Nghiên cứu chiết tách và thành phần chất màu Anthocyanin trong rau dền đ

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGUYỄN THỊ THANH NHÀN Người hướng dẫn khoa học: PGS TS LÊ THỊ LIÊN THANH Header Page of 126 Phản biện 1: TS ĐOÀN THỊ THU LOAN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ THÀNH PHẦN CHẤT MÀU ANTHOCYANIN TRONG RAU DỀN ĐỎ Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60.44.27 Phản biện 2: PGS.TS TRẦN VĂN THẮNG Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng bảo vệ chấm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khoa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 28 tháng 10 năm 2011 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng - Năm 2011 Footer Page of 126 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm thông tin - Học liệu - Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại học Sư Phạm,Đại học Đà Nẵng Header Page of 126 MỞ ĐẦU 3.2 Phạm vi nghiên cứu: Lí chọn ñề tài: - Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng ñến hiệu suất chiết tách - Hiện ñời sống, người phải sử dụng chất màu anthocyanin từ rau dền ñỏ như: loại dung môi, nồng ñộ dung môi, tổng hợp, với mức ñộ an toàn ñối với sức khỏe người không cao thời gian chiết, chế ñộ cô ñặc Do ñó việc nghiên cứu chất màu tự nhiên thu hút quan tâm - Lựa chọn ñề xuất quy trình chiết tách anthocyanin từ rau dền ñỏ nhiều nhà khoa học ñiều kiện phòng thí nghiệm - Ở Việt Nam nguồn nguyên liệu rau, củ Quả ña dạng - Xác ñịnh thành phần chất màu anthocyanin chiết tách từ rau dền ñỏ chưa ñược nghiên cứu, ứng dụng có hiệu cao - Nghiên cứu ñộ bền màu anthocyanin từ rau dền ñỏ phụ thuộc - Hợp chất màu anthocyanin có nhiều loại thực vật, tạo nên vào pH nhiệt ñộ màu sắc khác cho rau, củ, Chúng màu sắc ñẹp Phương pháp nghiên cứu: mà mang nhiều tính chất dược lý có lợi cho sức khỏe người 4.1 Nghiên cứu lí thuyết: - Tuy nhiên loại thực vật chứa hợp chất anthocyanin có cấu trúc - Tìm hiểu lý thuyết kết thực nghiệm rau dền ñỏ khác dẫn ñến màu sắc khác Để lý giải phần chất - Tìm hiểu phương pháp chiết tách anthocyanin, yếu tố ảnh màu anthocyanin có rau củ quả, chọn ñề tài “Nghiên cứu hưởng ñến hiệu suất chiết ñộ bền màu anthocyanin chiết tách thành phần chất màu anthocyanin rau dền ñỏ” số vấn ñề khác có liên quan ñến nội dung ñề tài Mục ñích nghiên cứu: 4.2 Nghiên cứu thực nghiệm: - Nghiên cứu hiệu suất chiết tách anthocyanin từ rau dền ñỏ phụ 4.2.1 Phương pháp vật lí: thuộc vào loại dung môi, nồng ñộ dung môi, thời gian chiết, chế ñộ - Xác ñịnh ñộ ẩm toàn phần máy ño ñộ ẩm nhanh cô ñặc Từ ñó lựa chọn ñề xuất quy trình chiết tách anthocyanin từ 4.2.2 Phương pháp hóa học: rau dền ñỏ ñiều kiện tối ưu - Trích li anthocyanin với loại dung môi khác nhau: ethanol/ - Xác ñịnh thành