HƯỚNG DẪN XÉT NGHIỆM VI RÚT VIÊM GAN B, C

Cơ quan phát hành: Bộ Y tế BỘ Y TẾ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc _ _ Hà Nội, ngày tháng năm Số: / HƯỚNG DẪN XÉT NGHIỆM VI RÚT VIÊM GAN B, C (Ban hành theo định /QĐ-BYT ngày tháng năm 2020 Bộ trưởng Bộ Y tế) Phần I QUY ĐỊNH CHUNG Phạm vi hướng dẫn 1.1 Xét nghiệm vi rút viêm gan B, C chẩn đoán, theo dõi, điều trị phòng ngừa lây nhiễm vi rút viêm gan B, C 1.2 Thực bảo đảm chất lượng xét nghiệm vi rút viêm gan B, C 1.3 Tổ chức thực Mục đích xét nghiệm 2.1 Phát hiện, chẩn đốn, theo dõi điều trị phòng ngừa lây nhiễm vi rút viêm gan B, C 2.2 Đảm bảo an toàn truyền máu, cấy ghép mô/tạng, thụ tinh nhân tạo 2.3 Giám sát dịch tễ nhiễm vi rút viêm gan B C nghiên cứu khoa học Nguyên tắc xét nghiệm 3.1 Đảm bảo tính bảo mật tự nguyện 3.2 Cung cấp thông tin trước xét nghiệm tư vấn sau xét nghiệm 3.3 Tuân thủ phương cách, quy trình xét nghiệm 3.4 Đảm bảo chất lượng xét nghiệm 3.5 Kết nối với chương trình dự phịng, chăm sóc điều trị Phương pháp kỹ thuật xét nghiệm Các xét nghiệm chẩn đoán vi rút viêm gan B C chia thành hai nhóm kỹ thuật xét nghiệm 4.1 Xét nghiệm huyết học Là xét nghiệm phát kháng nguyên kháng thể đặc hiệu hai vi rút viêm gan B, C kỹ thuật xét nghiệm dựa nguyên lý miễn dịch Theo mức độ đơn giản kỹ thuật xét nghiệm, điều kiện sở vật chất cần thiết, xét nghiệm huyết chia thành dạng 4.1.1 Xét nghiệm nhanh (Rapid Diagnostic Test - RDT): Cách thực đơn giản, cho kết nhanh 4.1.2 Xét nghiệm phòng xét nghiệm (Laboratory-based assays), sử dụng kỹ thuật theo nguyên lý miễn dịch đánh dấu, ví dụ: - Miễn dịch gắn men (Enzyme Linked Immunoarobent Assays - ELISA) - Miễn dịch hoá phát quang (Chemoluminescence Immunoassay - CLIA) - Miễn dịch điện hoá phát quang (Electrochemoluminescence Immunoassay ECLIA) - Miễn dịch vi hạt gắn men (Microparticle enzyme Immunoassays - MEIA) - Miễn dịch vi hạt hoá phát quang (Chemiluminesence microparticle Immunoassays-CMIA) Các xét nghiệm huyết học chủ yếu thực mẫu huyết thanh, huyết tương Xét nghiệm nhanh thực mẫu máu toàn phần, dịch miệng 4.2 Xét nghiệm sinh học phân tử - Định tính: phát HBV DNA, HCV RNA kỹ thuật tổng hợp chuỗi (Polymerase Chain Reaction - PCR) khuyếch đại vật liệu di truyền HBV, HCV - Định lượng (tải lượng) HBV, HCV: xác định mật độ vi rút máu kỹ thuật tổng hợp chuỗi định lượng (Real-time PCR) vật liệu di truyền HBV, HCV Đây xét nghiệm cần cho định điều trị theo dõi điều trị viêm gan vi rút mạn thuốc kháng vi rút - Kiểu gien HBV, HCV: thực phải lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp với kiểu gien vi rút (đối với bệnh nhân viêm gan C) người bệnh chẩn đoán thất bại điều trị nghi ngờ kháng thuốc - Theo mức độ đơn giản kỹ thuật xét nghiệm, điều kiện sở vật chất cần thiết, xét nghiệm sinh học phân tử, chia thành dạng: + Xét nghiệm điểm chăm sóc (Point of Care Test): sử dụng thiết bị đơn giản có khả thực tuyến y tế sở cho kết nhanh + Xét nghiệm phòng xét nghiệm (Laboratory - based assays) hệ thống tự động (automatic), bán tự động (semi-automatic) thao tác thủ công Phần II HƯỚNG DẪN XÉT NGHIỆM VI RÚT VIÊM GAN B TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU TRỊ Đối tượng xét nghiệm 1.1 Người sinh trước năm 2003 - năm triển khai chương trình vắc xin viêm gan B cho trẻ tuổi toàn quốc 1.2 Người đến tư vấn, xét nghiệm phòng khám tư vấn xét nghiệm HIV, lao 1.3 Phụ nữ mang thai 1.4 Người có hành vi nguy lây nhiễm HBV: người nhiễm HIV, người tiêm chích ma tuý, nam quan hệ tình dục đồng giới, phụ nữ mại dâm, phạm nhân, người có quan hệ tình dục khơng an tồn 1.5 Người có biểu nghi ngờ mắc viêm gan: có triệu chứng lâm sàng viêm gan xét nghiệm men gan tăng 1.6 Người bệnh phải lọc máu, truyền máu chế phẩm máu 1.7 Người bệnh trước điều trị ức chế miễn dịch, hoá trị liệu 1.8 Nhân viên y tế chưa tiêm vắc xin viêm gan B 1.9 Người hiến máu, người hiến tạng, người cho trứng, tinh trùng 1.10 Bạn tình, cái, thành viên gia đình có tiếp xúc gần gũi với người nhiễm HBV 1.11 Người có tiền sử tiêm, làm thủ thuật khơng an tồn 1.12 Các đối tượng khác theo yêu cầu Chiến lược xét nghiệm 2.1 Các xét nghiệm vi rút viêm gan B Bảng 1: Các xét nghiệm vi rút viêm gan B Xét nghiệm Mục đích xét nghiệm Kỹ thuật xét nghiệm Xét nghiệm định tính để chẩn đốn nhiễm HBV - Xét nghiệm nhanh (RDTs) - Miễn dịch đánh dấu Xét nghiệm định lượng HBsAg để theo dõi điều trị - Miễn dịch đánh dấu Xét nghiệm định tính xác định xuất kháng thể trung hoà anti-HBs - Test nhanh (RDTs) - Miễn dịch đánh dấu Xét nghiệm định lượng xác định mức kháng thể trung hoà anti-HBs, đánh giá mức miễn dịch bảo vệ Miễn dịch đánh dấu anti-HBc total Xác định phơi nhiễm HBV - Test nhanh (RDTs) anti-HBc IgG Xác định phơi nhiễm HBV Miễn dịch đánh dấu anti-HBc IgM Xác định nhiễm HBV cấp Miễn dịch đánh dấu HBeAg - Xác định khả lây truyền vi rút người nhiễm HBV - Xác định giai đoạn bệnh quản lý lâm sàng - Test nhanh (RDTs) - Miễn dịch đánh dấu anti-HBe - Xác định chuyển đảo huyết HBeAg - Xác định giai đoạn bệnh quản lý lâm sàng - Test nhanh (RDTs) - Miễn dịch đánh dấu Định tính HBV DNA Khẳng định có HBV lưu hành máu Nucleic axit testing (NAT), định tính Tải lượng HBV Xác định mật độ HBV lưu hành máu Nucleic axit testing (NAT), định lượng Kiểu gien HBV Xác định kiểu gien HBV, đột biến kháng thuốc Giải trình tự, kỹ thuật sinh học phân tử khác HBsAg anti-HBs - Miễn dịch đánh dấu 2.2 Chiến lược xét nghiệm chẩn đoán nhiễm HBV 2.2.1 Xét nghiệm HBsAg - Xét nghiệm nhiễm HBV thực xét nghiệm phát kháng nguyên HBsAg - Sử dụng kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch xét nghiệm nhanh (RDTs), xét nghiệm miễn dịch đánh dấu (EIAs, CLIAs, ECLs ) - Khi phải khẳng định lại kết xét nghiệm HBsAg, cần áp dụng kỹ thuật khẳng định (HBsAg confirmation) Xét nghiệm HBsAg HBsAg (+)/có phản ứng Báo cáo kết dương tính HBsAg (-)/khơng phản ứng Báo cáo kết âm tính Nhiễm HBV Khơng nhiễm HBV • • • Tư vấn sau xét nghiệm Xét nghiệm HBV DNA Đánh giá giai đoạn bệnh • • Tư vấn phịng bệnh Tiêm phịng vắc xin Hình 1: Chiến lược xét nghiệm HBV * Phiên giải kết tư vấn sau xét nghiệm HBsAg - Người có kết xét nghiệm HBsAg (+): + Nhiễm HBV + Người bệnh cần xét nghiệm dấu ấn khác HBV, tải lượng HBV xét nghiệm hóa sinh, huyết học để xác định nhiễm HBV cấp hay mạn, đánh giá tiêu chuẩn điều trị theo dõi tiến triển + Người bệnh cần tư vấn chế độ ăn uống, sinh hoạt để ngăn ngừa tổn thương gan biện pháp giảm nguy lây truyền HBV - Người có kết xét nghiệm HBsAg (-): Khơng có chứng nhiễm HBV 2.2.2 Xét nghiệm anti-HBs để xác định tình trạng miễn dịch bảo vệ với HBV 2.2.3 Xét nghiệm huyết học phát dấu ấn vi rút viêm gan B khác - Người có xét nghiệm HBsAg dương tính cần làm xét nghiệm huyết học để phát dấu ấn viêm gan B khác (Hình Sơ đồ xét nghiệm chẩn đốn nhiễm vi rút viêm gan B) HBsAg (+) Xét nghiệm anti-HBc (IgM, IgG, total) HBeAg/anti-HBe An -HBc IgM (-) An -HBc IgG (+) Viêm gan B mạn HBeAg(+) HBeAg (-) An -HBc IgM (+) Viêm gan B cấp Xét nghiệm tải lượng HBV Hình 2: Sơ đồ xét nghiệm chẩn đoán nhiễm vi rút viêm gan B 2.2.4 Xét nghiệm tải lượng HBV - Xét nghiệm tải lượng HBV nên thực cho tất trường hợp có HBsAg dương tính để đánh giá tiêu chuẩn điều trị (Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị bệnh viêm gan vi rút B ban hành theo định số 3310/QĐ-BYT ngày 29 tháng năm 2019 Bộ trưởng Bộ Y tế) - Kết xét nghiệm tải lượng HBV cần báo cáo quy đổi theo đơn vị quốc tế IU/ml 2.2.5 Tổng hợp phiên giải kết xét nghiệm dấu ấn HBV Tình trạng nhiễm HBV xác định dựa phân tích tổng hợp kết xét nghiệm dấu ấn HBV (Bảng 2) Bảng 2: Phiên giải kết xét nghiệm vi rút viêm gan B Kháng thể trung hoà anti-HBs sau tiêm vắc xin sau nhiễm HBV 10 IU/ml có miễn dịch bảo vệ * 2.3 Xét nghiệm huyết học HBV