Xác định tổng hợp chất phenolic trong cây cỏ ngọt

TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC NGUYỄN THỊ PHƢỢNG XÁC ĐỊNH TỔNG HỢP CHẤT PHENOLIC TRONG CÂY CỎ NGỌT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VINH - 2012 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP- TỰ DO- HẠNH PHÚC - NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Phƣợng Số hiệu sinh viên: 0852045296 Khóa: 49 Ngành: Cơng nghệ hóa thực phẩm Tên đề tài: “Xác định tổng hợp chất phenolic cỏ ngọt” Nội dung nghiên cứu - Lý thuyết chung cỏ - Lý thuyết chung phenolic thực vật - Xác định tổng phenolic theo Meda et al (2005) - Xác định tổng flavonoid theo phƣơng pháp nhôm clorua Họ tên cán hƣớng dẫn : PGS.TS Nguyễn Hoa Du Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng năm 2012 Ngày hoàn thành đồ án Ngày tháng năm 2012 : Ngày Chủ nhiệm môn tháng năm 2012 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án tốt nghiệp ngày tháng năm Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP- TỰ DO- HẠNH PHÚC - BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Phƣợng Số hiệu sinh viên: 0852045296 Khóa: 49 Ngành: Cơng nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Hoa Du Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………… Nhận xét cán hƣớng dẫn: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………… Ngày tháng năm 2012 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) iii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP- TỰ DO- HẠNH PHÚC - BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Phƣợng Số hiệu sinh viên: 0852045296 Khóa: 49 Ngành: Cơng nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn: PGS.TS Nguyễn Hoa Du Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………… Nhận xét cán duyệt: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………… Ngày tháng năm 2012 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ix TÓM TẮT x MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu Phần I TỔNG QUAN 1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CỎ NGỌT 1.1.1 Định nghĩa nguồn gốc 1.1.2 Đặc điểm thực vật học 1.1.3 Thành phần cỏ 1.1.4 Dƣợc tính Cỏ 1.1.5 Ý nghĩa kinh tế 1.2 Các hợp chất phenolic từ thực vật 1.2.1 Giới thiệu hợp chất phenolic thực vật 1.2.2 Phân loại hợp chất phenolic 1.2.3 Một số hợp chất phenolic điển hình 10 1.2.4 Hoạt tính sinh học phenolic 16 1.3 Giới thiệu phƣơng pháp trắc quang 18 1.3.1 Giới thiệu chung phƣơng pháp trắc quang 18 1.3.2 Định lƣợng tổng phenolic phƣơng pháp trắc quang 19 1.3.2 Định lƣợng tổng flavonoid phƣơng pháp trắc quang 19 1.4 Phƣơng pháp thống kê xử lý số liệu thực nghệm 20 1.4.1 Phƣơng pháp xử lý kết phân tích 20 1.4.2 Phƣơng pháp thống kê xử lý đƣờng chuẩn 22 Phần II KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM 24 2.1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 24 2.1.1 Thiết bị, dụng cụ 24 2.1.2 Hóa chất 24 v 2.1.3 Pha chế dung dịch 25 2.2 Xử lý mẫu 26 2.2.1 Địa điểm lấy mẫu 26 2.2.2 