phần chất màu anthocyanin khả bền màu nước HCl, methanol/ nước HCl, ethanol/ nước anthocyanin từ rau dền ñỏ theo pH, nhiệt ñộ CH3COOH Đối tượng phạm vi nghiên cứu: - Làm anthocyanin dung môi: petrolium ether, ethyl 3.1 Đối tượng nghiên cứu: acetat, diethyl ether Đối tượng nghiên cứu dịch chiết thu ñược từ rau dền ñỏ thành phố Đà Nẵng 4.2.3 Phương pháp hóa lí: - Xác ñịnh hàm lượng anthocyanin phương pháp pH vi sai - Xác ñịnh mật ñộ quang dung dịch máy quang phổ UV – VIS Footer Page of 126 Header Page of 126 - Xác ñịnh thành phần anthocyanin phương pháp sắc ký lỏng CHƯƠNG : TỔNG QUAN cao áp (HPLC) - Xác ñịnh ñộ bền màu anthocyanin chiết tách từ rau dền ñỏ theo 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY RAU DỀN pH, nhiệt ñộ phương pháp so màu 1.1.1 Mô tả thực vật rau dền Ý nghĩa khoa học thực tiễn ñề tài: 1.1.2 Vùng phân bố 5.1 Ý nghĩa khoa học ñề tài: - Xác ñịnh thành phần hợp chất màu anthocyanin rau dền ñỏ - Lý giải ñộ bền màu anthocyanin theo pH nhiệt ñộ 5.2 Ý nghĩa thực tiễn ñề tài : - Đề xuất qui trình chiết tách anthocyanin từ rau dền ñỏ với hiệu suất 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÍNH CHẤT DƯỢC LÝ 1.3 HỢP CHẤT ANTHOCYANIN 1.3.1 Cấu trúc anthocyanin 1.3.2 Đặc tính quang phổ anthocyanin cao thông qua số liệu thực nghiệm tốt yếu tố 1.4 QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH ANTHOCYANIN TỪ THỰC ảnh hưởng ñã nghiên cứu VẬT VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU SUẤT - Đề xuất pH nhiệt ñộ thích hợp ñể trì ñộ bền màu CHIẾT TÁCH anthocyanin từ rau dền ñỏ nhằm tăng cường phối hợp ứng 1.4.1 Quy trình chiết tách anthocyanin từ thực vật dụng màu thực phẩm 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng ñến hiệu suất chiết anthocyanin từ Bố cục luận văn: Ngoài phần mở ñầu, kết luận, tài liệu tham thực vật khảo phụ lục luận văn gồm phần 1.4.2.1 Ảnh hưởng dung môi Chương Tổng quan 1.4.2.2 Ảnh hưởng thời gian chiết Chương Những nghiên cứu thực nghiệm 1.5 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN ĐỘ BỀN MÀU CỦA Chương Kết thảo luận ANTHOCYANIN 1.5.1 Ảnh hưởng pH 1.5.2 Ảnh hưởng nhiệt ñộ 1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ANTHOCYANIN TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 1.6.1 Tình hình nghiên cứu anthocyanin giới 1.6.2 Tình hình nghiên cứu anthocynin Việt nam Footer Page of 126 Header Page of 126 thuộc vào tính phân cực chúng Quá trình gọi vi chiết CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU pha rắn Sau ñó chọn lựa dung môi có ñộ phân cực thích hợp 2.1 NGUYÊN LIỆU ñể rửa chất khỏi cột theo nguyên tắc chất phân - Tên khoa học: Amaranthus tricolor cực dễ dàng bị rữa khỏi cột dung môi phân cực ngược - Nguyên liệu: Rau dền ñỏ ñịa bàn thành phố Đà Nẵng ñược thu lại