Trang thiết bị và các phương pháp khử trùng môi trường trước khi lên men

5. Trang thiết bị và các phương pháp khử trùng môi trường trước khi lên men Một trong những điều kiện có ảnh hưởng lớn nhất tới sự tổng hợp sinh hoá của các chất hoạt hoá sinh học là bảo đảm độ tiệt trùng trong đó có độ tiệt trùng các cấu tử của môi trường dinh dưỡng. Khi sản xuất các chất hoạt hoá sinh học thường người ta ứng dụng các môi trường dinh dưỡng có nhiều cấu tử khác nhau. Các môi trường này có thể chứa nhiều sinh vật lạ. Cần phải phá huỷ hay loại chúng hoàn toàn ra khỏi môi trường. Quá trình tác động tới môi trường dinh dưỡng nhằm phá huỷ hay tách hoàn toàn vi sinh vật được gọi là tiệt trùng. Loại trừ hay phá huỷ vi khuẩn có thể thực hiện bằng các phương pháp khác nhau. Phá huỷ dẫn đến làm mất hoàn toàn khả năng sống của vi sinh vật là phương pháp tiệt trùng an toàn. Hiện tại trong điều kiện công nghiệp cần ứng dụng các phương pháp đơn giản và có hiệu quả kinh tế để tiệt trùng môi trường với việc sử dụng nhiệt ẩm. Yếu tố bảo đảm tiệt trùng an toàn khi gia công nhiệt đó là thời gian của quá trình. Độ bền nhiệt phụ thuộc vào dạng vi sinh vật. Ví dụ, các bào tử của nấm mốc khoảng 2 ÷ 10 lần bền nhiệt hơn các loại trực khuẩn không mang bào tử, virut và thể thực khuẩn 2 ÷ 5 lần, còn các bào tử bacterium khoảng 3 triệu lần. Thành phần và tính chất của môi trường dinh dưỡng cũng như phương pháp nuôi cấy sẽ xác định việc lựa chọn phương pháp tiệt trùng và thiết bị cho quá trình công nghệ quan trọng. Theo nguyên tắc tác động, tiệt trùng được chia thành hai loại: tiệt trùng gián đoạn và tiệt trùng liên tục, theo sự hình thành về kết cấu các nồi tiệt trùng tác động tuần hoàn được chia thành các loại sau: nồi tiệt trùng nằm ngang một mức, hai mức, hai mức kết hợp với mức đứng, còn loại khác là loại nằm ngang và loại tác động liên tục rung. Chất tải nhiệt cho tất cả thiết bị nêu trên là hơi bão hoà. Gia công nhiệt bằng hơi có nhiều ưu việt do dễ dàng vận chuyển, khả năng xâm nhập vào các ngóc ngách của thiết bị, của các đường ống, phụ tùng dễ dàng, toả nhiệt cao khi ngưng tụ, không độc hại, nước ngưng không làm biến đổi môi trường và khi làm ướt tế bào có khả năng làm tăng tốc độ huỷ diệt khoảng 10 ÷ 1000 lần. 2.5.1. Thiết bị tiệt trùng dạng nằm ngang Trong công nhiệp vi sinh để tiệt trùng các môi trường dinh dưỡng dạng rời, người ta sử dụng rộng rãi các thiết bị tiệt trùng hình trụ dạng nằm ngang có áo hơi. Bên trong thiết bị tiệt trùng được bố trí hai trục với các cánh có thể quay một góc độ nào đó để dễ dàng điều chỉnh. Điều đó cho phép xác định khe hở cần thiết theo hướng chính giữa các cánh và thành tường của thiết bị, nó phụ thuộc vào các tính chất hoá lý của các cấu tử và thành phần của môi trường. Các trục quay theo các hướng khác nhau làm cho môi trường chuyển đảo liên tục trong những hướng đối nhau. Loại cấu tạo này sẽ đảm bảo sự đảo trộn môi