Mục tiêu nghiên cứu này là đánh giá sự lưu hành và phân tích các đặc điểm phân phân tử của MRV. Qua kiểm tra 80 mẫu swab phân của chó (30 chó tiêu chảy, 50 chó khỏe) bằng RT-PCR, cho thấy tỷ lệ lưu hành trên nhóm chó bệnh (50%) cao hơn nhóm chó khỏe (2%), chứng tỏ MRV là tác nhân chính gây tiêu chảy trên chó. Tổng cộng có 4 chủng MRV phân lập thành công trên môi trường tế bào A72/cSLAM. Mời các bạn cùng tham khảo!
PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH SEROTYPE CỦA MỘT SỐ CHỦNG MAMMALIAN ORTHOREOVIRUS TRÊN CHĨ TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Nguyễn Văn Dũng1, Lê Việt Bảo1, Ken Maeda2 Chi cục Chăn nuôi Thú y thành phố Hồ Chí Minh Phịng thí nghiệm Vi sinh Thú y, Đại học Yamaguchi, Nhật Bản TĨM TẮT Mammalian orthoreovirus (MRV) gây bệnh người nhiều loài động vật Trong đó, chó loại vật ni thường tiếp xúc với người nên nguy lây bệnh từ loài vật cao Bệnh MRV chó báo cáo nhiều nước, nhiên Việt Nam thiếu thông tin MRV Mục tiêu nghiên cứu đánh giá lưu hành phân tích đặc điểm phân phân tử MRV Qua kiểm tra 80 mẫu swab phân chó (30 chó tiêu chảy, 50 chó khỏe) RT-PCR, cho thấy tỷ lệ lưu hành nhóm chó bệnh (50%) cao nhóm chó khỏe (2%), chứng tỏ MRV tác nhân gây tiêu chảy chó Tổng cộng có chủng MRV phân lập thành công môi trường tế bào A72/cSLAM Kết định serotype cho thấy 01 chủng thuộc serotype chủng thuộc serotype Các chủng serotype phân lập có độ tương đồng cao với chủng MRV phân lập heo từ Trung Quốc Chủng MRV-2 phân lập có độ tương đồng cao với chủng gây bệnh phân lập người từ Trung Quốc Điều cho thấy có truyền lây loài động vật khác nhau, lây động vật người Các chủng MRV phân lập ứng viên tiềm cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine, chế phẩm sinh học ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, nhiều loại virus gây bệnh chung người động vật có xu hướng ngày gia tăng, đặc biệt mầm bệnh từ loại vật nuôi thường xuyên tiếp xúc thường xuyên với người chó, mèo Trong đó, mammalian orthoreovirus (MRV) ghi nhận gây bệnh viêm dày ruột gây viêm não người [1], chó ghi nhận gây triệu chứng chảy nước bọt, ói, tiêu chảy gây hội chứng hệ thống hô hấp [2] MRV có cấu trúc di truyền sợi đơi RNA, thuộc giống Orthoreovirus họ Reovidae MRV có cấu trúc gồm 10 đoạn gen đặt tên theo kích thước gen gen “lớn” (Large) L1, L2, L3; gen “vừa” (Medium), M1, M2 M3; gen “nhỏ” (Small), S1, S2, S3 S4 (Hình 1) Trong đó, gen S1 mã hóa protein σ1, protein nằm vỏ virus có vai trị quan trọng việc công vào thụ thể bề mặt tế bào Vì protein σ1 yếu tố xác định serotype virus [3] MRV phân chia thành serotype bao gốm serotype (Lang), serotype (D5/Jones), serotype (Dearing) serotype (Ndelle) phản ứng trung hòa