Chuẩn bị mẫu 26 2.2.3 Xử lý mẫu 26 Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Xác định tổng phenolic cỏ 29 3.1.1 Xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn phụ thuộc mật độ quang vào axit gallic 29 3.1.2 Kết xác định hàm lƣợng phenolic mẫu cỏ phƣơng pháp trắc quang 31 3.2 Xác định tổng flavonoid cỏ 34 3.2.1 Xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn phụ thuộc mật độ quang vào quercetin 34 3.2.2 Kết xác định hàm lƣợng flavonoid cỏ 37 Phần IV KẾT LUẬN 45 1.Đã tổng quan đƣợc số vấn đề: 45 2.Đã xác định đƣợc tổng hàm lƣợng phenolic, flavonoid lá, thân cỏ trồng Nghệ An 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 vi DANH SÁCH HÌNH VẼ Hình 1.1 Cây cỏ Hình 1.2 Cấu trúc stevioside Hình 1.3 Cấu trúc hố học chất cỏ stevia Hình 1.4 Cấu trúc số flavonoid 11 Hình 1.5 Cấu trúc số axit phenolic 12 Hình 1.6 Cấu trúc đơn phân hydroxycinnamyl alcohol 15 Hình 2.1 Mẫu cỏ 26 Hình 3.1 Phổ UV – Vis mẫu chuẩn axit Gallic 29 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ axit Gallic 30 Hình 3.3 Phổ UV – Vis mẫu cỏ 32 Hình 3.4 Phổ UV – Vis mẫu thân cỏ 33 Hình 3.5 Phổ UV – Vis mẫu chuẩn quercetin 35 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ quercetin 35 Hình 3.7 Phổ UV – Vis mẫu cỏ chiết với dung mơi methanol 80% 37 Hình 3.8 Phổ UV – Vis mẫu thân cỏ chiết với dung môi methanol 80% 39 Hình.3.9 Phổ UV – Vis mẫu cỏ chiết với dung môi methanol nguyên chất 40 Hình 3.10 Phổ UV – Vis mẫu thân cỏ chiết với dung môi methanol nguyên chất 42 vii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Phân loại hợp chất phenolic 10 Bảng 1.2 Giá trị phân bố t tƣơng ứng với xác suất p k bậc tự 20 Bảng1.3 Dùng để tính S S X 21 Bảng 3.1 Sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ axit Gallic 29 Bảng 3.2 Xử lý thống kê đƣờng chuẩn 30 Bảng 3.3 Kết đo mật độ quang mẫu cỏ 32 Bảng 3.4 Kết đo mật độ quang mẫu thân cỏ 33 Bảng 3.5 Sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ quercetin 35 Bảng 3.6 Xử lý thống kê đƣờng chuẩn 36 Bảng 3.7 Kết đo mật độ quang mẫu cỏ chiết với dung môi methanol 80% 37 Bảng 3.8 Kết đo mật độ quang mẫu thân cỏ chiết với dung môi methanol 80% 39 Bảng 3.9 Kết đo mật độ quang mẫu cỏ chiết với dung môi methanol nguyên chất 40 Bảng 3.10 Kết đo mật độ quang mẫu thân cỏ chiết với dung môi methanol nguyên chất 42 Bảng 4.1 Tổng hàm lƣợng phenolic cỏ 45 Bảng 4.2 Tổng hàm lƣợng phenolic phận cỏ 45 viii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc đồ án này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn Hoa Du giao đề tài, hết lòng hƣớng dẫn, bảo, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho em suốt q trình hồn thành đồ án Em xin chân thành cảm ơn cô giáo Ngô Thị Thủy Hà, Chu Thị Thanh Lâm thuộc Trung tâm phân tích chuyển giao công nghệ thực phẩm – môi trƣờng, đại học Vinh, hết lịng tạo điều kiện giúp đỡ em hồn thành đồ án Em xin tỏ lòng biết ơn thầy, cô giáo Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Hóa học - Trƣờng Đại học Vinh tận tình dạy bảo có ý kiến q giá trình em học tập làm đồ án tốt nghiệp Tuy nhiên, đồ án chắn cịn nhiều thiếu sót nên mong q thầy bạn góp ý để em hồn thiện đồ án học hỏi, rút kinh nghiệm cho công tác nghiên cứu sau Cuối cùng, lần em xin gửi đến tất ngƣời quan tâm, giúp đỡ em hoàn thành đồ án lời cảm ơn chân thành ! Vinh, tháng 12 năm 2012 Sinh viên 49K -CNTP Nguyễn Thị Phượng ix TÓM TẮT Phần I Tổng quan - Tổng quan cỏ tác dụng - Hợp chất phenolic thực vật hoạt tính sinh học - Xác định tổng hợp chất phenolic, flavonoid phƣơng pháp trắc quang - Phƣơng pháp thống kê xử lý số liệu thực nghiệm Phần II Kỹ thuật thực nghiệm - Pha chế thuốc thử Folin – Ciocalteu - Xử lý mẫu để xác định tổng hợp chất phenolic, flavonoid Phần III Kết thảo luận - Đã xác định đƣợc tổng hàm lƣợng phenolic, flavonoid lá, thân cỏ trồng Nghệ An - Kết gần với kết đƣợc công bố năm gần x Ta thấy: tTN < t(0,95;2) X ≠a nguyên nhân ngẫu nhiên với p = 0,95 Sai số tƣơng đối : q%   X 100  1,278086338% q% = 1,278086338 < 5% kết nghiên cứu đƣợc chấp nhận Từ bảng ta có mật độ quang trung bình mẫu là: Ai  0,70838  0.70138  0.70364  0,704467 Mặt khác từ phƣơng trình đƣờng chuẩn xây dựng mục 3.3.1: ∆Ai = (0.1701 ± 0,01725209) Ci 102 + (0.010536 ± 0,0053376) Chúng tơi tính đƣợc nồng độ phenolic 1ml dung dịch đem phân tích: 0,036753957 (mg/ml) ≤ CGAE ≤ 0,045749285 (mg/ml) Hàm lƣợng phenolic gam mẫu khơ đƣợc tính theo công thức: m phenolic mgGAE / g   CGAE V m Trong đó: V thể tích dung dịch mẫu ban đầu m khối lƣợng mẫu Vậy hàm lƣợng phenolic gam cỏ khô là: 18,377 (mgGAE/g) ≤ mphenolic ≤ 22,875 (mgGAE/g) 3.1.2.2 Xác định hàm lượng phenolic mẫu thân cỏ Hình 3.4 Phổ UV – Vis mẫu thân cỏ Bảng 3.4 Kết đo mật độ quang mẫu thân cỏ STT Thể tích mẫu dung dịch phân tích (ml) 1 33 ∆Ai 0.33095 0.33107 0.32638 Ci 1,883680188.10-2 1,884385655 10-2 1,856813639 10-2 Giá trị trung bình X  C    X yi  1,874959828 Phƣơng sai: S  i X n 1 Độ lệch chuẩn: S X    2,47088.10 -8 S2  9,0754.10 n Độ xác phép xác định :   t p, k S X  3,902422.104 Với t(0,95;2) = 4.3 Khoảng tin cậy: 0,018359357 (mgGAE/ml) ≤ CGAE ≤ 0,01913984 (mgGAE/ml) tTN  X a SX  2,75913227 Ta thấy: tTN < t(0,95;2) Sai số tƣơng đối : q%  X ≠a nguyên nhân ngẫu nhiên với p = 0,95  X 100  2,1% q% = 2,1% < 5% kết nghiên cứu đƣợc chấp nhận Từ bảng ta có mật độ quang trung bình mẫu là: Ai  0,33095  0,33107  0,32638  0,329467 Mặt khác từ phƣơng trình đƣờng chuẩn xây dựng mục 3.3.1: ∆Ai = (0.1701 ± 0,01725209) Ci 102 + (0.010536 ± 0,0053376) Chúng tơi tính đƣợc nồng độ phenolic 1ml dung dịch đem phân tích: 0,016738168 (mgGAE/ml) ≤ CGAE ≤ 0,021215093 (mgGAE/ml) Hàm lƣợng phenolic gam mẫu thân khô tính theo cơng thức mục 3.1.2.1 8,37 (mgGAE/g) ≤ mphenolic ≤ 10.61 (mgGAE/g) 3.2 Xác định tổng flavonoid cỏ 3.2.1 Xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn phụ thuộc mật độ quang vào quercetin Để xây dựng đƣờng chuẩn phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ quercetin, tiến hành nghiên cứu khoảng nồng độ tuân theo định luật Beer quercetin 34 Chuẩn bị dung dịch nồng độ (mg/ml): (1): 0,004; (2): 0,005; (3): 0,01; (4): 0,02; (5): 0,025 Sau thực thí nghiệm theo quy trình phân tích, ta thu đƣợc kết đƣợc kết nhƣ sau: Hình 3.5 Phổ UV – Vis mẫu chuẩn quercetin Bảng 3.5 Sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ quercetin STT ∆Ai 0.17386 0.1965 0.32729 0.58976 0.73391 Ci (mg/ml) 0.004 0.005 0.01 0.02 0.025 Chuẩn Quercetin xác định flavonoid 0.8 y = 26.589x + 0.0639 R2 = 0.9997 Mật độ quang 0.7 0.6 0.5 Series1 0.4 Linear (Series1) 0.3 0.2 0.1 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 Nồng độ Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ quercetin Đƣờng chuẩn biểu phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ quercetin bƣớc sóng  = 415 (nm) y = 26,589x + 0,0639 35 Từ kết kết luận: Khoảng nồng độ tuân theo định luật Beer quercetin 0,004 – 0,025 (mg/ml) nồng độ quercetin lớn xảy tƣợng lệch âm khỏi định luật Beer Khi cần pha lỗng mẫu đo Xử lý thống kê đƣờng chuẩn tìm giá trị εa εb Bảng 3.6 Xử lý thống kê đường chuẩn xi = Ci.102 0,4 0,5 2,5 STT yi = ∆Ai 0,17386 0,1965 0,32729 0,58976 0,73391 Ci.∆Ai 0,069544 0,09825 0,32729 1,17952 1,834775 Ci2.102 0,16 0,25 6,25 A  m. Ci2   Ci  A1  Ci2  Ai  Ci Ci Ai  Ai  m.Ci Ai   Ci  Ai a A2 A a A2  0,265885063 A b A1  0,063931119 A b A1 A Phƣơng trình đƣờng chuẩn có dạng y  ax  b Sau tính đƣợc a, b ta phải đánh giá độ tin cậy chúng nhƣ sau: S y y   Yi   k i y  Yi  m2 i Với yi  Ai Yi  a.xi  b ( xi giá trị nồng độ) S y2  2,74441.105 Sa2  Sb2  Với S y2  Ci2 A S y2 m A  1,84543.105  7,91352.10 t p  0,95; k    2.78  a  t p , k Sa  0,011942467 36  b  t p , k Sb  0,007820414 Vậy phƣơng trình đƣờng chuẩn có dạng: ∆Ai = (0,265885063 ± 0,011942467)Ci 102 + (0,063931119 ± 0,007820414) 3.2.2 Kết xác định hàm lƣợng flavonoid cỏ Quá trình định lƣợng flavonoid mẫu phân tích phƣơng pháp trắc quang đƣợc tiến hành nhƣ sau: Phép đo: Lấy 3ml dịch chiết xuất mẫu methanol Sau đó, 0,1ml AlCl3 10%, 0,1ml Na-K tartarate 0,63% 2,8 ml nƣớc cất đƣợc thêm vào tuần tự, lắc mạnh dung dịch Ghi độ hấp thụ 415 nm sau 30 phút ủ Quercetin đƣợc sử dụng để xây dựng đƣờng chuẩn, nồng độ flavonoid mẫu tƣơng đƣơng mg quercetin/g mẫu 3.2.2.1 Xác định hàm lƣợng flavonoid cỏ chiết với dung môi methanol 80% Hình 3.7 Phổ UV – Vis mẫu cỏ chiết với dung môi methanol 80% Bảng 3.7 Kết đo mật độ quang mẫu cỏ chiết với dung mơi methanol 80% STT Thể tích dung dịch mẫu phân tích (ml) ∆Ai Ci 0.56449 0,018826138 0.57929 0,019382769 3 0.57982 0,019402703 Chúng sử dụng hàm phân bố Student để đánh giá kết thu đƣợc xác định hàm lƣợng tổng flavonoid mẫu thật Chọn giá trị gần đúng: C= 0,019382769 C  X  Giá trị trung bình X  C   yi 0,01920387 37  X Phƣơng sai: S   i X n 1 Độ lệch chuẩn: S X   1,07111.10 S2  0,000188954 n Độ xác phép xác định :   t p, k S X  4,3.1,88954.104  8,125.104 Với t(0,95;2) = 4.3 Khoảng tin cậy: X   X  X  Suy ra: 0,0184 (mgQuercetin/ml) ≤ CQuercetin≤ 0,02 (mgQuercetin/ml) Ta có: tTN  X a SX  0,01920387  0,019  1,07894 1,88954.10 Ta thấy: tTN < t(0,95;2) Sai số tƣơng đối : q%  X ≠a nguyên nhân ngẫu nhiên với p = 0,95  X 100  8,125.104 100  4,23 0,01920387 q% = 4,23% < 5% kết nghiên cứu đƣợc chấp nhận Từ bảng ta có mật độ quang trung bình mẫu là: Ai  0,56449  0,57929  0,57982  0,574533 Mặt khác từ phƣơng trình đƣờng chuẩn xây dựng mục 3.2.1: ∆Ai = (0,265885063 ± 0.011942467)Ci 102 + (0,063931119 ± 0.007820414) Chúng tơi tính đƣợc nồng độ flavonoid ml dung dịch đem phân tích: 0,0181 (mgQuercetin/ml) ≤ Cflavonoid ≤ 0,0204 (mgQuercetin/ml) Hàm lƣợng flavonoid gam mẫu khơ đƣợc tính theo cơng thức: m flavonoid mgQuerceti n / g   V CQuercetin m Trong đó: V thể tích dung dịch mẫu ban đầu m khối lƣợng mẫu Hàm lƣợng flavonoid gam cỏ khô là: 7,24 (mgQuercetin/g) ≤ mflavonoid ≤ 8,16 (mgQuercetin/g) 38 3.2.2.2 Xác định hàm lƣợng flavonoid mẫu thân cỏ chiết với dung mơi methanol 80% Hình 3.8 Phổ UV – Vis mẫu thân cỏ chiết với dung môi methanol 80% Bảng 3.8 Kết đo mật độ quang mẫu thân cỏ chiết với dung môi methanol 80% STT Thể tích dung dịch mẫu phân tích (ml) 3 ∆Ai 0.18608 0.18477 0.18774 Ci 0,459404826.10-2 0,454477885.10-2 0,465648125.10-2 Chúng sử dụng hàm phân bố Student để đánh giá kết thu đƣợc xác định hàm lƣợng tổng flavonoid mẫu thật Chọn giá trị gần đúng: C= 0,004594048 C  X  Giá trị trung bình X  C    X Phƣơng sai: S   i X Độ lệch chuẩn: S X  yi  0,004598436 n 1  3,1338.10-9 S2  3,23203.10-5 n Độ xác phép xác định :   t p , k S X  0,000138977 Với t(0,95;2) = 4.3 Khoảng tin cậy: X   X  X  Suy ra: 0,004459459 (mgQuercetin/ml) ≤ CQuercetin ≤ 0,004737413 (mgQuercetin/ml) 39 Ta có: tTN  X a SX  3,045647932 Ta thấy: tTN < t(0,95;2) Sai số tƣơng đối : q%  X ≠a nguyên nhân ngẫu nhiên với p = 0,95  X 100  3,022268696% q% = 3,022268696% < 5% kết nghiên cứu đƣợc chấp nhận Từ bảng ta có mật độ quang trung bình mẫu là: Ai  0,18774  0,18608  0,18477 = 0,186196667 Mặt khác từ phƣơng trình đƣờng chuẩn xây dựng mục 3.2.1: ∆Ai = (0,265885063 ± 0.011942467)Ci 102 + (0,063931119 ± 0.007820414) Chúng tơi tính đƣợc nồng độ flavonoid 3ml dung dịch đem phân tích: 0.00412 (mgQuercetin/ml) ≤ CQuercetin≤ 0,005122652 (mgQuercetin/ml) Hàm lƣợng flavonoid gam mẫu thân khơ đƣợc tính theo công thức mục 3.2.2.1 0,824 (mgQuercetin/g) ≤ Cflavonoid ≤ 1,025 (mgQuercetin/g) 3.2.2.3 Xác định hàm lƣợng flavonoid mẫu cỏ chiết với dung môi methanol nguyên chất Hình.3.9 Phổ UV – Vis mẫu cỏ chiết với dung môi methanol nguyên chất Bảng 3.9 Kết đo mật độ quang mẫu cỏ chiết với dung mơi methanol ngun chất STT Thể tích dung dịch mẫu phân tích (ml) ∆Ai Ci 0.65004 2,204369338.10-2 0.66259 2,251570184.10-2 3 0.66457 2,259017011.10-2 40 Chúng sử dụng hàm phân bố Student để đánh giá kết thu đƣợc xác định hàm lƣợng tổng flavonoid mẫu thật Chọn giá trị gần đúng: C = 0,022515702 C  X  Giá trị trung bình X  C    X Phƣơng sai: S   i X n 1 Độ lệch chuẩn: S X  yi 