Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu nhằm mục tiêu xây dựng quy trình chiết tách yếu tố đông máu VIII, albumin từ huyết tương tươi đông lạnh tại Việt Nam. Mẫu huyết tương sử dụng được kiểm tra theo tiêu chuẩn Dược điển Châu Âu 2013. Huyết tương tươi được đông lạnh nhanh, sau đó rã đông, ly tâm thu tủa lạnh để điều chế FVIII với độ tinh khiết trung gian và dịch nổi F. Mời các bạn cùng tham khảo!
NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH ALBUMIN, YẾU TỐ ĐÔNG MÁU VIII TỪ HUYẾT TƢƠNG TƢƠI ĐÔNG LẠNH Nguyễn Hữu Phƣớc1, Võ Thanh Hải2, Võ Phùng Nguyên2, Trần Văn Bảo3 Khoa Dược, Trường Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Trung tâm truyền máu huyết học, Bệnh viện Chợ Rẫy TÓM TẮT Ngày nay, nước phát triển, việc sử dụng sản phẩm từ máu điều trị bệnh xu hướng phát triển thay cho máu toàn phần Nhu cầu sử dụng sản phẩm từ huyết tương Việt Nam lớn Trong đó, sản phẩm từ huyết tương thị trường phải nhập với giá cao Nghiên cứu nhằm mục tiêu xây dựng quy trình chiết tách yếu tố đông máu VIII, albumin từ huyết tương tươi đông lạnh Việt Nam Mẫu huyết tương sử dụng kiểm tra theo tiêu chuẩn Dược điển Châu Âu 2013 Huyết tương tươi đơng lạnh nhanh, sau rã đơng, ly tâm thu tủa lạnh để điều chế FVIII với độ tinh khiết trung gian dịch F Phần dịch tiến hành tủa với ethanol lạnh để thu albumin Sản phẩm đơng khơ, đóng gói Kết thu yếu tố VIII với độ tinh khiết trung gian đạt hiệu suất 60%, albumin sau đơng khơ có độ tinh khiết đạt đến 95% với hiệu suất 65%, đạt tiêu chuẩn lý hóa theo dược điển Anh 2013 Từ khóa: Albumin, ethanol lạnh, huyết tương tươi đông lạnh, tủa lạnh, yếu tố đông máu GIỚI THIỆU Ở quốc gia phát triển, chiết tách sản phẩm máu trở thành công nghệ đại có tính hiệu an tồn cao, giá trị điều trị bệnh kinh tế lớn Nhiều nước Mỹ, Anh, Pháp, Đức, Hoa Kỳ, Nhật,… thành công việc chiết tách sản phẩm albumin, yếu tố VIII, γglobulin từ huyết tương người dùng cho điều trị bệnh [7] Nước ta có nguồn huyết tương an toàn, chất lượng cao [2] lượng huyết tương chiết tách từ máu hàng năm lớn, lãng phí dùng huyết tương tồn phần mà chưa có sản xuất sản phẩm chiết tách từ huyết tương Các sản phẩm huyết tương dùng thị trường phải nhập với giá cao mà chưa có nơi nghiên cứu làm nguyên liệu dược Trong đó, Việt Nam, nhu cầu sử dụng sản phẩm huyết tương việc điều trị bệnh lý viêm gan, xơ gan, bệnh truyền nhiễm,…là lớn[11] Vấn đề quan trọng công việc sản xuất, chiết tách, sử dụng nguồn huyết tương phát kiểm soát bệnh nhiễm nguồn nguyên liệu đầu vào Trong thành phần máu người, albumin protein có nhiều máu Bên cạnh đó, yếu tố đơng máu VIII đóng vai trị quan trọng q trình đơng máu [5] Nồng độ trung bình albumin máu khoảng 42 g/lít, đại diện cho khoảng 60% tổng protein huyết tương [8] Trong nghiên cứu tiến hành chiết tách yếu tố đông máu VIII albumin từ huyết tương người đông lạnh quy mơ phịng thí nghiệm quy trình sử dụng glycin tủa ethanol lạnh theo quy trình Cohn [4][6] tương ứng từ huyết tương người tình nguyện 494 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu: Albumin huyết tương người Đối tƣợng khảo sát: Huyết tương người đông lạnh, lấy từ người tình nguyện sản xuất