trường, làm giảm đáng kể sự vón cục và đảm bảo sự đồng nhất môi trường có thành phần nhiều cấu tử. Điều đó có ảnh hưởng tốt tới quá trình nuôi cấy. Hơi có áp suất 0,2 MPa cho vào áo hơi để làm tăng nhanh quá trình đun nóng môi trường. Môi trường được giữ ở chế độ tiệt trùng đã cho khi khởi động chu kì các cơ cấu chuyển đảo. Thể tích của thiết bị và công suất của động cơ được thiết kế phù hợp với 400 kg các cấu tử khô của môi trường và 600 lít nước để thu nhận môi trường có độ ẩm 58÷60%. Tiến hành tháo môi trường dinh dưỡng đã được tiệt trùng qua cửa tháo liệu bên dưới. Cửa tháo liệu có các nắp trong và ngoài được lắp chặt bằng các vít. Ngoài ra, thiết bị tiệt trùng còn có các cửa nạp liệu, nhiều khớp nối để nạp hơi và thải nước ngưng, để nạp và thải nước làm lạnh, cho các dụng cụ kiểm tra và điều chỉnh nhiệt độ, áp suất và có van bảo hiểm. Đặc tính kỹ thuật thiết bị tiệt trùng dạng nằm ngang: Lượng các cấu tử khô của môi trường cho vào (kg) 400 Năng suất (kgngày) 1600 ÷ 2400 Ap suất cho phép (Mpa) 0,2 Số vòng quay của máy trộn (vòngs) 0,25 Công suất của động cơ (kW) 10 Kích thước cơ bản (mm) Đường kính 1800 Chiều dài 2800 Chiều dày thành vỏ (mm) 8 Khối lượng của thiết bị (kg) 8000 5.2. Thiết bị tiệt trùng hai mức tác động tuần hoàn dạng nằm ngang Thiết bị tiệt trùng gồm hai mức nằm ngang, giữa các mức có bộ trữ. Mức trên và mức dưới gồm ba đoạn ống nằm ngang nối liên tục, có chiều dài tổng cộng 7000 mm. Hơi dưới áp suất 0,5 ÷ 0,6 MPa được nạp vào áo vỏ của mỗi đoạn ống. Bên trong ống phía trên có trục gắn các cánh và có số vòng quay 0,1 vòngs. Nạp các cấu tử của môi trường vào mức trên và nhờ vít tải chúng chuyển động dọc theo bộ phận trên của thiết bị, môi trường được tiệt trùng khi chuyển dịch liên tục. Đặc điểm của mức trên là sự có mặt của các cánh hãm bổ sung được lắp chặt vào trục vít, cứ 5 ÷ 6 cánh hướng có một cánh hãm. Nhờ thế mà sự đun nóng đều môi trường và sự chuyển dịch tốt được đảm bảo. Môi trường được tiệt trùng từ mức trên vào bộ giữ. Bộ giữ là thiết bị kín có đáy hình nón và có cơ cấu chuyển dời. Môi trường được giữ khoảng 60 ÷ 90 phút. Để ổn định nhiệt độ tiệt trùng đã cho, bộ giữ có áo hơi ngoài. Từ bộ giữ, môi trường qua bộ định lượng vào mức dưới với một lượng đồng nhất theo mức trên. Tại mức 2 xảy ra làm ẩm thêm môi trường, làm nguội và cấy huyền phù của canh trường. Góc nghiêng của các cánh trục có thể thay đổi, cho nên có thể điều chỉnh được năng suất của thiết bị. Thiết bị tiệt trùng hai mức được trang bị các phương tiện kiểm tra tự động và điều chỉnh các thông số của quá trình. Nhược điểm của loại thiết bị trên là không sử dụng hết thể tích của thiết bị, môi trường lấp kín cửa tháo liệu làm cho chế độ tiệt trùng khó bảo đảm cũng như tháo liệu không hết. Đặc tính kỹ thuật của thiết bị tiệt trùng hai mức dạng nằm ngang Năng suất (kgh): của thiết bị tiệt trùng (mức trên): 150 của bộ làm ẩm (mức dưới): 225 ÷ 250 Sức chứa của bộ giữ (m3) 2 Kích thước cơ bản (mm) 7000 × 2000 × 3000 Nước làm lạnh Hình 7. Thiết bị tiệt trùng hai mức tác động chu kỳ, dạng nằm ngang 5.3. Thiết bị tiệt trùng tác động tuần hoàn dạng đứng Thiết bị dùng để tiệt trùng các môi trường thể hạt có hai mức. Mức đầu là nồi tiệt trùng dạng đứng dùng để đun nóng và tiệt trùng môi trường đã được làm ẩm, mức hai là bộ đảo trộn dạng nằm ngang dùng để làm ẩm, làm nguội và cấy canh trường. Khối lượng của thiết bị tiệt trùng bảo đảm để nạp đến 600 kg môi trường có độ ẩm 30%. Bên trong thiết bị dạng đứng được trang bị bộ khuấy trộn có các cánh bố trí theo chiều cao. Khi quay, bề mặt dưới của cánh chuyển động song song với tiết diện ngang của thiết bị, còn bề mặt trên của cánh tạo thành mặt nghiêng để cho môi trường dễ chuyển dịch. Do đó các cánh có sức cản chính diện nhỏ và môi trường không bị nén. Bước của các cánh được chọn sao cho khi trục quay có thể đổ tràng môi trường một cách tự do. Khi phân bổ các cánh theo kiểu bàn cờ và trang bị các tấm chắn cố định thì quá trình khuấy trộn sẽ được tăng cường. Nạp hơi vào thiết bị tiệt trùng qua trục rỗng vào các cánh. Trong phần hình nón của các thiết bị có các cánh khuấy trộn nhằm bảo đảm việc tháo môi trường một cách tự do qua cửa kín. Cửa mở nhờ bộ dẫn động thuỷ lực tự động. Thiết bị có áo hơi, các cửa quan sát, các phương tiện tự động hoá để điều chỉnh nhiệt độ và áp suất hơi. Đặc tính kỹ thuật của thiết bị tiệt trùng dạng đứng cho mức 1 Năng suất (kgh) 240 ÷ 300 Thể tích (m3) 2 Ap suất dư trong thiết bị và trong áo hơi (MPa) 0,147 Công suất động cơ (kW) 5,5 Khối lượng môi trường (kg): 600 Độ ẩm môi trường (%) 30 Tiêu hao hơi (kgh) 210 Kích thước cơ bản (mm) 1500 × 1400 × 4500 Khối lượng (kg) 1620 Mức 2 của thiết bị tiệt trùng máy khuấy trộn, là thiết bị hình trụ dạng nằm ngang được chế tao bằng loại thép X18H07. Bên trong có trục với các cánh khuấy. Đầu cánh khuấy có lưỡi nạo, cách thành thiết bị một khoảng cách nhỏ. Gối trục được đặt ở ngoài. Trong gối trục có phớt chắn. Số vòng quay của trục 0,166 ÷ 0,2 vòngs. Nếu số vòng quay lớn thì môi trường sẽ bị nén chặt và làm giảm độ rỗng làm cho canh trường phát triển yếu. Trên nắp thiết bị có gắn bộ lấy mẫu. Bộ lấy mẫu là một vít tải kín được nằm trong ống có rãnh ở phía trên và cốc được bịt kín để chứa môi trường đã được tiệt trùng, vít tải chuyển môi trường vào cốc. Cửa thoát liệu có đoạn ống dẫn được bố trí ở phần trụ phía dưới của bộ khuấy trộn. Tại đây môi trường tiệt trùng đã được cấy vi sinh vật vào phòng nuôi. Đặc tính kỹ thuật của bộ khuấy trộn Năng suất (kgh) 300 ÷ 400 Thể tích (m3) 3,2 Áp suất (Mpa) + Bên trong thiết bị: 0,144 + Trong áo hơi: 0,288 Công suất động cơ cho cơ cấu khuấy trộn (kW) 7,5 Công suất động cơ cho cơ cấu đóng kín (kW) 0,8 Hệ số chứa đầy: 0,6 Tiêu hao nước để làm lạnh thiết bị (m3h) 2,1 Tiêu hao nước tiệt trùng để làm lạnh 670 kg môi trường (m3) 