mua, lựa chọn loại có màu ñỏ ñậm, làm sạch, bảo quản nhiệt ñộ từ 0 Chất cần phân tích thu ñược ñem dịnh danh máy sắc kí 15 C ñến -20 C dùng làm mẫu nghiên cứu lỏng cao áp Việc ñịnh danh anthocianin HPLC ñược dựa 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM: nguyên tắc: 2.2.1 Hóa chất - Sử dụng chất chuẩn ñể ñịnh danh xác tên hợp chất 2.2.2 Thiết bị dùng phân tích - Phân tích hỗn hợp anthocyanin chuẩn mẫu dịch chiết 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ñiều kiện HPLC 2.3.1 Phương pháp hóa lý - Trong ñiều kiện phân tích, mẫu dịch chiết xuất 2.3.1.1 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng anthocyanin peak có thời gian lưu trùng với thời gian lưu peak anthicyanin - Sử dụng phương pháp pH vi sai ( the pH diffrentinal method ) chuẩn ta kết luận dịch chiết có chứa anthocyanin - Nguyên tắc phương pháp: dựa ñổi màu thay ñổi ñộ 2.3.2 Phương pháp hóa học hấp thụ anthocyanin theo thay ñổi pH Tại pH = 1,0 2.3.2.1 Phương pháp ñịnh tính anthocyanin anthocyanin dạng muối oxinium ( gọi cation flavinium ) có - Dựa nguyên tắc anthocyanin thay ñổi màu theo pH màu ñỏ ñộ hấp thụ cực ñại Ở pH = 4,5 anthocyanin có dạng 2.3.2.2 Phương pháp pha dung dịch ñệm carbinol không màu nên ñộ hấp thụ nhỏ, gần không 2.3.2.3 Sơ ñồ nghiên cứu 2.3.1.2 Phương pháp xác ñịnh ñộ bền màu - Độ bền màu ñược xác ñịnh phần trăm màu lại 2.3.1.3 Phương pháp xác ñịnh thành phần anthocyanin - Sử dụng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) - Cơ sở phương pháp sử dụng loại cột không phân cực C18 ñể tách chất cần phân tích, mẫu dịch chiết ñược cho vào cột chúng ñược hấp thụ cột mức ñộ mạnh yếu khác tùy Footer Page of 126 9 Header Page of 126 10 Nguyên liệu tươi CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Xác ñịnh ñộ ẩm toàn phần 3.1 Làm sạch, ñể lạnh ñông từ 150C → 200C Xử lý Định tính anthocyanin CỨU ĐIỀU KIỆN CHIẾT TÁCH ANTHOCYANIN TỪ RAU DỀN ĐỎ Nghiền nhỏ 3.1.1 Định tính anthocyanin rau dền ñỏ - Tiến hành xay nhỏ nguyên liệu, lọc lấy ml dịch trong, pha loãng dung dịch ñệm có pH = 1.0; 4,5 9,0 - Quan sát màu ñịnh tính diện anthocyanin Loại dung môi Điều kiện chiết tách Dung môi NGHIÊN Nồng ñộ dung môi - Quét phổ vùng nhìn thấy (λ = 450 – 700 nm) ñối với mẫu pH = 1,0 máy quang phổ kế UV – VIS DR4000U ñể tìm bước sóng hấp thụ cực ñại ( λmax ) Thời gian chiết Xác ñịnh hàm lượng anthocyanin Kết cho thấy: - Ở pH = 1,0 : dịch chiết có màu ñỏ Điều kiện cô ñặc - Ở pH = 4,5 : dịch chiết có màu tím nhạt - Ở pH = 9,0: dịch chiết có màu xanh - λmax = 535 nm Từ kết cho thấy: Đề xuất quy trình chiết tách anthocyanin từ rau dền ñỏ - Dịch chiết nguyên liệu rau dền ñỏ thay ñổi màu phụ thuộc vào pH ñúng quy luật thay ñổi màu anthocyanin - Dịch chiết nguyên liệu rau dền ñỏ có bước sóng hấp thụ cực ñại Xác ñịnh thành phần chất màu anthocyanin rau dền ñỏ Độ bền màu anthocyanin rau dền ñỏ 535 nm nằm vùng λmax anthocyanin (510nm ÷ 540nm) Với kết chứng tỏ rau dền ñỏ có diện hợp chất màu anthocyanin 3.1.2 Nghiên cứu chọn lựa ñiều kiện ảnh hưởng ñến khả Theo pH Theo nhiệt ñộ chiết tách chất màu anthocyanin từ rau dền ñỏ 3.1.2.1 Lựa chọn dung môi chiết - Rau dền ñỏ thu mua làm sạch, cân lấy 200g/ mẫu ñể lạnh Hình 2.2: Sơ ñồ nghiên cứu thực nghiệm Footer Page of 126 ñông nhiệt ñộ khoảng -15 ñến -200C Theo nhiệt ñộ 11 12 - Sau ñó tiến hành nghiền nhỏ ngâm trích li hệ dung Bảng 3.1: Ảnh hưởng loại dung môi ñến hàm lượng Header Page of 126 anthocyanin thu ñược từ rau dền ñỏ môi: Hàm lượng + Ethanol/nước (1/1; 1% HCl): 200ml ethanol, 200ml nước, 4ml HCl Loại dung môi TN anthocyanin thu ñược + Ethanol/nước (1/1; 1% CH3COOH): 200ml ethanol, 200ml nước, (%) 4ml CH3COOH Hệ dung môi ethanol/nước + Methanol/nước (1/1; 1% HCl): 200ml methanol, 200ml nước, 4ml ( 1/1; 1% HCl ) HCl Hệ dung môi ethanol/nước - Nhiệt ñộ chiết tách 30 C, thời gian chiết tách 60 phút 0,363 (1/1; 1% CH3COOH) - Sau ngâm trích nguyên liệu dung môi, tiến hành Hệ dung môi methanol/nước lọc máy lọc có ñộ chân không 720 mmHg, dịch lọc thu 0,474 0,244 ( 1/1; 1% HCl ) ñặc chân không, tăng dần áp suất từ 600 mmHg ÷ 700 mmHg, ñảm bảo dung dịch sôi nhiệt ñộ 500C, thời gian cô quay giờ, tiếp sau trình cô quay chân không thực ly tâm tách cặn máy ly tâm lạnh với tốc ñộ khoảng 6000 vòng/phút - Dịch chiết cuối thu ñược ñem ño mật ñộ quang λmax=535 nm pH=1,0 pH=4,5 Từ ñó xác ñịnh hàm lượng anthocyanin chiết từ rau dền ñỏ theo hệ dung môi khác dựa vào phương pháp pH vi sai Kết hàm lượng anthocyanin thu nhận ñược từ rau dền ñỏ ñược trình bày bảng 3.1 kết lượng anthocyanin thu ñược mẫu ñược biểu diễn ñồ thị hình 3.1 Hàm lượng antho, mg/100g nguyên liệu ñược ñem ñi cô quay chân không nhiệt ñộ 50 C Trong trình cô 50,000 47,400 40,000 ethanol/nước (1/1; 1%HCl) 36,270 30,000 24,428 20,000 ethanol/nước (1/1; 1% acid acetic) methanol/nước (1/1; 1%HCl) 10,000 Loại dung môi Hình 3.1: Biểu ñồ ảnh hưởng loại dung môi ñến lượng anthocyanin thu ñược từ rau dền ñỏ ( mg/100g nguyên liệu ) Footer Page of 126 Header Page of 126 13 14 Kết bảng 3.1 ñồ thị hình 3.1 cho thấy với hệ dung Bảng 3.2: Ảnh hưởng nồng ñộ dung môi ñến hàm lượng môi ñược khảo sát có tỉ lệ pha, bổ sung 1% HCl anthocyanin thu ñược từ rau dền ñỏ ñều cho hàm lượng anthocyanin cao bổ sung 1% CH3COOH Trong hệ dung môi khảo sát có bổ sung 1% HCl hệ dung môi Hàm lượng Lượng antho ethanol/nước (1/1) cho hàm lượng anthocyanin chiết tách cao hệ antho thu ñược (mg/ 100g dung môi methanol/nước (1/1) Nguyên nhân HCl tạo (%) nguyên liệu) 0,474 47,400 0,327 32,663 TN - môi trường acid, ñồng thời với ion