tải lượng HBV theo dõi điều trị 2.3.1 Người bệnh viêm gan vi rút B mạn chưa điều trị Xét nghiệm HBeAg, anti-HBe định kỳ 24-48 tuần Xem xét thực xét nghiệm tải lượng HBV định kỳ 24-48 tuần 2.3.2 Người bệnh viêm gan vi rút B mạn điều trị - Khi bệnh ổn định (khơng có triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm AST ALT < lần giới hạn khoảng sinh học tham chiếu (ULN) có đáp ứng vi rút ban đầu): làm xét nghiệm HBeAg (nếu HBeAg dương tính) anti-HBe (nếu HBeAg âm tính) lần tái khám định kỳ - Xét nghiệm tải lượng HBV tuần điều trị thứ 12, 24 48 Sau thực định kỳ 24-48 tuần lần ALT tăng không rõ nguyên nhân để đánh giá đáp ứng điều trị khả tái hoạt người bệnh không tuân thủ điều trị - Xét nghiệm tải lượng HBV theo dõi điều trị nên thực hệ thống xét nghiệm 2.3.3 Người bệnh viêm gan vi rút B mạn ngừng điều trị Trong năm đầu sau ngừng thuốc, xét nghiệm tải lượng HBV định kỳ 12 tuần lần Sau định kỳ 24-48 tuần lần 2.4 Xét nghiệm phân tích đột biến kháng thuốc Nên thực xét nghiệm kiểu gien HBV, phân tích đột biến kháng thuốc cho trường hợp thất bại điều trị để phát khẳng định tình trạng kháng thuốc Phần III HƯỚNG DẪN XÉT NGHIỆM VI RÚT VIÊM GAN C TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU TRỊ Đối tượng xét nghiệm vi rút viêm gan C 1.1 Người có nguy cao nhiễm HCV: người nhiễm HIV, người tiêm chích ma tuý, nam quan hệ tình dục đồng giới, phụ nữ mại dâm, phạm nhân, người có hành vi quan hệ tình dục khơng an tồn 1.2 Người có biểu nghi ngờ mắc viêm gan: có triệu chứng lâm sàng viêm gan xét nghiệm có men gan tăng 1.3 Người bệnh phải lọc máu, truyền máu chế phẩm máu 1.4 Người bệnh trước điều trị ức chế miễn dịch, hoá trị liệu 1.5 Người hiến máu, người hiến tạng, người cho trứng, tinh trùng 1.6 Bạn tình, cái, thành viên gia đình có tiếp xúc gần gũi với người nhiễm HCV 1.7 Người có tiền sử tiêm, làm thủ thuật khơng an tồn 1.8 Các đối tượng khác theo yêu cầu Chiến lược xét nghiệm 2.1 Các loại xét nghiệm chẩn đoán nhiễm vi rút viêm gan C 2.1.1 Xét nghiệm phát anti-HCV: xét nghiệm ban đầu để xác định tình trạng phơi nhiễm HCV Người bệnh có kết dương tính chứng tỏ có phơi nhiễm HCV, cần thực tiếp xét nghiệm chẩn đoán để xác định tình trạng nhiễm HCV 2.1.2 Xét nghiệm chẩn đoán: xét nghiệm chẩn đoán dựa vào việc phát kháng nguyên RNA HCV máu 2.2 Chiến lược xét nghiệm chẩn đoán 2.2.1 Xét nghiệm phát anti-HCV - Xét nghiệm kháng thể anti-HCV sử dụng loại xét nghiệm miễn dịch xét nghiệm nhanh (RDTs) xét nghiệm miễn dịch phòng xét nghiệm (ELISA, CLIA, ECLIA…) - Khi phải khẳng định lại kết xét nghiệm anti-HCV, cần áp dụng kỹ thuật khẳng định (anti-HCV confirmation) Xét nghiệm anti-HCV Anti-HCV (+)/có phản ứng Báo cáo kết dương tính Nhiễm HCV khứ Tiến hành xét nghiệm HCV RNA* Anti-HCV (-)/không phản ứng Báo cáo kết âm tính Khơng có chứng huyết học nhiễm HCV * Khi không thực xét nghiệm HCV RNA làm xét nghiệm HCVcAg Hình 3: Chiến lược xét nghiệm phát HCV * Phiên giải kết quả: - Người có kết xét nghiệm anti-HCV (+) có nghĩa nhiễm HCV nhiễm HCV Để chẩn đoán nhiễm HCV cần xét nghiệm HCV RNA HCVcAg (mục 2.2.2) - Người có kết xét nghiệm anti-HCV (-) có nghĩa khơng nhiễm HCV Cần tư vấn dự phòng nhiễm HCV Cần xét nghiệm lại tiếp tục có nguy nhiễm HCV 2.2.2 Xét nghiệm chẩn đoán nhiễm HCV - Người bệnh có kết anti-HCV dương tính cần xét nghiệm khẳng định tình trạng nhiễm HCV xét nghiệm sau: + Xét nghiệm tải lượng HCV + Xét nghiệm định tính HCV RNA + Xét nghiệm phát kháng nguyên lõi HCVcAg - Chẩn đoán nhiễm HCV khi: + Kết tải lượng HCV giới hạn phát hiện, + Định tính HCV RNA dương tính, + Kháng nguyên HCVcAg dương tính Phụ lục XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU TRỊ VIÊM GAN VI RÚT B MẠN Xét nghiệm huyết học (Ban hành kèm theo Quyết định số /QĐ-BYT ngày Bộ trưởng Bộ Y tế) HBsAg (+): Nhiễm HBV HBsAg (+) ≥ tháng HBsAg (+) anti-HBc IgM (-) Đánh giá