Nghiên cứu thành phần hóa học của rễ cây trôm leo ( byttneria aspera colebr) ở vườn quốc gia cúc phương

Bộ giáo dục đào tạo Tr-ờng đại học vinh lê chí hoan Nghiên cứu thành phần hoá học rễ Trôm leo ( Byttneria aspera Colebr) Vuờn quốc gia Cúc Ph-ơng Chuyên ngành: Hóa Hữu MÃ số: 60.44.27 Luận văn thạc sĩ hóa học Ng-ời h-ớng dẫn khoa học: TS phạm văn c-ờng Vinh - 2011 LỜI CẢM ƠN Luận văn hoàn thành Khoa sau Đại học – Trường Đại học Vinh, Phòng Tổng hợp hữu – Viện Hóa Sinh Biển, Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn: Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới TS Phạm Văn Cường, người giao đề tài tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn PGS TS Lê Văn Hạc PGS TS Nguyễn Văn Hùng, người tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ q trình làm luận văn Tơi xin cảm ơn dự án ICBG tạo tiền đề cho thực kế hoạch luận văn Tôi xin chân trọng cảm ơn PGS TS Hoàng Văn Lựu PGS TS Nguyễn Hoa Du đóng góp nhiều ý kiến quý giá Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Mạnh Cường – Vườn quốc gia Cúc Phương việc thu hái xác định tên Nhân dịp tơi xin bày tỏ kính trọng cảm ơn tới thầy giáo Khoa Hóa học – Trường Đại học Vinh tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập hồn thành luận văn Tôi đặc biệt cảm ơn anh chị bạn đồng nghiệp phòng Tổng hợp Hữu Trung tâm nghiên cứu phát triển thuốc – Viện Hóa Sinh Biển giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè cổ vũ, động viên tơi hồn thành tốt luận văn Xin trân trọng cảm ơn! Vinh, tháng 12 năm 2011 Tác giả Lê Chí Hoan MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan họ Trôm (Sterculiaceae) 1.1.1 Sơ lược họ Trôm (Sterculiaceae) [1][3][6][7] 1.1.2 Các nghiên cứu hóa thực vật công bố họ Trôm (Sterculiaceae) 1.1.2.2 Các hợp chất terpenoid 1.1.2.3 Các hợp chất flavonoid 1.1.2.4 Các hợp chất steroid 1.2 Tổng quan chi Byttneria 1.2.1 Mô tả thực vật 1.2.2 Phân bố sinh thái 10 1.2.3 Các nghiên cứu hóa thực vật công bố chi Byttneria 10 1.3 Tổng quan Trôm leo (Byttneria aspera colebr) 10 1.3.1 Mô tả thực vật 10 1.3.2 Phân bố sinh thái công dụng 11 1.3.3 Những nghiên cứu trước cây Trôm leo (Byttneria aspera Colebr) 11 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 13 2.1 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 13 2.2 Vật liệu nghiên cứu 13 2.2.1 Mẫu thực vật 13 2.2.2 Hoá chất nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Các phương pháp hóa học 14 2.3.1.1 Phương pháp chiết 14 2.3.1.2 Sắc ký cột (Column chromatography - CC) 14 2.3.1.3 Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) 14 2.3.2 Các phương pháp vật lý đại 14 2.3.2.1 Phổ hồng ngoại (Infrared - IR) 14 2.3.2.2 Phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS) 15 2.3.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR - Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) 15 2.3.3 Thử hoạt tính Sinh học 15 2.4 Khảo sát thành phần hố học Trơm leo (Byttneria aspera) 16 2.4.1 Điều chế phần chiết từ rễ Trôm leo (Byttneria aspera) 16 2.4.2 Phân lập chất có phần chiết EtOAc (BAE) 17 2.4.3 Hằng số vật lý kiện phổ chất phân lập 19 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Xác định cấu trúc hoá học chất phân lập 20 3.1.1 Hợp chất BA-3 20 3.1.2 Hợp chất BA-1 23 3.1.3 Hợp chất Scopoletin (BA-2) 26 3.1.4 Hợp chất epicatechin (BA-4) 27 3.2 Kết thử hoạt tính kháng lao 