virus ức chế ngưng kết [4] Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử, phân tích trình tự nucleotide S1 xác định serotype virus có tương đồng với serotype virus 1043 Hình Sơ đồ cấu tạo tổ chức hệ gen MRV Gen S1 (Small gen) nghiên cứu định type virus Bệnh MRV gây chó báo cáo số nước Ý, Mỹ [2,3] Tuy nhiên, thiếu thơng tin bệnh MRV chó Việt Nam, đặc biệt Thành phố Hồ Chí Minh Vì mục tiêu nghiên cứu tìm hiểu tình hình lưu hành đặc điểm dịch tể học phân tử MRV Việt Nam VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Nội dung Đánh giá tỷ lệ lưu hành MRV nhóm chó khỏe chó bệnh tiêu chảy Phân lập xác định genotype MRV chó ni Thành phố Hồ Chí Minh 2.2 Ngun liệu Mẫu dịch ngốy trực tràng (swab): Tổng cộng 50 mẫu swab trực tràng có khỏe 30 mẫu chó tiêu chảy Thành phố Hồ Chí Minh, có độ tuổi từ tháng đến 13 năm tuổi Mẫu swab hòa tan dung dịch đệm PBS, bảo quản -800C thực thí nghiệm Tế bào: Tế bào A72/cSLAM nuôi cấy môi trường DMEM (Dulbecco‟s minimum essential medium ( Life Technologies, USA) Vật tƣ, hóa chất thiết bị: Kít ly trích RNA, kit PCR, kit tinh DNA, kit giải trình tự, tủ an tồn sinh học Clsass II, tủ ấm, máy ly tâm, máy luân nhiệt PCR, kính hiển vi đảo ngược…v.v hóa chất, vật dụng thường qui phịng thí nghiệm khác 2.3 Phƣơng pháp nguyên cứu RT-PCR phát RNA MRV : Để phát lưu hành MRV đàn chó, RT-PCR thực với cặp mồi L1RV5, 5'- GCATCCATTGTAAATGACGAGTCTG-3' L1-RV6, 5'CTTGAGATTAGCTCTAGCATCTTCTG-3 [5], khuyếch đại vùng gene L1 với sản phẩm PCR có kích cỡ 416bp Bộ kit Viral RNA mini kit (Qiagen) sử dụng cho việc ly trích RNA virus từ mẫu bệnh phẩm, kít One step RT- PCR (Qiagen) sử dụng cho việc khuyếch đại gene L1, phản ứng thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm PCR có kích cỡ 416bp phát kỹ thuật điện di gel agarose 2% Sản phẩm PCR mẫu dương tính đựợc tinh kit QIAquick PCR Purification (Qiagen) dùng cho việc giải trình tự 1044 Xác định genotype MRV : RT-PCR thực với cặp mồi S1F, 5'-GCT ATT SGY RCB KAT G-3' S1R, 5'- GAT KRR WNB CCV YHG TGC CG-3' để xác định MRV-1 MRV-2 Cặp mồi S1-R3F, 5'-TGG GAC AAC TTG AGA CAG GA-3' and S1R dùng xác định genotype MRV-1 Nuôi cấy phân lập virus: Các mẫu bệnh phẩm có kết dương tính với RT-PCR tiến hành nuôi cấy virus môi trường tế bào A72/cSLAM Tế bào nuôi cấy môi trường DMEM ( Dulbecco‟s minimum essential medium (Life Technologies, USA) chứa 10% FBS (FBS; Sigma-Aldrich, USA), 100 đơn vị/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin (Life Technologies) Tế bào fcwf-4 lớp đĩa nuôi cấy giếng thêm vào dung dịch mẫu swab (sau lọc qua màng lọc) ủ 37°C với 5% CO2 Tế bào gây nhiễm theo dõi, kiểm tra bệnh tích tế bào (CPE- cytopathic effect) hàng ngày Nếu khơng phát bệnh