Cl acid HCl phân li tạo muối clorua với anthocyanin, dẫn ñến anthocyanin bền không bị Loại dung môi Hệ dung môi thoái hóa nhiều trình chiết tách ethanol/nước ( 1/1; 1% HCl ) Với kết thí nghiệm loại dung môi trên, lựa chọn hệ dung môi chiết tách chất màu anthocyanin từ rau dền ñỏ môi trường acid theo thông số sau: - Hệ dung môi ethanol/nước (1/1; 1% HCl ) cho hiệu suất chiết tách Hệ dung môi ethanol/nước ( 7/3; 1% HCl ) anthocyanin cao, ñồng thời dung môi an toàn, rẻ tiền, dễ kiếm Sự lựa chọn phù hợp với ñiều kiện lựa chọn hệ dung môi chiết tách anthocyanin từ thực vật 3.1.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng ñộ dung môi chiết ethanol/nước môi trường acid HCl Tiến hành thí nghiệm mục 3.1.2.1 thay ñổi dung - Kết bảng 3.2 cho thấy, với hệ dung môi ethanol/nước có bổ sung 1% HCl tỉ lệ pha ethanol/nước 1/1 cho hàm lượng anthocyanin cao tỉ lệ pha ethanol/nước 7/3 - Lựa chọn hệ dung môi ethanol/nước tỉ lệ 1/1 có bổ sung 1% HCl ñể thực chiết tách anthocyanin từ rau dền ñỏ môi trích li là: 3.1.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian chiết ñến hiệu suất - Ethanol/nước (1/1; 1% HCl): 200ml ethanol, 200ml nước, 4ml HCl thu hồi anthocyanin thu ñược từ rau dền ñỏ hệ dung môi - Ethanol/nước (7/3; 1% HCl): 280ml ethanol, 120ml nước, 4ml HCl Sau thí nghiệm tính toán hàm lượng anthocyanin thu nhận ñược từ rau dền ñỏ mẫu, kết ñược trình bày bảng 3.2 ethanol/nước ( 1/1; 1% HCl ) Tiến hành thí nghiệm mục 3.1.2.1 thay ñổi dung môi trích li ethanol/nước (1/1; 1% HCl) ngâm trích li thời gian khác nhau: 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút Sau thí nghiệm tính toán: hàm lượng anthocyanin thu nhận ñược từ rau dền ñỏ mẫu ñược trình bày bảng 3.3 Footer Page of 126 15 Header Page of 126 16 tổng lượng anthocyanin thu ñược từ nguyên liệu ñược biểu diễn Từ kết bảng 3.3 ñồ thị hình 3.2 cho thấy thay ñồ thị hình 3.2 ñổi thời gian chiết từ 30 phút lên 60 phút hàm lượn anthocyanin Bảng 3.3: Ảnh hưởng thời gian chiết ñến hàm lượng anthocyanin thu thu ñược tăng nhanh, tăng từ 60 phút lên 90 phút, 120 phút ñược từ rau dền ñỏ hệ dung môi ethanol/nước (1/1; 1% HCl) hàm lượng anthocyanin có tăng, nhiên tăng chậm không ñáng kể, ñồng thời lượng tăng giảm dần Vì chọn thời Hàm lượng anthocyanin gian chiết 60 phút ñể chiết anthocyanin từ rau dền ñỏ hệ TN Thời gian chiết thu ñược (%) dung môi ethanol/nước (1/1; 1% HCl) 30 phút 0,142 3.1.2.4 Nghiên cứu ñiều kiện cô ñặc 60 phút 0,474 90 phút 0,501 - Lọc chân không 720 mmHg Cô quay 500C, áp suất tăng dần từ 120 phút 0,516 600 mmHg ÷ 700 mmHg Cứ 30 phút lần, lấy mẫu xác ñịnh Sau ngâm trích li nguyên liệu dung môi: dung dịch ñệm pH = 1,0 ño ñộ hấp thụ bước sóng 535 nm, 60,000 47,400 50,077 51,607 50,000 ñầu) Kết ñược trình bày ñồ thị