0,27 Kích thước cơ bản (mm) 4800×1400×2100 Khối lượng (kg) 5140 5.4.Thiết bị tiệt trùng dạng rung Thiết bị tiệt trùng tác dụng liên tục dạng rung gồm máng đóng kín dạng nằm ngang, máy rung lệch tâm được đặt ở phần giữa máng, lò nung cách lửa, các cơ cấu nén, phễu chứa nguyên liệu và các dụng cụ kiểm tra các thông số của quá trình. Theo chiều dài máng được chia làm ba phần: phần nạp liệu có chức năng định lượng, phần tiệt trùng trong lò nung cách lửa để đun nóng và tiệt trùng môi trường ở nhiệt độ 130 ÷140oC và phần cấy trong lò nung cách lửa khác để làm nguội và làm ẩm môi trường khi bổ sung nước tiệt trùng lạnh, gieo cấy và khuấy trộn. Ví dụ: Cám gạo từ thùng chứa cho vào phần nạp liệu của máy tiệt trùng, chiều cao của lớp cám được xác định nhờ van điều chỉnh. Định lượng cám được điều chỉnh bởi tần số dao động của máy rung. Khi chuyển đảo theo máng rung, cám hay các loại nguyên liệu khác được tiệt trùng bằng nguồn nhiệt bức xạ với nhiệt độ đã được quy định. Sau đó cho vào phòng cấy, được làm lạnh bằng nước trong ruột xoắn cũng như bằng nước lạnh trực tiếp đã được tiệt trùng dùng để làm ẩm cám. Sau khi làm lạnh, nạp lượng huyền phù nấm mốc đã được định lượng vào thiết bị và do xung rung động truyền liên tục cho máng làm tăng mạnh sự khuấy trộn môi trường. Việc nạp môi trường dinh dưỡng đã được tiệt trùng vào phòng nuôi cấy cũng được định lượng bằng máy tiệt trùng rung.

5 Trang thiết bị phương pháp khử trùng môi trường trước lên men Một điều kiện có ảnh hưởng lớn tới tổng hợp sinh hoá chất hoạt hoá sinh học bảo đảm độ tiệt trùng có độ tiệt trùng cấu tử môi trường dinh dưỡng Khi sản xuất chất hoạt hoá sinh học thường người ta ứng dụng mơi trường dinh dưỡng có nhiều cấu tử khác Các mơi trường chứa nhiều sinh vật lạ Cần phải phá huỷ hay loại chúng hồn tồn khỏi mơi trường Q trình tác động tới môi trường dinh dưỡng nhằm phá huỷ hay tách hoàn toàn vi sinh vật gọi tiệt trùng Loại trừ hay phá huỷ vi khuẩn thực phương pháp khác Phá huỷ dẫn đến làm hoàn toàn khả sống vi sinh vật phương pháp tiệt trùng an tồn Hiện điều kiện cơng nghiệp cần ứng dụng phương pháp đơn giản có hiệu kinh tế để tiệt trùng môi trường với việc sử dụng nhiệt - ẩm Yếu tố bảo đảm tiệt trùng an tồn gia cơng nhiệt thời gian trình Độ bền nhiệt phụ thuộc vào dạng vi sinh vật Ví dụ, bào tử nấm mốc khoảng ÷ 10 lần bền nhiệt loại trực khuẩn không mang bào tử, virut thể thực khuẩn ÷ lần, cịn bào tử bacterium khoảng triệu lần Thành phần tính chất môi trường dinh dưỡng phương pháp nuôi cấy xác định việc lựa chọn phương pháp tiệt trùng thiết bị cho q trình cơng nghệ quan trọng Theo nguyên tắc tác động, tiệt trùng chia thành hai loại: tiệt trùng gián đoạn tiệt trùng liên tục, theo hình thành kết cấu nồi tiệt trùng tác động tuần hoàn chia thành loại sau: nồi tiệt trùng nằm ngang mức, hai mức, hai mức kết hợp với mức đứng, loại khác loại nằm ngang loại tác động liên tục - rung