tích tế bào tiếp tục cấy truyền lần Phân tích liệu: Xây dựng phát sinh dòng sử dụng phương pháp Neighbor-Joining với phần mềm MEGA 6.0 [4] Giá trị Bootstrap tính tốn với 1,000 lặp lại Trình tự amino acid suy diễn từ trình tự nucleotide dựa vào phần mềm MEGA KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tỷ lệ nhiễm MRV chó bệnh tiêu chảy chó khỏe mạnh Tỷ lệ MRV nhiễm chó tiêu chảy (50%, 15/30) cao có ý nghĩa so với tỷ lệ nhiễm chó khỏe mạnh (4%, 2/50) Tỷ lệ nhiễm MRV khác biệt khơng có ý nghĩa so sánh theo lứa tuổi, giống giới tính Tỷ lệ nhiễm đơn ghi nhận chó tiêu chảy, tỷ lệ nhiễm kép MRV với CPV hay CDV ghi nhận chó tiêu chảy, tỷ lệ nhiễm mầm bệnh gồm MRV, CDV CkoV ghi nhận chó tiêu chảy (Bảng 1) Tỷ lệ lưu hành MRV chó tiêu chảy (50%) cao chó khỏe mạnh (2%), cho thấy chủng MRV Việt nam tác nhân gây bệnh tiêu chảy chó, kết hợp đồng nhiễm với số virus đường ruột khác Đặc biệt, có chó tiêu chảy phát nhiễm MRV, điều minh chứng rõ ràng MRV tác nhân gây bệnh tiêu chảy chó Một thử nghiệm gây nhiễm chủng IU41(MRV-1, phân lập từ nước tiểu chó khỏe mạnh) chó trưởng thành khơng biểu dấu hiệu lâm sàng [6] Trái lại, gây nhiễm chủng MRV-1 phân lập từ chó bệnh biểu lâm sàng chảy nước bọt, ói, tiêu chảy máu chó gây nhiễm biểu dấu hiệu lâm sàng bệnh [2] Điều cho thấy tính gây bệnh MRV khác tùy thuộc vào chủng,có nghĩa chủng khác khác độc lực 3.2 Phân lập virus phân tích trình tự gene S1 chủng phân lập Tổng cộng có chủng MRV phân lập thành công đặt tên chủng sau: MRV/dog/HCM9, MRV/dog/HCM16, MRV/dog/HCM19 MRV/dog/HCM69 (Bảng 1) Trên môi trường ni cấy tế bào A72/cSALM, MRV gây bệnh tích tế bào vịng 3-4 ngày sau ni cấy Tế bào nhiễm biểu bệnh tích tạo hạt, co lại, bong tróc khỏi đĩa ni cấy (Hình 3) 1045 Bảng Thơng tin mẫu dương tính với MRV RT-PCR phân lập virus Ký hiệu RT-PCR Phân lập virus MRV MRV Triệu chứng lâm sàng Sự đồng nhiễm với loại virus khác* Tiêu chảy, tiết dịch mắt + - Tiêu chảy + CPV Tiêu chảy, tiết dịch mắt + CPV Tiêu chảy + CPV Tiêu chảy, tiết dịch mũi + 10 Tiêu chảy + CDV 11 Tiêu chảy, ho + CDV 12 Tiêu chảy, tiết dịch mắt + CDV 14 Tiêu chảy, ho + CDV, CPV 15 Tiêu chảy + - 16 Tiêu chảy + 17 Tiêu chảy + 18 Tiêu chảy, ho + 19 Tiêu chảy, tiết dịch mắt + 20 Tiêu chảy + CPV, CDV 52 Không + CDV 69 Không + MRV-2 MRV-3 CPV, CDV, CKoV CDV, CKoV CPV MRV-3 MRV-3 CDV CKoV CPV, canine parvovirus; CDV, canine distemper virus; CCoV, canine coronavirus; MRV, mammalian orthoreovirus; CKoV, canine kobuvirus; +, positive; -, negative; (*):CPV, CDV CCoV xét nghiệm nghiên cứu trước kỹ thuật PCR RT-PCR Phân tích phát sinh lồi dựa gene S1 (Hình 1) cho thấy chủng phân lập MRV/dog/HCM9 thuộc genotype 2, chủng lại thuộc genotype (Hình 2) Chủng