tiêu chuẩn điều trị Theo dõi HBsAg (-): Không nhiễm HBV HBsAg (+) anti-HBc IgM (+) Tư vấn tiêm vắcxin XN anti-HBs, Viêm gan vi rút B cấp Điều trị theo hướng dẫn Đánh giá giai đoạn bệnh gan: khám lâm sàng, đo độ đàn hồi gan (APRI, fibroscan, ) Siêu âm gan, xét nghiệm chức gan khác cần thiết Xét nghiệm: CTM/tiểu cầu, AST/ALT, creatinine/độ thải creatinine Xét nghiệm HBeAg, anti-HBe, tải lượng HBV Xơ gan - ALT ≥ lần bình thường - Tải lượng HBV > 20.000 IU/mL - HBeAg (+) - ALT ≥ lần bình thường - Tải lượng HBV> 2.000 IU/mL - HBeAg (-) Điều trị thuốc kháng vi rút - năm 2020 Xét nghiệm phát HBsAg ( Viêm gan vi rút B mạn tháng Không xơ gan: - Trên 30 tuổi ALT mức bình thường kéo dài lần 24-48 tuần tải lượng HBV > 20.000 IU/mL, tình trạng HBeAg - Tiền sử gia đình có HCC xơ gan - Có biểu ngồi gan Theo dõi độc tính thuốc người bệnh điều trị Xét nghiệm: - Creatinine/độ thải creatinine - Công thức máu - Chức tuyến giáp, khác, … Theo dõi đáp ứng điều trị - Khi bệnh ổn định (không có triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm AST ALT < lần giới hạn khoảng sinh học tham chiếu (ULN) có đáp ứng vi rút làm xét nghiệm HBeAg/antiHBe tái khám định kỳ - Xét nghiệm tải lượng HBV tuần điều trị thứ 12, 24 48 Sau thực định kỳ 24-48 tuần lần ALT tăng không rõ nguyên nhân để đánh giá đáp ứng điều trị khả tái hoạt người bệnh không tuân thủ điều trị Phát sớm ung thư gan cho người bệnh điều trị/ngừng điều trị Siêu âm xét nghiệm AFP 6-12 tháng/1 lần cần Người bệnh viêm gan vi rút B mạn chưa có định điều trị - Xét nghiệm HBeAg, anti-HBe định kỳ 24-48 tuần - Cân nhắc thực xét nghiệm tải lượng HBV định kỳ 24-48 tuần Phụ lục XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU TRỊ VIÊM GAN VI RÚT C (Ban hành kèm theo Quyết định số /QĐ-BYT ngày tháng năm 2020 Bộ trưởng Bộ Y tế) Xét nghiệm chẩn đoán nhiễm HCV Điều trị HCV Xét nghiệm huyết học Xét nghiệm phát anti-HCV Anti-HCV (+) Anti-HCV (-) Nhiễm HCV khứ Không nhiễm HCV Xét nghiệm chẩn đoán viêm gan vi rút C mạn: Xét nghiệm tải lượng HCV, định tính HCV RNA kháng nguyên lõi HCVcAg Tải lượng HCV ngưỡng phát HCV RNA dương tính HCVcAg dương tính Tải lượng HCV khơng phát HCV RNA âm tính HCVcAg âm tính Viêm gan vi rút C mạn Đánh giá giai đoạn bệnh gan Lâm sàng, xơ hóa gan (APRI, Fibroscan…) Các xét nghiệm cần thiết khác Các cân nhắc khác để điều trị: Có bệnh khác kèm theo, khả tương tác thuốc, phụ nữ mang thai, trẻ em… Theo dõi Lựa chọn phác đồ DAA điều trị Ưu tiên phác đồ có tác dụng với kiểu gien Hiện không nhiễm HCV Cân nhắc yếu tố ưu tiên điều trị sớm: - Tăng nguy tử vong: có xơ hóa nặng, xơ gan - Tăng nguy xơ hóa gan: có đồng nhiễm HIV HBV, bệnh chuyển hóa - Có biểu gan - Cần giảm tỷ lệ nhiễm cộng đồng: nhân viên y tế, người tiêm chích… Đánh giá khỏi bệnh Xét nghiệm tải lượng HCV: Đạt SVR 12 sau kết thúc điều trị Phát ung thư gan nguyên phát Siêu âm xét nghiệm AFP 3- tháng/1 lần Phụ lục 3: HƯỚNG DẪN THU THẬP VÀ QUẢN LÝ BỆNH PHẨM XÉT NGHIỆM VI RÚT VIÊM GAN B, C (Ban hành kèm theo Quyết định số /QĐ-BYT ngày Bộ trưởng Bộ Y tế) tháng năm 2020 Các loại mẫu xét nghiệm yêu cầu xử lý, bảo quản mẫu: Loại mẫu Yêu cầu thời gian xử lý, bảo quản, xét nghiệm Mẫu máu tĩnh mạch Xét nghiệm toàn phần Huyết - Không sử dụng chất chống đông thu thập mẫu máu toàn phần - Tách huyết vòng 24 - Bảo quản 2-80C - Xét nghiệm huyết học vòng ngày, theo hướng dẫn sử dụng sinh phẩm xét nghiệm Huyết tương - Sử dụng chất chống đông thu thập mẫu máu tồn phần Lựa chọn chất chống đơng phù hợp theo hướng dẫn sử dụng sinh phẩm xét nghiệm - Tách huyết tương vòng theo hướng dẫn sinh phẩm xét nghiệm - Bảo quản 2-80C - Xét nghiệm huyết học vòng ngày, theo hướng dẫn sử dụng sinh phẩm xét nghiệm - Xét nghiệm sinh học phân tử thực với mẫu huyết tương, không sử dụng chống đông heparin, mẫu bảo quản -200C (cho xét nghiệm DNA), -800C (cho xét nghiệm RNA) Máu mao