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 Kết luận 31 Kiến nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT IR Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại) ESI-MS Electron Spray Ionisation Mass Spectroscopy (Phổ khối phun mù electron) H-NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 13 C-NMR Carbon Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân bon) DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer (Phổ DEPT) HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence (Phổ tương tác dị hạt nhân) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương tác đa liên kết dị nhân) s singlet br s broad singlet (tù) d doublet dd double doublet δH, δC Độ chuyển dịch hóa học proton cacbon ppm part per million (phần triệu) đnc Điểm nóng chảy DMSO Dimethylsulfoxide BA Byttneria aspera SST Số thứ tự TMS Tetramethylsilan MABA Microplate Alamar Blue Assay (ph p thử vi lượng sử dụng thuốc nhuộm xanh Alamar) CC Column Chromatography (sắc ký cột thường) TLC Thin Layer Chromatography (sắc ký lớp mỏng) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Dữ kiện phổ NMR (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz) hợp chất BA-3 21 Bảng 3.2: Dữ kiện phổ NMR (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz) hợp chất BA-1 25 Bảng 3.3: Dữ kiện phổ NMR (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz) hợp chất BA-2 26 Bảng 3.4: Dữ kiện phổ NMR (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz) hợp chất BA-4 28 Bảng 3.5: Kết thử hoạt tính kháng lao phân đoạn dòng H37Rv 29 Bảng 3.6: Kết thử hoạt tính kháng lao chất dòng H37Rv 30 DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ CÁC SƠ ĐỒ Hình: Hình 1.1: Các hợp chất ankaloid phân lập từ loài Melochia tomentosa Hình 1.2: Các hợp chất ankaloid phân lập từ loài Waltheria brachypetala Hình 1.3: Các hợp chất ankaloid phân lập từ loài Melochia corchorifolia Hình 1.4: Các hợp chất terpenoid phân lập từ loài Helicteres angustifolia L Hình 1.5: Các hợp chất terpenoid phân lập từ loài Pterospermum heterophyllum Hình 1.6: Các hợp chất terpenoid phân lập từ loài Abroma augusta Hình 1.7: Các hợp chất steroid phân lập từ loài Abroma augusta loài Pterospermum heterophyllum Hình 1.8: Ảnh Trôm leo (Byttneria aspera Colebr) 11 Hình 3.1: Các hợp chất phân lập từ dịch chiết rễ Byttneria aspera 20 Hình 3.2: Tương tác HMBC BA-3 21 Hình 3.3: Phổ 1H-NMR chất BA-3 22 Hình 3.4: Phổ HMBC chất BA-3 23 Hình 3.5: Phổ 1H-NMR chất BA-1 24 Hình 3.6: Phổ 1H-NMR chất BA-2 27 Hình 3.7: Phổ 1H-NMR chất BA-4 28 Sơ đồ: Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế cặn chiết từ rễ Trôm leo 16 Sơ đồ 2.2: Sơ đồ tinh chế cặn EtOAc (BAE) 17 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Việt Nam quốc gia có thảm thực vật vô phong phú đa dạng đặc thù điều kiện khí hậu tự nhiên Theo số liệu thống kê Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới – IUCN, số 12.000 loài thực vật nước ta, có khoảng 3.200 lồi sử dụng dân gian làm thuốc chữa bệnh Các hợp chất có nguồn gốc từ thảo dược đóng vai trị quan trọng việc phát nghiên cứu ứng dụng phục vụ việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng Theo thống kê l nh vực nghiên cứu ung thư bệnh truyền nhiễm Tổ chức Y tế giới WHO, có khoảng 60 thuốc có mặt thị trường có nguồn gốc từ thiên nhiên [26] Lao bệnh nhiễm khu n lây truyền có từ lâu đời mà tác nhân gây bệnh trực khu n hình que nhà bác học Robert Kock tìm năm 1882 Từ năm 1882 đến ước tính có khoảng 200 triệu người chết bệnh lao Hiện giới số người mắc chết bệnh lao cịn cao đặc biệt nước nghèo Theo thống kê tổ chức sức khỏe giới (WHO), giới có khoảng 2,2 t người nhiễm lao (chiếm khoảng dân số giới) M i năm có gần triệu người lây nhiễm lao gần triệu người chết lao Việt Nam, bệnh lao cịn phổ biến mức trung bình cao, Việt Nam đứng thứ 12 số 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao tồn cầu Hiện nay, bệnh lao điều trị khỏi đạt khoảng 82 với chiến lược DOTS tổ chức Sức khỏe Thế giới Tuy nhiên, lại xuất trở lại với tình hình nặng nề phức tạp có xuất lao đa kháng đặc biệt lao siêu kháng thuốc, chủng vi trùng kháng thuốc nguồn lây nguy hiểm thực mối đe dọa sức khỏe cộng đồng Vì vậy, cơng tìm kiếm loại thuốc chống lao vấn đề mang tính cấp bách tồn cầu Trong khn khổ dự án ICBG (Chương trình nghiên cứu đa dạng sinh học Việt Nam – Lào hợp tác với trường đại học Chicago – Mỹ) Viện Hóa Sinh Biển – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Trường đại học Chicago – Mỹ, dịch chiết rễ trôm leo thu hái Vườn Quốc gia Cúc Phương thể hoạt tính chống lao với giá trị MIC 150 µg/ml Vì vậy, t rong luận văn Thạc s này, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hố học rễ Trơm leo (Byttneria aspera Colebr) Vuờn quốc gia Cúc Phƣơng” từ góp phần xác định thành phần hóa học hoạt tính sinh học rễ trơm leo nhằm tìm kiếm chất có hoạt tính chống lao Nhiệm vụ nghiên cứu Trong luận văn có nhiệm vụ sau: - Điều chế cặn chiết mẫu rễ Trôm leo (Byttneria aspera Colerb) - Tinh chế cặn dịch chiết EtOAc - Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập - Khảo sát hoạt tính kháng lao dịch chiết, phân đoạn hợp chất phân lập Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu cặn dịch chiết rễ Trôm leo (Byttneria aspera Colebr) thuộc họ Trôm (Sterculiaceae ) Vườn quốc gia Cúc Phương PL13: Phổ giãn 1H-NMR chất BA-3 HO 4' HO 3' 2' 10 O 5' 1' O 6' OH O PL14: Phổ 13C-NMR chất BA-3 HO 4' HO 3' 2' 10 O 5' 1' O 6' OH O PL15: Phổ giãn 13C-NMR chất BA-3 HO 4' HO 3' 2' 10 O 5' 1' O 6' OH O PL16: Phổ giãn 13C-NMR chất BA-3 PL17: Phổ DEPT chất BA-3 PL18: Phổ DEPT chất BA-3 HO 4' HO 3' 2' 10 O 5' 1' O 6' OH O PL19: Phổ giãn HMBC chất BA-3 HO 4' HO 3' 2' 10 O 5' 1' O 6' OH O PL20: Phổ giãn HMBC chất BA-3 HO 4' HO 3' 2' 10 O 5' 1' O 6' OH O PL21: Phổ HSQC chất BA-3 PL22: Phổ giãn HSQC chất BA-3 5' 4' 6' HO OH 3' 1' O 2' OH 10 OH OH PL23: Phổ IR chất BA-4 5' 4' 6' HO OH 3' 1' O 2' OH 10 OH OH PL24: Phổ MS chất BA-4 PL25: Phổ giãn 1H-NMR chất BA-4 5' 4' 6' HO OH 3' 1' O 2' OH 10 OH OH PL26: Phổ 13C-NMR chất BA-4 5' 4' 6' HO OH 3' 1' O 2' OH 10 OH OH PL27: Phổ giãn 13C-NMR chất BA-4 ... tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu cặn dịch chiết rễ Trôm leo (Byttneria aspera Colebr) thuộc họ Trôm (Sterculiaceae ) Vườn quốc gia Cúc Phương 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan họ Trôm (Sterculiaceae)... hình nón, có lơng, hóa g ; hạt thn [2] Dưới hình ảnh Trôm leo (Byttneria aspera Colebr), rễ Trôm leo TS Nguyễn Mạnh Cường – Vườn quốc gia Cúc Phương thu hái Vườn quốc gia Cúc Phương vào tháng năm... hãng Atago 2.2 Vật liệu nghiên cứu 2.2.1 Mẫu thực vật Rễ Trôm leo (Byttneria aspera Colebr) TS Nguyễn Mạnh Cường – Vườn Quốc gia Cúc Phương thu hái Vườn Quốc Gia Cúc Phương tháng năm 2008 Mẫu