (1995), Fungal Parasites of Insects and Nematodes , Bacteriological Reviews, Vol.29, pp.382 – 387 22 Evans, H.C.(1988) Coevolution of entomogenous fungi and their insect hosts, In: K.A Pirozynski and D.L Hawksworth (eds.): Coevolution of Fungi with plants and animals, Academic Press London, pp 149–171 23 Gi – Ho Sung et al (2007), Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi, Studies in Mycology, 57, pp – 59 24 Hajek, A.E and R.J.St.Leger (1994) Interactions between fungal pathogens and insect hosts, Annu Rev Entomol, 39, pp 293-322 25 Hung et al (2009), Effect of temperature on cordycepin production in Cordyceps militaris, Thai Journal of Agricultural Science, 42(4), pp 219-225 26 Hywel-Jones, N L (1994), Cordyceps khaoyaiensis and C pseudomilitaris, two new pathogens of lepidopteran larvae from Thailand, Mycological Research 98, pp 939 - 942 62 27 Isaka M., Tanticharoen., Kongsaeree p., Thebtaranoth Y., (2001), Structures of cordycepines A-D, antimalaria N- hydroxy- and N methoxy – – pyridones from insect pathgenic fungus Cordyceps nipponica, J Org Chem., 66, pp 4803- 4808 28 Isaka, M., P Kongsaeree, and Y Thebtaranonth (2001), Bioxanthracenes from the insect pathogenic fungus Cordyceps pseudomilitaris BCC 1620,II, Structure elucidation J Antibiot, 54(1), pp 36-43 29 Janet Jennifer et al (2006), Worksop on The collection, isolation, cultivation and identification of Insect-pathogenic fungi, BIOTEC, Thai Lan 30 Kocharin, K and P.Wongsa (2006), Semi-defined medium for in vitro cultivation of the fastidious insect pathogenic fungus Cordyceps unilateralis, Mycopathologia 161(4), pp 255-260 31 Kittakoop et al (1999) Bioactive naphthoquinones from Cordyceps unilateralis, Phytochemistry, 52(3), pp 453-457 32 McCoy, C.W (1990), Entomogenous fungi as microbial pesticides, In R.R Baker, and P.E Dunn (eds.), New Directions in biological control, Alan R Liss, New York, pp 139-159 33 Rukachaisirikul et al (2004), 10-membered macrolides from the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris BCC 2816, J Nat Prod, 67, pp 1953-1955 34 Shah, P.A and J.K Pell (2003), Entomopathogenic fungi as biological control agents, Appl Microbiol Biotech, 61, pp 413 - 423 35 Samson R.A., Evans H.C and Latgé J.P (1988), Atlas of entomopathogenic fungi, Springer- Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, pp – 187 36 Taborsky, V (1992), Small-scale processing of microbial pestcides, FAO Agric Service Bull No 96, Food and Agriculture Organization of the United Nations Rome 1992 37 Unagul P, Wongsa P et al (2005), Production of red pigments by the insect pathogenic fungus Cordyceps unilateralis BCC 1869, National Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Thailand Science Park, 113 Paholyothin Road, Klong 1, Klong Luang Pathumthani, 12120, Thailand, J Ind Microbiol Biotechnol 32 : pp 135 – 140 38 Wongsa P et al (2005), Isolation and in vitro cultivation of the insect pathogenic fungus Cordyceps unilateralis, Micol Res 109(8), pp 936-940 63 39 Zhu, J.S., G.M Halpern, and K Jones (1998) The scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine: Cordyceps sinensis, Part I, J Altern Complement Med 4(3), pp 289-303 40 Zhu, J.S., G.M Halpern, and K Jones (1998), The scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine: Cordyceps sinensis, Part II, J Altern Complement Med 4(4), pp 429-457 41 http://www.wisegeek.com/what-is-beauveria.htm 42 http://baigiang.violet.vn/present/show/entry-id =767459 43 http://www.worthington-biochem.com/pap/default.html ... chọn đề tài " Phân lập, tuyển chọn chủng sinh tổng hợp protease từ nấm ký sinh trùng " từ góp phần chọn ch ng điều kiện thích hợp cho trình tách – tinh chế protease từ nấm k sinh trùng sau Mục đích... từ ch ng nấm thuộc chi Beauveria sau 11 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm ký sinh côn trùng 1.1.1 Giới thiệu chung nấm ký sinh côn trùng 1.1.1.1 Đ c điểm chung nấm ký sinh côn trùng Nấm k sinh. .. lồi trùng điều kiện l tưởng cho nấm côn trùng phát triển Theo Evans (1988), nấm k sinh trùng chia thành bốn nhóm: + Ký sinh trong: nấm k sinh nội quan, khoang thể c a côn trùng k ch ; + Ký sinh