0.022515702  8,78291.108 S2  1.711.10  n Độ xác phép xác định :   t p, k S X  4,3.1,711.104  7,3573.104 Với t(0,95;2) = 4.3 Khoảng tin cậy: X   X  X  Suy ra: 0,022 (mgQuercetin/ml) ≤ CQuercetin ≤ 0,02325 (mgQuercetin/ml) Ta có: tTN  X a SX  0,022515702  0.022  3,014 1,711.10 Ta thấy: tTN < t(0,95;2) Sai số tƣơng đối : q%  X ≠a nguyên nhân ngẫu nhiên với p = 0,95  X 100  7,3573.104  3,268% 0,022515702 q% = 3,268% < 5% kết nghiên cứu đƣợc chấp nhận Từ bảng ta có mật độ quang trung bình mẫu là: Ai  0,65004  0,66259  0,66457  0,659067 Mặt khác từ phƣơng trình đƣờng chuẩn xây dựng mục 3.2.1: ∆Ai = (0,265885063 ± 0.011942467)Ci 102 + (0,063931119 ± 0.007820414) Chúng tơi tính đƣợc nồng độ flavonoid 3ml dung dịch đem phân tích: 0,02114 (mgQuercetin/ml) ≤ CQuercetin ≤ 0,023744 (mgQuercetin/ml) Hàm lƣợng flavonoid gam cỏ khô đƣợc tính theo cơng thức mục 3.2.2.1 8,456 (mgQuercetin/g) ≤ mflavonoid ≤ 9,4976 (mgQuercetin/g) 41 3.2.2.4 Xác định hàm lƣợng flavonoid mẫu thân cỏ chiết với dung mơi methanol ngun chất Hình 3.10 Phổ UV – Vis mẫu thân cỏ chiết với dung môi methanol nguyên chất Bảng 3.10 Kết đo mật độ quang mẫu thân cỏ chiết với dung môi methanol nguyên chất STT Thể tích dung dịch mẫu phân tích (ml) 3 Ai 0,21062 0,20962 0,21051 Ci 0,551700345.10-2 0,547939321.10-2 0,551286632.10-2 Chúng sử dụng hàm phân bố Student để đánh giá kết thu đƣợc xác định hàm lƣợng tổng flavonoid mẫu thật Chọn giá trị gần đúng: C = 0,005512866 C  X  Giá trị trung bình X  C    X Phƣơng sai: S  Độ lệch chuẩn: S X   yi  0,005503088 i X n 1 -10  4,25349.10 S2  1,19073.10-5 n Độ xác phép xác định :   t p , k S X  5,12013.10-5 Với t(0,95;2) = 4,3 Khoảng tin cậy: X   X  X  Suy ra: 0,005451886 (mgQuercetin/ml) ≤ CQuercetin ≤ 0,005554289 (mgQuercetin/ml) Ta có: 42 tTN  X a SX  0,26 Ta thấy: tTN < t(0,95;2) Sai số tƣơng đối : q%  X ≠a nguyên nhân ngẫu nhiên với p = 0,95  X 100  0,93% q% = 0,93% < 5% kết nghiên cứu đƣợc chấp nhận Từ bảng ta có mật độ quang trung bình mẫu là: Ai  0,21062  0.20962  0.21051  0,21025 Mặt khác từ phƣơng trình đƣờng chuẩn xây dựng mục 3.2.1: ∆Ai = (0,265885063 ± 0.011942467)Ci 102 + (0,063931119 ± 0.007820414) Chúng tơi tính đƣợc nồng độ flavonoid ml dung dịch đem phân tích: 0,005 (mgQuercetin/ml) ≤ CQuercetin≤ 0,006069848 (mgQuercetin/ml) Hàm lƣợng flavonoid gam thân cỏ khơ tính theo cơng thức 3.2.2.1 (mgQuercetin/g) ≤ mflavonoid ≤ 1,214 (mgQuercetin/g) Nhận xét: Từ kết thu đƣợc ta thấy hàm lƣợng phenolic cỏ lớn thân, đồng nghĩa với hàm lƣợng flavonoid lớn thân Kết phù hợp theo giải thích Nguyễn Duy Thịnh (2004), polyphenol hay tanin sản phẩm trình quang hợp, có quan hệ mật thiết với cƣờng độ chiếu sáng, cƣờng độ chiếu sáng tăng hàm lƣợng polyphenol cao Do phần nhận đƣợc điều kiện ánh sáng tốt so với thân Hàm lƣợng phenolic nhƣ flavonoid xác định đƣợc từ lá, thân cỏ trồng Nghệ An lần lƣợt 18,377 – 22,875 mgGAE/g khô, 8,37 – 10,61 mgGAE/g thân khô , 7,24 – 8,16 mgQuercetin/g khô, – 1,214 mgQuercetin/g