mạch đầu - Sử dụng ống mao quản theo hướng dẫn ngón tay - Ống mao quản có chất chống đơng phù hợp, có vạch thể tích - Mẫu cần xét nghiệm Dịch miệng (dịch tiết - Sử dụng dụng cụ lấy dịch miệng theo hướng dẫn từ lợi) nhà sản xuất - Mẫu cần xét nghiệm Giọt máu khô: - Bảo quản 40C tới tháng, bảo quản lâu -200C Máu toàn phần tĩnh - Chỉ sử dụng mẫu DBS loại mẫu mạch máu đầu nhà sản xuất sinh phẩm thẩm định ngón tay nhỏ lên bìa thấm, làm khô tự nhiên Phải tuân thủ yêu cầu loại mẫu xét nghiệm, điều kiện bảo quản mẫu nêu hướng dẫn sử dụng sinh phẩm nhà sản xuất Kỹ thuật lấy mẫu 2.1 Lấy máu đầu ngón tay 2.1.1 Chuẩn bị dụng cụ: Kim/lưỡi chích dùng lần có lẫy (lancet) chuyên dụng, ống mao quản tích phù hợp, găng tay, bơng thấm nước vô trùng, cồn 70 độ cồn I ốt, băng cá nhân, thùng đựng chất thải theo quy định 2.1.2 Chuẩn bị lấy máu - Nhân viên xét nghiệm điền đầy đủ thông tin người làm xét nghiệm (họ tên mã số năm sinh/tuổi) ngày lấy mẫu vào phiếu xét nghiệm xét nghiệm (trong trường hợp cần thiết), sát trùng tay đeo găng tay 2.1.3 Các bước thao tác - Xác định vị trí chích máu: Vị trí chích máu tốt mặt bên (trái phải ngón tay thứ (ngón giữa) thứ (ngón áp út); - Người làm xét nghiệm duỗi bàn tay xuống phía dưới; - Sát khuẩn vị trí lấy máu cồn 70 độ để khơ vịng 30 giây; - Để kim/lưỡi chích vng góc với mặt da đầu ngón tay ấn lẫy nhanh, mạnh dứt khốt Đảm bảo giữ kim chích góc khơng làm nghiêng; - Lau bỏ giọt máu (vì giọt máu thường có nhiều dịch tổ chức, tế bào ảnh hưởng đến kết xét nghiệm); - Đợi máu chảy thành giọt lớn, dùng ống mao quản hút đủ thể tích u cầu (khơng bóp nặn xung quanh chỗ chích máu để tránh tăng tiết dịch tổ chức mô ảnh hưởng đến chất lượng mẫu); - Bỏ kim/lưỡi chích vào hộp đựng vật sắc nhọn ống mao quản dùng hút mẫu máu vào hộp đựng rác thải y tế; - Sát trùng lại vị trí lấy máu cồn 70 độ băng lại; - Mẫu sau lấy cần tiến hành xét nghiệm theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.2 Lấy máu tĩnh mạch 2.2.1 Chuẩn bị dụng cụ - Bơm kim tiêm vơ trùng (có thể dùng bơm kim tiêm loại 5ml, kim cỡ 21G 23G), dụng cụ lấy máu hút chân không (kim, giá đỡ), ống hút chân khơng tích chất chống đông phù hợp với xét nghiệm cần thực hiện, pipette pasteur nhựa dùng lần (pipette có bóp gắn liền), ống đựng huyết thanh/huyết tương (nên sử dụng ống nhựa, thể tích 1,5 ml - 2,0 ml, nắp xốy, có khả chịu nhiệt độ âm mẫu cần bảo quản nhiệt độ âm), găng tay, trang, dây ga rô, thấm nước vô trùng, cồn 70 độ, bút (loại mực chịu nước), giá để ống nghiệm, thùng đựng vật sắc nhọn chất thải y tế - Lưu ý, dụng cụ lấy mẫu cho xét nghiệm sinh học phân tử phải đạt tiêu chuẩn khơng có DNase/RNase 2.2.2 Chuẩn bị lấy máu Nhân viên lấy mẫu điền đầy đủ thông tin người làm xét nghiệm (họ tên mã số năm sinh/tuổi) ngày lấy mẫu, người lấy mẫu, lấy mẫu vào phiếu xét nghiệm xét nghiệm (trong trường hợp cần thiết), sát trùng tay đeo găng tay 2.2.3 Các bước thao tác - Xác định vị trí lấy máu (tĩnh mạch), buộc băng garơ phía vị trí lấy máu sát khuẩn cồn 70 độ để khô vòng 30 giây; - Luồn kim vào tĩnh mạch: + Nếu dùng bơm tiêm: rút pít tơng từ từ đủ thể tích máu cho định xét nghiệm Rút bơm tiêm, tháo kim, để bơm tiêm chếch với thành ống nghiệm bơm từ từ cho máu chảy theo thành ống nghiệm tránh làm vỡ hồng cầu + Nếu lấy máu dụng cụ hút chân khơng, sau luồn kim vào tĩnh mạch, có máu chảy ống dẫn, cắm đầu ống dẫn qua nắp ống hút chân không (vacutainer), để máu hút vào ống đủ thể tích cần lấy Cần lấy máu kỹ thuật hút chân không cho xét nghiệm sinh học phân tử để tránh tạp nhiễm cho mẫu máu xét nghiệm - Tháo bỏ đầu kim vào hộp đựng vật sắc nhọn bơm tiêm giá đỡ ống lấy máu bẩn vào hộp đựng rác thải y tế; - Sát trùng lại vị trí lấy máu cồn 70 độ băng lại 2.2.4 Tách huyết thanh/huyết tương - Giữ ống máu ổn định nhiệt độ phòng tối thiểu 30 phút tiến hành tách huyết thanh/huyết tương không Khi