MRV/dog/HCM9 (genotype 2, MRV-2) tương đồng cao (94.6%,aa) với chủng 302II, chủng gây bệnh người phân lập từ Trung Quốc [7], chủng lại tương đồng cao (từ 95.2-96.1%,aa) với chủng MRV phân lập từ heo Trung Quốc (SC-A) ( Bảng 2) Mức độ tương đồng chủng MRV-3 phân lập Việt nam so sánh nucleotide amio acid từ 98.0%-99.5% 97.3%-98.6%, tương ứng Tỷ lệ nhiễm MRV ghép với chủng virus gây bệnh đường ruột khác CPV, CDV, CCoV… gây nhiều khó khăn chẩn đoán dựa vào dấu hiệu lâm sàng để chẩn đốn, gây khơng khó khăn phòng bệnh, đặc biệt phòng bệnh vaccine phải sử dụng nhiều loại vaccine với serotype phù hợp với virus trường Hiện tại, nhiều loại vaccine thương mại sẵn có cho phịng bệnh CDV, CPV CCoV Tuy nhiên, vaccine phòng bệnh cho MRV chưa quan tâm nghiên cứu Việc phân lập thành công chủng MRV Việt nam tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu sâu đặc tính sinh học, tính kháng ngun để tìm chủng ứng viên cho việc sản xuất vaccine phòng 1046 bệnh MRV, sinh phẩm dung cho việc chẩn đốn phịng trị bệnh Nhiều chủng MRV-3 nghiên cứu ứng dụng điều trị bệnh ung thư người Các chủng phân lập ứng viên sử dụng liệu pháp điều trị ưng thư người Tuy nhiên, cần có nghiên cứu độc lực MRV Bảng So sánh mức độ tương đồng gen L1 chủng MRV phân lập chủng MRV khác công bố (nt/aa) Chủng phân lập MRV propotype Bat reovirus RpMRV T3/Bat/ -YN2012 342/08 MRV/dog/HCM9/ 58.5/52.4 62.4/61.8 41.9/25.4 42.6/23.2 2013 41.4/24.5 MRV/dog/HCM16 41.4/27.5 42.8/27.6 84.4/90.6 68.2/66.4 /2013 T1L T2J T3D T4N Human reovirus Pig reovirus 302II SI-MRV01 GD-1 SC-A 83.3/91.0 93.2/94.6 41.2/24.3 42.2/24.5 41.4/24.9 41.6/25.6 79.5/86.9 41.8/24.5 79.9/87.2 93.1/94.3 94.8/95.2 MRV/dog/HCM19 41.3/25.6 42.7/27.0 84.2/90.2 68.3/66.8 /2013 41.7/25.6 79.4/86.0 41.9/24.9 79.8/87.4 92.9/94.0 94.7/95.2 MRV/dog/HCM69 41.0/25.4 42.8/26.8 84.1/90.2 68.3/67.0 /2015 42.0/25.4 79.9/87.4 41.8/24.9 80.2/87.9 92.9/94.5 95.0/96.1 Hình Phân tích phát sinh lồi dựa vào trình tự nucleotide gen S1 MRV Các chủng MRV-3 phân lập chó có mức động tương đồng cao với chủng MRV phân lập heo từ Trung Quốc (SC-A), điều cho thấy có lây qua lại lồi động vật, có truyền lây nước Chủng MRV-2 phân lập chó Việt nam chó mức độ tương đồng cao với chủng gây bệnh người Trung Quốc (302II), có lây nhiễm bệnh động vật người Nếu chó có nhiễm chủng MRV có độc lực cao khả lây nhiễm cho người lớn, có nhiều hội tiếp xúc người vật ni đùa giỡn, chăm sóc hàng ngày chủ vật nuôi, tiếp xúc trình khám chữa bệnh vật ni bác sĩ Thú y, kỹ thuật viên Thú y Cần có nghiên cứu sâu đặc tính sinh học, tính kháng nguyên độc lực MRV nhằm tìm chủng ứng 1047 viên cho sản xuất vaccine, sinh phẩm chẩn đốn xa ứng dụng chủng liệu pháp điều trị ưng