thân khô Kết gần với kết đƣợc công bố gần M.B Tadhani, V.H Patel, Rema Subhash (2007) xác định hàm lƣợng phenolic thu đƣợc từ cỏ 25,18 mgGAE/ gam cỏ khô Theo Esmat A Abou-Arab and Ferial M Abu-Salem (2010) xác định hàm lƣợng phenolic thu đƣợc từ cỏ 24,01 mgGAE/ gam cỏ khơ Cịn theo Sunanda Singh, Veena Garg, Deepak Yadav, Mohd Nadeem Beg and Nidhi Sharma (2012) xác định đƣợc hàm lƣợng phenolic lá, thân cỏ 18,5 ± 2,53 mg GAE/g, 6,5 ± 2,31 mg GAE/g, tổng hàm lƣợng flavonoid lá, thân cỏ 2,73 ± 1,44 mgquercetin/g khô, 2,53 ± 2,75 mgquercetin/g thân khơ.[23] 43 Cũng từ kết phân tích lần khẳng định cỏ nguồn nguyên liệu để sản xuất đƣờng Stevioside khơng lƣợng nguồn nguyên liệu có chứa hàm lƣợng phenolic lớn, ứng dụng công nghệ dƣợc phẩm thực phẩm Phenolic nhóm chất có đặc tính sinh học quý đặc biệt khả chống oxy hóa, chống viêm, chống dị ứng khả kháng khuẩn 44 Phần IV KẾT LUẬN Đã tổng quan đƣợc số vấn đề: - Cây cỏ tác dụng y học công nghệ thực phẩm - Hợp chất phenolic hoạt tính sinh học - Phƣơng pháp xác định tổng hàm lƣợng phenolic flavonoid phƣơng pháp trắc quang Đã xác định đƣợc tổng hàm lƣợng phenolic, flavonoid lá, thân cỏ trồng Nghệ An Bảng 4.1 Tổng hàm lượng phenolic cỏ Bộ phận Dung môi chiết Phenolic (mgGAE/g mẫu khô) Lá HCl 0,3N methanol 18,377 – 22,875 Thân HCl 0,3N methanol 8,37 – 10,61 Tổng 26,747 – 33,485 Bảng 4.2 Tổng hàm lượng phenolic cỏ Bộ phận Dung môi chiết Flavonoid (mgQuercetin/g mẫu khô) Lá Methannol 80% 7,24 – 8,16 Methannol nguyên chất 8,456 – 9,4976 Methannol 80% 0,824 – 1,025 Methannol nguyên chất – 1,214 Thân Tổng 8,064 – 10, 7116 - Hàm lƣợng phenolic, flavonoid cỏ lớn thân kết phù hợp với giải thích Nguyễn Duy Thịnh (2004) - Từ kết thu đƣợc góp phần làm tăng giá trị sử dụng cỏ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Lê Ngọc Tú, Bùi Đức Hợi, Lƣu Duẫn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cần (2001) Hóa thực Phẩm NXBKHKT [2] Võ Văn Chi (1999) Từ điển thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học [3] Nguyễn Huy Phiêu, Phùng Ngọc Bộ Nghiên cứu cấu tạo lignin bồ đề tre nứa Tạp chí Hoá học Ứng dụng số 3-2002 tr.17 [4] Trần Tứ Hiếu (2003) Phân tích trắc quang phổ hấp thụ UV – VIS NXBĐHQGHN [5] http://ykhoa.net/yhoccotruyen/baiviet/29_321.htm [6] Lại Thị Ngọc Hà, Nguyễn Thị Thu Hƣơng, Phan Thị Hằng (2010) Mơ hình hóa chiết polyphenol từ vỏ vải Tạp chí khoa học phát triển, Tập 8, số 6: 994 – 1003 Trƣờng đại học Nông nghiệp Hà Nội [7] Phan Thị Hà (2011) Xác định hàm lượng đường khử cỏ Đồ án tốt nghiệp, Đại học Vinh [8] Nguyễn Thị quỳnh Hoa (2011) Phân lập hợp chất phenolic từ số thực vật Việt Nam Luận văn thạc sỹ, Đại học quốc gia Hà Nội [9] Nguyễn Ngọc Hồng (2010) Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng chống oxy hóa số thuốc hướng tác dụng gan Luận án tiến sĩ, Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [10] Lê Văn Trọng (2012) Hoạt tính sinh học flavonoid Hội thảo khoa học cấp khoa, Đại học Hồng Đức [11] Nguyễn Khắc