không tách huyết thanh/huyết tương vòng giờ, mẫu sau để ổn định nhiệt độ phòng 30 phút chuyển bảo quản nhiệt độ 4oC - 8oC Tách huyết thanh/huyết tương vòng tối đa 24 Mẫu xét nghiệm sinh học phân tử, tách huyết thanh/huyết tương thực vòng theo hướng dẫn sinh phẩm xét nghiệm - Nếu có máy ly tâm: Tốc độ thời gian ly tâm 2.000 – 2.500 vòng/phút 10 phút Khi xếp ống máu vào máy phải đảm bảo cân vị trí đối xứng Dùng pipette hút phần huyết thanh/huyết tương sang ống lưu mẫu có mã số tương ứng - Khơng có máy ly tâm: Tách huyết thanh/huyết tương thấy mẫu phân tách rõ ràng - Kiểm tra thể tích huyết thanh/huyết tương thu đủ cho yêu cầu xét nghiệm định Vận chuyển mẫu - Vận chuyển mẫu nội sở y tế từ địa điểm thu thập mẫu tới phòng xét nghiệm phải đảm bảo an toàn, tuân thủ theo hướng dẫn hành sở Khi cần chuyển gửi mẫu tới phịng xét nghiệm khác ngồi sở y tế thu thập mẫu ban đầu phải tuân thủ hướng dẫn đóng gói, vận chuyển 3.1 Đóng gói mẫu 3.1.1 Đóng gói lớp - Lớp (ống đựng mẫu): Đeo găng tay đóng chặt nắp ống mẫu xếp tất ống mẫu theo phương thẳng đứng vào giá đựng mẫu Dùng băng dính cố định ống mẫu giá đựng bệnh phẩm (nếu cần) - Lớp (túi, hộp, gói vật liệu bền khơng thấm nước, khơng rị rỉ, chịu nhiệt độ 40-55oC): Cho đủ vật liệu thấm hút (bông thấm nước giấy thấm) vào lớp thứ lớp thứ 2, để trường hợp đổ vỡ vật liệu thấm hút hấp thụ toàn lượng mẫu - Lớp (hộp, thùng cứng, chịu va đập, khơng rị rỉ) Giữa lớp thứ lớp ngồi có túi tích lạnh để đảm bảo mẫu bảo quản từ 4oC-8oC trình vận chuyển Trong trường hợp mẫu vận chuyển nhiệt độ âm sâu cần sử dụng đá khô để vận chuyển, dùng đá khơ lớp ngồi cần có lỗ khí CO2 3.1.2 Đóng nắp thùng đựng mẫu chốt khóa lại Trường hợp khơng có chốt khóa dùng băng dính dán xung quanh 3.1.3 Dán in ký hiệu nguy hiểm sinh học số điện thoại liên hệ trường hợp khẩn cấp bên hộp đựng mẫu bệnh phẩm Lưu ý: Không để danh sách mẫu vào hộp vận chuyển mẫu 3.2 Vận chuyển mẫu 3.2.1 Vận chuyển mẫu bệnh phẩm phải tuân thủ quy định quốc gia quyền địa phương vận chuyển tác nhân có khả gây bệnh 3.2.2 Gọi điện báo trước cho phòng xét nghiệm biết thời gian bệnh phẩm tới để phịng xét nghiệm bố trí tiếp nhận 3.2.3 Bệnh phẩm gửi phải kèm theo phiếu yêu cầu xét nghiệm điền đầy đủ thông tin 3.2.4 Mẫu bệnh phẩm phải bảo quản lạnh suốt trình vận chuyển 3.2.5 Trong trình vận chuyển mẫu phải buộc chặt hộp chứa mẫu bệnh phẩm vào giá chở hàng, đảm bảo gọn gàng, tránh đổ, vỡ 3.3 Tiếp nhận mẫu 3.3.1 Kiểm tra nhiệt độ hộp vận chuyển, kiểm tra phát ống đựng mẫu đậy kín, khơng bị nứt vỡ, đánh giá tình trạng mẫu: máu bị đơng, tán huyết, thể tích, đối chiếu thông tin ống đựng máu, phiếu xét nghiệm 3.3.2 Thông báo cho đơn vị gửi mẫu phát thấy điểm không phù hợp liên quan đến mẫu bệnh phẩm chuyển gửi Xác nhận lại thông tin, yêu cầu lấy lại mẫu… cần thiết Trong trường hợp có sai lệch thơng tin phiếu ống mẫu đơn vị gửi mẫu cần xác nhận thông tin đúng, kết trả theo thông tin ống đựng mẫu 3.3.3 Ký nhận vào phiếu gửi mẫu ghi chép vào sổ nhận mẫu thông tin số lượng mẫu, người nhận, thời gian nhận 3.4 Xử lý tràn đổ Khi tiếp nhận mẫu bệnh phẩm phát thấy ống mẫu bị nứt vỡ, bật nắp gây tràn, đổ, rò rỉ mẫu ngoài, PXN cần xử lý tràn đổ bệnh phẩm theo quy trình xử lý dung dịch chứa tác nhân gây bệnh mà PXN ban hành Bảo quản mẫu Mẫu huyết thanh/huyết tương xét nghiệm vòng 3-7 ngày phải bảo quản nhiệt độ 4oC-8oC (tùy thuộc vào hướng dẫn nhà sản xuất) Nếu cần bảo quản lâu phải lưu trữ nhiệt độ (- 20oC) lạnh Tuy nhiên mẫu không tan đông lần Tiêu hủy mẫu Tiêu hủy mẫu xét nghiệm tuân thủ theo quy định Thông tư liên tịch số 58/2015/TTLT-BYT- BTNMT ngày 31/12/2015 Bộ Y tế Bộ Tài nguyên môi trường quy định quản lý chất thải y tế Phụ lục 4: HƯỚNG DẪN CHUNG THỰC HIỆN XÉT NGHIỆM (Ban hành kèm theo Quyết định số /QĐ-BYT ngày tháng năm 2020 Bộ trưởng Bộ Y tế) Phịng xét nghiệm phải xây dựng quy trình thực