hình 3.4; 3.5 40,000 30,000 20,000 tính tổn thất màu anthocyanin (% màu anthocyanin lại so với ban Tổn thất màu anthocyanin Lượng antho,mg/100g nguyên liệ hàm lượng chất khô, ñồng thời ñịnh mức ñộ pha loãng ban ñầu 14,195 10,000 30 phút 60 phút 90 phút 120 phút Thời gian, phút Hình 3.2: Biểu ñồ ảnh hưởng thời gian chiết ñến lượng anthocyanin thu ñược từ rau dền ñỏ ( mg/100g nguyên liệu ) Footer Page of 126 100 97.35 94.83 95 88.97 90 86.72 85.41 85 85.12 84.23 83.97 80.23 80 30 60 90 120 150 180 210 240 270 Thời gian, phút Hình 3.3 : Tổn thất màu anthocyanin trình cô ñặc theo thời gian 17 Hàm lượng chất khô, Bx Header Page of 126 50 40 30 18 34.25 20 10 12.51 14.12 16.09 45.63 Xác ñịnh ñộ ẩm toàn phần 39.17 45.81 Nguyên liệu tươi, 200g 26.89 20.34 , 30 60 90 120 150 180 210 240 270 Thời gian, phút Hình 3.4 : Sự thay ñổi hàm lượng chất khô theo thời gian Theo kết ñồ thị hình 3.5 cho thấy: thời gian vượt 240 phút nồng ñộ chất khô dung dịch tăng lên không ñáng kể, nguyên nhân nồng ñộ tăng dần ñộ nhớt dung dịch tăng dần làm cho trình bay nước khó khăn Theo kết ñồ thị hình 3.4 cho thấy: sau 270 phút tổn thất màu lại tăng mạnh ( lại 80,23 %) Nguyên nhân dịch chiết môi trường acid HCl có pH thấp ( ≤ 3,0) nên ñộ bền màu anthocyanin tương ñối cao với tác nhân nhiệt Tuy nhiên, kéo dài thời gian cô ñặc ñiều kiện nhiệt ñộ cao làm tăng khả tách gốc ñường khỏi anthocyanin phân cắt liên kết Làm Ly tâm tách Cô ñặc 600 - tủa, 6000 700 mmHg, vòng/phút 500C, Dịch chiết Bảo quản thô (A) -150C ÷ -200C Loại tinh dầu hợp chất tan -15÷-200C Lọc chân không 720 mmHg Nghiền nhỏ Trích ly 300C,60 phút Bã thải Dung môi Etanol/nước 1/1;1%HCl: 400 ml Petrolium ether dung môi không phân cực Bay dung môi Loại flavonoid Ethyl acetat anthocyanin Bay dung môi glycoside, dẫn ñến làm màu anthocyanin nhanh Từ kết nghiên cứu trên, chọn ñiều kiện ñể thực Làm kiệt nước trình cô ñặc thu nhận chất màu anthocyanin là: ñộ chân không 600 mmHg ÷ 700 mmHg, nhiệt ñộ 500C; thời gian 3.2 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH CHẤT MÀU ANTHOCYANIN TỪ RAU DỀN ĐỎ TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM Footer Page of 126 Bay dung môi Dietyl ether Dịch chiết Bảo quản (B) -150c ÷-200c Hình 3.5: Quy trình chiết tách anthocyanin từ rau dền ñỏ phòng thí nghiệm Header Page 10 of 126 19 20 3.3 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CHẤT MÀU ANTHOCYANIN TRONG RAU DỀN ĐỎ - Dịch chiết dạng B ñược làm cột C18, thu ñược dịch chiết chứa anthocyanin dạng tinh Sau ñó làm giàu anthocynain cột SPE - Tiếp theo tiến hành ñịnh danh anthocyanin dịch chiết thu ñược máy sắc kí lỏng cao áp (HPLC) sở dựa vào peak anthocyanin chuẩn Kết phân tích cho sắc ñồ hình 3.7 hình 3.8 Hình 3.8: Sắc ñồ mẫu dịch chiết từ rau dền ñỏ Từ hình 3.7, ta có kết phân tích hỗn hợp chất chuẩn Hình 3.7: Sắc kí ñồ hỗn hợp chất chuẩn anthocyanin Footer Page 10 of 126 Thời gian lưu (phút) Hợp chất 10,725 Cyanidin-3-Glucoside 13,392 Pelargonidin-3-Glucoside 14,283 Mavidin-3-Glucoside 22 Khi so sánh ñối chiếu với sắc ñồ mẫu dịch chiết từ rau dền ñỏ (Hình 3.8), ta thấy có tương ñồng thời gian lưu nên anthocyanin dịch chiết rau dền ñỏ bao gồm: Cyanidin – – Glucoside, Pelargonidin – – Glucoside, Mavidin – – Glucoside, ñó Pelargonidin-3-Glucoside chiếm tỉ lệ lớn 3.4 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA pH, NHIỆT ĐỘ ĐẾN ĐỘ BỀN MÀU CỦA ANTHOCYANIN THU ĐƯỢC TỪ RAU DỀN ĐỎ 3.4.1.Ảnh hưởng pH - Dùng dịch chiết thu ñược chứa anthocyanin tinh dạng keo thu ñược từ rau dền ñỏ tiến hành pha dung dịch ñệm citrat – phosphat (pH = 1,0 ÷ 8,0) ñể khảo sát bước sóng hấp thụ cực ñại (λmax) mẫu ño ñộ hấp thụ mẫu bước sóng λ = 535 nm Đặt ñộ hấp thụ mẫu có pH = 1,0 λ = 535 nm tương ứng 100 %, sau ñó tính phần trăm ñộ hấp thụ mẫu khác theo mẫu pH = 1,0 Kết ño ñộ hấp thụ λ = 535 nm tìm bước sóng hấp thụ cực ñại mẫu ñược biểu diễn ñồ thị hình 3.8; 3.9 bước sóng hấp thụ cực ñại,nm 21 Header Page 11 of 126 600 598 580 582 560 540 535 542 520 546 552 558 564 500 pH Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH ñến λmax anthocyanin từ rau dền ñỏ - Anthocyanin rau dền ñỏ thuộc loại anthocyanin có nhóm OH- vòng B, λmax tăng chậm khoảng pH = 1,0 ÷ 6,0 sau ñó tăng mạnh ñạt cực ñại pH = 8,1, pH > 10 giảm xuống Như kết thu ñược lần làm sáng tỏ khuynh hướng môi trường kiềm nhẹ màu anthocyanin tương ñối ổn ñịnh (ít biến ñổi) 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt ñộ - Khảo sát mẫu 300c 900c ñệm pH = 1,0; 3,0 5,0 ABS % Tiến hành ño ñộ hấp thụ mẫu bước sóng 535 nm thời gian lưu mẫu khác 100 80 60 40 20 - Ở 300C ngày ño lần, ño 20 ngày 73.1 - Ở 900C 15 phút ño lần, ño 60 phút 43.2 20.4 10.5 18.1 22.9 Kí hiệu mẫu sau: pH Hình 3.9 : Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH ñến biến ñổi cường ñộ màu anthocyanin từ rau dền ñỏ Footer Page 11 of 126 23 Header Page 12 of 126 24 t0c B1 300C pH 100 B1 pH = 3,0 B3 B4 pH = 5,0 B5 B6 Kết ño ñộ hấp thụ bước sóng hấp thụ cực ñại 535nm mẫu ñược biểu diễn ñồ thị hình 3.10 3.11 : B2 B4 B6 100 94.07 Phần trăm màu lại,% 96.45 95.41 94.67 94.03 93.73 89.02 87.21 90 93.02 92.43 91.89 91.28 85.5 83 84.83 81.11 80 77.48 75.6 74.91 73.43 71.39 72.41 69.86 70.32 70 66.51 64.28 62.36 60.24 60 56.25 54.17 92.33 88.12 90 B5 97.51 B2 Phần trăm màu lại (%) pH = 1,0 B3 900C 50 85.54 91.45 10 12 14 16 18 20 Thời gian, ngày 85.08 80 82.52 79.53 Hình 3.12: Phần trăm màu lại 300C pH khác Như vậy: Anthocyanin rau dền ñỏ tương ñối bền màu 70 pH thấp (pH = 1,0 3,0 ) bền dần pH tăng ( pH = 5,0 ) 68.46 Ở môi trường