Nghĩa (2000) Áp dụng toán học thống kê để xử lý số liệu thực nghiệm Trƣờng đại học Vinh [12] http://www.khoahocphothong.com.vn/newspaper/detail/6797/cay-co-ngot,-chat-thaythe-duong.html [13] Silvia Martins, Solange I Mussatto, Guillermo Martínez-Avila, Julio MontezSaenz, Cristóbal N Aguilar, Jose A Teixeira (2011) Bioactive phenolic compounds: Production and extraction by solid-state fermentation A review Biotechnology Advances 29, 365–373 [14] Il-Suk Kim, Mira Yang, Ok-Hwan Lee, Suk-Nam Kang (2011) The antioxidant activity and the bioactive compound content of Stevia rebaudiana water extracts LWT - Food Science and Technology 44, 1328 – 1332 [15] Ellen McCrady (1991) The Nature of Lignin Volume 4, number 46 [16] Whettena R and Sederoffa R (1995) Lignin Biosynthesis The Plant Cell 7: 1001 1013 [17] Mary Satterfield and jenifer S brodbelt (2000) Enhanced detction of Flavanoid by Metal Complexation and Electrospray lonization Mas Specreometry Anal Chem 72, 5898 – 5906 [18] http://www.community.h2vn.com/index.php?action=printpage%3Btopic=061 [19] https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:ZZ3kyB2qXhUJ:www.sigmaaldrich.co /etc/medialib/docs/Sigma/Datasheet/6/47641dat.pdf+&hl=vi&gl=vn&pid=bl&srcid=AD GEESjFoP_CgHdLY47cZ6tAHnKee5qy02NO9tGrot3jp4xho_EhjpWPk94YqM2o43E F9gIWRdo2N7BLoQyvI_IFSyZwke_NyDETnfXmozcyH6PkTqsInT31JVGrDdsgL9A K_gyubTs4&sig=AHIEtbSmh7vcxZ40y0r2hVxXJiyml_2scA [20] Esmat A Abou-Arab and Ferial M Abu-Salem Evaluation of bioactive compounds of Steviarebaudiana leaves and callus African Journal of Food Science Vol 4(10), pp 627–634, October 2010 [21] Elija Khatiwora, Vaishli B.Adsul, Manik M Kulkarni, N.R and R.V Kashalkar Spectroscopic determination of totla phenol and flavonoid contents of Ipomoea carnea International journal of ChemTech research CODEN (USA): IJCRGG ISSN Vol.2, No.3 , pp 1698 - 1701, July - sept 2010 [22] Esmat A Abou-Arab and Ferial M Abu-Salem (2010) Evaluation of bioactive compounds of Steviarebaudiana leaves and callus African Journal of Food Science Vol 4(10), pp 627–634 [23] Sunanda Singh, Veena Garg, Deepak Yadav, Mohd Nadeem Beg and Nidhi Sharma, (2012) In – Vitro antioxidative and antibacterial activities of various parts of stevia rebaudiana International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, ISSN0975-1491, Vol 4, Issue 47 ... đề tài: ? ?Xác định tổng hợp chất phenolic cỏ ngọt? ?? Nội dung nghiên cứu - Lý thuyết chung cỏ - Lý thuyết chung phenolic thực vật - Xác định tổng phenolic theo Meda et al (2005) - Xác định tổng flavonoid... kẹo đƣợc tổng hợp từ chất tự nhiên, không gây sâu răng, tốt cho trẻ em 1.2 Các hợp chất phenolic từ thực vật 1.2.1 Giới thiệu hợp chất phenolic thực vật [8] Các hợp chất phenolic hợp chất có nhiều... -CNTP Nguyễn Thị Phượng ix TÓM TẮT Phần I Tổng quan - Tổng quan cỏ tác dụng - Hợp chất phenolic thực vật hoạt tính sinh học - Xác định tổng hợp chất phenolic, flavonoid phƣơng pháp trắc quang