chuẩn (SOP) cho tiêu xét nghiệm, có đủ nội dung theo quy định Tiêu chí đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm y học, ban hành theo định số 2429/QĐ-BYT ngày 12 tháng năm 2017 Nên có lưu đồ thực xét nghiệm, tóm tắt cơng đoạn quy trình xét nghiệm: Yêu cầu xét nghiệm Chuẩn bị dụng cụ lấy mẫu Thu thập bệnh phẩm Từ chối Kiểm tra mẫu Yêu cầu lấy lại mẫu Chấp nhận Xử lý mẫu Chuẩn bị sinh phẩm, dụng cụ, thiết bị sơ đồ XN Thực xét nghiệm theo SOP Hoàn thiện hồ sơ xét nghiệm Phê duyệt kết xét nghiệm Trả kết xét nghiệm Hình 4: Minh hoạ lưu đồ thực xét nghiệm Thực xét nghiệm theo quy trình xét nghiệm phê duyệt Lập đầy đủ hồ sơ cho trình xét nghiệm, sử dụng biểu mẫu quy định quy trình xét nghiệm phê duyệt Kết xét nghiệm phải xem xét phê duyệt cá nhân phân công Kết xét nghiệm mẫu bệnh phẩm công nhận kết kiểm soát chất lượng đạt yêu cầu Trả kết xét nghiệm theo quy trình phịng xét nghiệm ban hành Theo kết xét nghiệm, nên có tư vấn phịng bệnh kết nối bệnh nhân với sở chăm sóc điều trị Lưu mẫu bệnh phẩm theo quy định phòng xét nghiệm Lưu hồ sơ xét nghiệm theo quy định phòng xét nghiệm Xử lý chất thải theo quy định phòng xét nghiệm Phụ lục 5: QUY ĐỊNH THỰC HÀNH TỐT TRONG XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ (Ban hành kèm theo Quyết định số /QĐ-BYT ngày Bộ trưởng Bộ Y tế) tháng năm 2020 Nhân Nhân viên phịng xét nghiệm chẩn đốn phân tử phải có kiến thức kỹ sinh học phân tử, đào tạo phù hợp đánh giá có đủ khả trước nhận thực xét nghiệm giao Tổ chức khu vực làm việc 2.1 Phòng xét nghiệm sinh học phân tử cần phân chia thành khu vực riêng biệt cho cơng việc sau: - Phịng chuẩn bị sinh phẩm - Phòng tách chiết axit nuleic - Phịng khuyếch đại gien - Phịng phân tích sản phẩm gien khuyếch đại Các phịng xét nghiệm có thực xét nghiệm sinh học phân tử truyền thống (không sử dụng hệ thống xét nghiệm sinh học phân tử tự động, bán tự động) phải tuân thủ chặt chẽ nguyên tắc phân chia khu vực làm việc Các phòng xét nghiệm sử dụng hệ thống xét nghiệm sinh học phân tử tự động, bán tự động, việc phân chia/tích hợp khu vực làm việc cần xem xét phù hợp 2.2 Mỗi khu vực làm việc cần bố trí đủ trang thiết bị, dụng cụ, bảo hộ cá nhân, không sử dụng lẫn khu vực Nên dùng dấu hiệu dễ nhận biết để phân biệt thiết bị, dụng cụ, đồ dùng khu vực tránh dùng lẫn Thực hành tốt 3.1 Vật tư tiêu hao - Khơng sử dụng găng tay có bột tan - Sử dụng loại ống lấy mẫu, ống đựng mẫu, đầu tip micropipette khơng có DNAse RNAase Khuyến khích sử dụng loại ống nắp xốy giúp hạn chế tạo phát tán vi giọt thao tác đóng mở ống nắp bật - Sử dụng loại ống lấy mẫu có chất chống đơng phù hợp - Dung dịch khử nhiễm: Cần có sẵn dung dịch khử nhiễm loai bỏ DNA/RNA bề mặt thiết bị, bàn thí nghiệm, dụng cụ dung dịch tẩy 1% (bleach solution 1%), ethanol 70%, sản phẩm loại bỏ DNAse/RNAse… 3.2 Chuẩn bị sinh phẩm - Phòng chuẩn bị sinh phẩm cần lắp đặt đèn UV để khử nhiễm Trang thiết bị dụng cụ tối thiểu gồm: tủ PCR, máy lắc (vortex), máy ly tâm (spindown), micropipet Nếu có bảo quản sinh phẩm khu vực này, cần có tủ mát 40, tủ âm -200 C - Bảo quản sinh phẩm nhiệt độ theo quy định nhà sản xuất Không bảo quản sinh phẩm thiết bị bảo quản lạnh tủ 0, -200 C bảo quản mẫu bệnh phẩm, sản phẩm tách chiết, sản phẩm PCR - Sinh phẩm vật tư tiêu hao phải cung ứng trực tiếp từ nơi bảo quản tới phòng chuẩn bị sinh phẩm khơng sử dụng chung với phịng khác - Chuẩn bị sinh phẩm, hỗn hợp phản ứng phải tiến hành tủ PCR - Không mang mẫu bệnh phẩm, mẫu tách chiết DNA/RNA, sản phẩm PCR vào phòng chuẩn bị sinh phẩm 3.3 Tách chiết DNA/RNA - Phòng tách chiết axit nuleic cần trang bị thiết bị dụng cụ tối thiểu gồm: tủ an toàn sinh học cấp II, máy ly tâm tube 1,5 ml - 2,0 ml, micropipet Nếu có bảo quản sản phẩm tách chiết khu vực này, cần có tủ mát 40, tủ âm -200 C - Tách chiết DNA/RNA cần phải tiến hành tủ an toàn sinh học - Nên