thư A A B B Hình Kết phân lập MRV tế bào A72/cSLAM A) Tế bào phát triển bình thường B) MRV gây bệnh tích tế bào (tế bào co trịn, tạo hạt, bong tróc khỏi đáy đĩa ni cấy) KẾT LUẬN MRV tác nhân gây bệnh rối loại tiêu hóa, tiêu chảy chó Việt nam Trên chó bệnh tiêu chảy có lưu hành MRV-2 MRV-3, chủng có động tương đồng cao với chủng gây bệnh phân lập người heo có nguồn gốc từ Trung Quốc TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Steyer, A., Gutiérrez-Aguire, I., Kolenc, M., Koren, S., Kutnjak, D., Pokorn, M., Poljšak-Prijatelj, M., Racˇki, N., Ravnikar, M., Sagadin, M., Fratnik Steyer, A and Toplak, N 2013 High similarity of novel orthoreovirus detected in a child hospitalized with acute gastroenteritis to mammalian orthoreoviruses found in bats in Europe J Clin Microbiol 51: 3818-3825 [2] Lou, T Y., Wender, H A and Millien, J M 1963 Natural and experimental infection of dogs with reovirus, type 1: pathogenicity of the strain for other animals Am J Epidemiol 77: 293-304 [3] Decaro, N., Campolo, M., Desario, C., Ricci, D., Camero, M., Lorusso, E., Elia, G., Lavazza, A., Martella, V and Buonavoglia, C 2005 Virological and molecular characterization of a mammalian orthoreovirus type strain isolated from a dog in Italy Vet Microbiol 109: 19-27 [4] Sabin, A B 1959 Reoviruses: A new group of respiratory and enteric viruses formerly classified as ECHO type 10 is described Science 130: 1387-1389 [5] Leary, T P., Erker, J C., Chalmers, M L., Cruz, A T., Wetzel, J D., Desai, S M., Mushahwar, I K and Dermody, T S 2002 Detection of mammalian reovirus RNA by using reverse transcription PCR: sequence diversity within the lambda encoding L1 gene J Clin Microbiol 40: 1368-1375 [6] Murakami, T., Ogawa, T., Abe, K and Hirano, N 1979 Reovirus isolation from healthy dogs in Japan Vet Microbiol 4: 255-259 [7] Song L, Zhou Y, He J, Zhu H, Huang R, Mao P, Duan Q 2008 Comparative sequence analyses of a new mammalian reovirus genome and the mammalian reovirus S1 genes from six new serotype human isolates Virus genes, 37:392-399 1048 ... dịch tể học phân tử MRV Việt Nam VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Nội dung Đánh giá tỷ lệ lưu hành MRV nhóm chó khỏe chó bệnh tiêu chảy Phân lập xác định genotype MRV chó ni Thành phố Hồ Chí Minh 2.2... tiêu chảy chó Một thử nghiệm gây nhiễm chủng IU41(MRV-1, phân lập từ nước tiểu chó khỏe mạnh) chó trưởng thành khơng biểu dấu hiệu lâm sàng [6] Trái lại, gây nhiễm chủng MRV-1 phân lập từ chó bệnh... Gen S1 (Small gen) nghiên cứu định type virus Bệnh MRV gây chó báo cáo số nước Ý, Mỹ [2,3] Tuy nhiên, thiếu thông tin bệnh MRV chó Việt Nam, đặc biệt Thành phố Hồ Chí Minh Vì mục tiêu nghiên cứu