Trung tâm truyền máu huyết học bệnh viện Chợ Rẫy Huyết tương bảo quản -35 0C tiến hành thí nghiệm vịng khơng q ngày Hóa chất thuốc thử Ethanol nguyên liệu 96%, acid acetic, natri acetat, albumin chuẩn phân tích Merck, glycin, SDS, βME, Coomassie Brilliant Blue R-250, đệm Tris, CuSO4, natri carbonat, acid boric, acid acetic băng Trang thiết bị Bể ổn nhiệt JSWB-11T (JSR), cân phân tích ML204 (Mettler Toledo), máy khuấy từ Stuart UC151 (Stuart), máy đo pH GLP-21 (Crison), máy ly tâm lạnh RC 12BP (Sorvall), máy đông lạnh nhanh (Micro Cascade), bàn ép túi máu, máy hàn dây T-Seal II (Terumo), máy quang phổ UV-Vis (Hitachi), máy đông khô (Martin Christ) 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Kiểm tra chất lượng huyết tương tươi đông lạnh 2.2.2 Chiết tách – tinh chế yếu tố VIII độ tinh khiết trung gian 2.2.2.1 Chiết tách tủa lạnh giàu yếu tố VIII Huyết tương tươi rã đông bồn nước 40C 16 Sau rã đông, tiến hành ly tâm 4000 rpm/15 phút (40C) Nhanh chóng ép huyết tương để thu phần riêng: tủa lạnh giàu yếu tố VIII huyết tương nghèo yếu tố VIII (dịch F) 2.2.2.2 Điều chế yếu tố VIII cô đặc Hòa tan tủa lạnh nước muối sinh lý Thêm dung dịch glycin vào dung dịch chứa yếu tố VIII để nồng độ glycin cuối đạt 1,4 M Trộn ủ 22 0C 20 phút Dung dịch ly tâm 4000 rpm/15 phút nhiệt độ phòng, thu dịch chứa yếu tố VIII tinh khiết hóa Phần dịch thêm vào NaCl để đạt nồng độ cuối 13,5% Trộn đều, ủ 0C 20 phút Ly tâm 4000 rpm/20 phút (4 0C) Thu phần tủa chứa yếu tố VIII tinh khiết Cân lấy 0,5 g tủa pha dung dịch nước muối sinh lý để định lượng hoạt tính yếu tố VIII, nồng độ fibrinogen protein toàn phần Phần cịn lại đơng khơ 2.2.3 Chiết tách albumin Phần dịch F nhanh chóng làm lạnh đến 00C để tiếp tục chiết albumin Giai đoạn tủa cồn: Phân đoạn 1: Dịch thu điều pH đến 7,2 ± 0,2 độ cồn 8% Trong suốt q trình thêm dịch, nhiệt độ ln cho không 0C dung dịch ln khấy đảm bảo khơng hình thành băng Ly tâm thu dịch F-I Phân đoạn 2: Dịch F-I điều chỉnh pH đến 6,90 ± 0,05 độ cồn 25% Trong suốt trình thêm dịch, nhiệt độ giữ cho không -3 0C dung dịch ln khuấy đảm bảo khơng hình thành băng Ly tâm thu dịch F-II+III 495 Phân đoạn 3: Dịch F-II+III điều chỉnh pH đến 4,80 ± 0,05 độ cồn 40% Nhiệt độ giữ 0C suốt trình bổ sung Ly tâm thu tủa F-IV Tủa F-IV hòa tan vào lần dung dịch nước muối sinh lý, điều chỉnh pH đến 5,2 sau đem đơng khơ thu sản phẩm PHÂN TÍCH DỮ LIỆU Trình bày thu thập liệu dạng Mean ± SD, sử dụng phần mềm Minitab 17 để xử lý thống kê Vẽ đồ thị Sigmaplot 13.0 Sử dụng phép kiểm để so sánh lô Kruskal-Walis, Mann-Whitney, Paired t-test (p IU/mg protein toàn phần (đạt tiêu chuẩn dược điển Anh 2013) Hiệu suất trình đạt từ 64 – 72% 496 4.2 Đánh giá quy trình chiết tách albumin kiểm nghiệm sản phẩm 4.2.1 Định lượng protein tồn phần giai đoạn Hình Protein tồn phần trước sau đơng khơ Xét hàm lượng protein tồn phần trước đơng khơ sau đơng khô lô khác không ý nghĩa (p>0,05, p>0,05) Hàm lượng protein tồn phần sau đơng khơ giảm khoảng g thất q trình cân, hịa tan lọc bỏ tủa khơng tan sau khuấy, nhiên khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Hình Tỷ lệ protein tồn phần/khối lượng tủa trước sau đông khô @