sử dụng riêng micropipette, máy ly tâm cho tách chiết DNA RNA 3.4 Khuyếch đại gien - Phòng khuyếch đại gien trang bị thiết bị khuyếch đại gien phù hợp với loại xét nghiệm thực máy PCR, máy real-time PCR, máy giải trình tự gien Cần đảm bảo nhiệt độ, độ ẩm phù hợp cho thiết bị - Cần có buồng PCR phịng xét nghiệm có thực xét nghiệm sản phẩm PCR dùng làm khuôn cho phản ứng PCR khác nestedPCR… - Nếu có bảo quản sản phẩm PCR khu vực này, cần có tủ mát 0C, tủ âm -200C Không bảo quản sản phẩm PCR với mẫu bệnh phẩm, sản phẩm tách chiết 3.5 Phân tích sản phẩm gien khuếch đại - Phịng phân tích sản phẩm PCR cần trang bị thiết bị: hệ thống điện di gel agarose, máy chụp ảnh gel, lò vi sóng… - Cần cởi áo chồng, bỏ găng tay, rửa tay trước khỏi khu vực 3.6 Thực xét nghiệm SHPT theo nguyên tắc chiều từ khu vực đến khu vực tạp nhiễm: Chuẩn bị hoá chất → Tách chiết axit nucleic → Khuyếch đại gien → Phân tích sản phẩm khuyếch đại, khơng theo chiều ngược lại Chống tạp nhiễm Phòng xét nghiệm cần xây dựng hướng dẫn chống tạp nhiễm, quy định cụ thể: - Khử nhiễm bề mặt làm việc - Khử nhiễm thiết bị máy ly tâm loại, máy PCR… - Khử nhiễm dụng cụ: micropipette, giá đỡ ống nghiệm, hộp đựng mẫu… - Khử nhiễm buồng PCR, tủ an toàn sinh học Mẫu kiểm soát chất lượng - Mẫu chứng dương kiểm soát khuyếch đại: Là mẫu tách chiết có kết khuyếch đại yếu, ổn định giới hạn chấp nhận Sử dụng mẫu tách chiết có kết dương tính mạnh nguy gây tạp nhiễm - Nếu dùng plasmid làm mẫu kiểm soát chất lượng cho bước khuyếch đại cần phải pha loãng đến nồng độ cho kết dương tính yếu - Mẫu chứng âm cho bước khuyếch đại dùng nước khơng có nuclease, để kiểm sốt tạp nhiễm hỗn hợp phản ứng - Mẫu kiểm soát chất lượng bước tách chiết: Là mẫu có kết dương tính âm tính biết trước, tách chiết phân tích song song mẫu bệnh phẩm để kiểm sốt thành cơng bước tách chiết kiểm tra tạp nhiễm xảy bước tách chiết - Vật liệu nội chứng: Được sử dụng để kiểm soát yếu tố gây ức chế phản ứng PCR, chất lượng lần tách chiết Vật liệu nội chứng bổ sung vào mẫu xét nghiệm trước sau tách chiết Tốt vật liệu nội chứng nên bổ sung vào mẫu trước tách DNA/RNA giúp kiểm sốt q trình tách chiết khuyếch đại Tuân thủ theo hướng dẫn nhà sản xuất sinh phẩm sử dụng vật liệu nội chứng thực xét nghiệm Với xét nghiệm tự xây dựng (In-house), loại vật liệu nội chứng, hàm lượng cách sử dụng phải xác định trình thẩm định quy trình xét nghiệm DANH MỤC VIẾT TẮT Viết tắt ALP ALT anti-HBc IgG anti-HBc IgM anti-HBe anti-HBs anti-HCV APRI ART ARV AST CLIA CMIA DAA DBS ECL ECLIA EIA ELISA EQAS FDA US HBeAg HBsAg HBV HBV DNA HCC HCV HCVcAg HCV RNA HIV MEIA PCR PXN Giải nghĩa Alkaline phosphatase Alanine aminotransferase Kháng thể anti-HBc IgG Kháng thể anti-HBc IgM Kháng thể anti-Hbe Kháng thể anti-HBs Kháng thể anti-HCV Aminotransferase/platelet ratio index Antiretroviral therapy Antiretroviral (drug) Aspartate aminotransferase Chemiluminescence immunoassay Chemiluminesence microparticle Immunoassays Direct-acting antiviral (drug) Dried blood spot (specimen) Electrochemiluminescence immunoassay Electrochemoluminescence Immunoassay Enzyme immunoassay Enzyme-linked immunosorbent assay External quality assessment scheme Food and Drug Administration, U.S Hepatitis B e antigen - Kháng nguyên HBeAg Hepatitis B surface antigen - Kháng nguyên HBsAg Hepatitis B virus - Vi rút viêm gan B Vật liệu di truyền DNA HBV Hepatocellular carcinoma - Ung thư tế bào biểu mô gan Hepatitis C virus - Vi rút viêm gan C Hepatitis C virus core antigen - Kháng nguyên HCVcAg Vật liệu di truyền RNA HCV Human immunodeficiency virus - Vi rút HIV Microparticle enzyme Immunoassays Polymerase Chain Reaction - Phản ứng PCR Phòng xét nghiệm POC test RDT SHPT TCYTTG XN Point-of-Care Test - Xét nghiệm điểm Rapid Diagnostic Test - Xét nghiệm nhanh Sinh học phân tử Tổ chức Y tế Thế giới Xét nghiệm