có pH nhiệt ñộ thường ( nhiệt ñộ 300C ) 67.21 64.48 60 62.34 anthocyanin rau dền ñỏ có màu bền nhiệt ñộ cao ( nhiệt ñộ 900C ) Điều giải thích nghiên cứu ñề xuất quy trình chiết tách anthocyanin từ rau dền ñỏ phòng thí nghiệm 50 15 30 45 60 Thời gian, phút Hình 3.11: Phần trăm màu lại 900C pH khác Footer Page 12 of 126 chọn ñiều kiện nhiệt ñộ 300C 25 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Độ bền màu anthocyanin thu ñược từ rau dền ñỏ liên quan chặt Header Page 13 of 126 A KẾT LUẬN: chẽ tới thay ñổi pH nhiệt ñộ: Kết nghiên cứu ñề tài: “ Nghiên cứu chiết tách + Anthocyanin thu ñược từ rau dền ñỏ có cường ñộ màu cao thành phần chất màu anthocyanin rau dền ñỏ ” ñã giúp rút môi trường acid ổn ñịnh mà ổn ñịnh màu môi ñược kết luận sau: Phát ñược diện anthocynin rau dền ñỏ trường kiềm nhẹ Nhiệt ñộ cao khả bền màu giảm Khẳng ñịnh ñược mối quan hệ mật thiết màu sắc loại rau củ ñến hàm lượng anthocyanin Điều kiện tối ưu từ kết thực nghiệm ñể chiết tách anthocyanin rau dền ñỏ là: + Hệ dung môi: ethanol/nước môi trường acid HCl + Nồng ñộ dung môi: ethanol/nước tỉ lệ 1/1 có bổ sung % HCl + Thời gian chiết 60 phút + Cô quay chân không: nhiệt ñộ 500C, áp suất từ 600 mmHg lên 700 mmHg, thời gian Thiết lập ñược quy trình chiết tách anthocyanin từ rau dền ñỏ phòng thí nghiệm theo tham số kỹ thuật tối ưu ñã xác ñịnh yếu tố ảnh hưởng ñến hiệu suất chiết Thu ñược dịch chiết có hàm lượng chất màu anthocyanin 0,474% Với nghiên cứu xác ñịnh thành phần ( ñịnh danh ) anthocyanin dịch chiết thu ñược từ rau dền ñỏ phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC), nhận thấy anthocyanin rau dền ñỏ bao gồm: Pelargonidin – – glucoside; Cyanidin – – glucoside; Malvidin – – glucoside, ñó pelargonidin – – glucoside chiếm tỉ lệ cao Footer Page 13 of 126 B KIẾN NGHỊ: Dịch chiết thu nhận ñược dịch chiết thô nên cần nghiên cứu phương pháp tinh dịch chiết ñể nâng cao hàm lượng anthocyanin diện hỗn hợp Bảo quản lạnh ñông (-150C) rau dền gây chi phí lạnh lớn nên nghiên cứu sấy rau dền thay cho phương pháp lạnh ñông So sánh hàm lượng, cấu tử có anthocyanin rau dền ñỏ với loại nguyên liệu khác ñể chứng minh hiệu kinh tế  ... pháp chiết tách anthocyanin, yếu tố ảnh màu anthocyanin có rau củ quả, chọn ñề tài Nghiên cứu hưởng ñến hiệu suất chiết ñộ bền màu anthocyanin chiết tách thành phần chất màu anthocyanin rau dền. .. nguyên liệu rau, củ Quả ña dạng - Xác ñịnh thành phần chất màu anthocyanin chiết tách từ rau dền ñỏ chưa ñược nghiên cứu, ứng dụng có hiệu cao - Nghiên cứu ñộ bền màu anthocyanin từ rau dền ñỏ phụ... Xác ñịnh thành phần chất màu anthocyanin rau dền ñỏ Đ bền màu anthocyanin rau dền ñỏ 535 nm nằm vùng λmax anthocyanin (510nm ÷ 540nm) Với kết chứng tỏ rau dền ñỏ có diện hợp chất màu anthocyanin