Chất tải nhiệt cho tất thiết bị nêu bão hồ Gia cơng nhiệt có nhiều ưu việt dễ dàng vận chuyển, khả xâm nhập vào ngóc ngách thiết bị, đường ống, phụ tùng dễ dàng, toả nhiệt cao ngưng tụ, không độc hại, nước ngưng không làm biến đổi môi 26 trường làm ướt tế bào có khả làm tăng tốc độ huỷ diệt khoảng 10 ÷ 1000 lần 2.5.1 Thiết bị tiệt trùng dạng nằm ngang Trong công nhiệp vi sinh để tiệt trùng môi trường dinh dưỡng dạng rời, người ta sử dụng rộng rãi thiết bị tiệt trùng hình trụ dạng nằm ngang có áo Bên thiết bị tiệt trùng bố trí hai trục với cánh quay góc độ để dễ dàng điều chỉnh Điều cho phép xác định khe hở cần thiết theo hướng cánh thành tường thiết bị, phụ thuộc vào tính chất hố lý cấu tử thành phần môi trường Các trục quay theo hướng khác làm cho môi trường chuyển đảo liên tục hướng đối Loại cấu tạo đảm bảo đảo trộn mơi trường, làm giảm đáng kể vón cục đảm bảo đồng mơi trường có thành phần nhiều cấu tử Điều có ảnh hưởng tốt tới q trình ni cấy Hơi có áp suất 0,2 MPa cho vào áo để làm tăng nhanh trình đun nóng mơi trường Mơi trường giữ chế độ tiệt trùng cho khởi động chu kì cấu chuyển đảo Thể tích thiết bị công suất động thiết kế phù hợp với 400 kg cấu tử khô môi trường 600 lít nước để thu nhận mơi trường có độ ẩm 58÷60% Tiến hành tháo mơi trường dinh dưỡng tiệt trùng qua cửa tháo liệu bên Cửa tháo liệu có nắp ngồi lắp chặt vít Ngồi ra, thiết bị tiệt trùng cịn có cửa nạp liệu, nhiều khớp nối để nạp thải nước ngưng, để nạp thải nước làm lạnh, cho dụng cụ kiểm tra điều chỉnh nhiệt độ, áp suất có van bảo hiểm 27 28 Đặc tính kỹ thuật thiết bị tiệt trùng dạng nằm ngang: Lượng cấu tử khô môi trường cho vào (kg) 400 Năng suất (kg/ngày) 1600 ÷ 2400 Ap suất cho phép (Mpa) 0,2 Số vịng quay máy trộn (vịng/s) 0,25 Cơng suất động (kW) 10 Kích thước (mm) Đường kính 1800 Chiều dài 2800 Chiều dày thành vỏ (mm) Khối lượng thiết bị (kg) 8000 5.2 Thiết bị tiệt trùng hai mức tác động tuần hoàn dạng nằm ngang Thiết bị tiệt trùng gồm hai mức nằm ngang, mức có trữ Mức mức gồm ba đoạn ống nằm ngang nối liên tục, có chiều dài tổng cộng 7000 mm Hơi áp suất 0,5 ÷ 0,6 MPa nạp vào áo vỏ đoạn ống Bên ống phía có trục gắn cánh có số vịng quay 0,1 vịng/s Nạp cấu tử mơi trường vào mức nhờ vít tải chúng chuyển động dọc theo phận thiết bị, môi trường tiệt trùng chuyển dịch liên tục Đặc điểm mức có mặt cánh hãm bổ sung lắp chặt vào trục vít, ÷ cánh hướng có cánh hãm Nhờ mà đun nóng mơi trường chuyển dịch tốt đảm bảo Môi trường tiệt trùng từ mức vào giữ Bộ giữ thiết bị kín có đáy hình nón có cấu chuyển dời Mơi trường giữ khoảng 60 ÷ 90 phút Để ổn định nhiệt độ tiệt trùng cho, giữ có áo ngồi Từ giữ, môi trường qua định lượng vào mức với lượng đồng theo mức Tại mức xảy làm ẩm thêm môi trường, làm nguội cấy huyền phù canh trường Góc nghiêng cánh trục thay đổi, điều chỉnh suất thiết 29 bị Thiết bị tiệt trùng hai mức trang bị phương tiện kiểm tra tự động điều chỉnh thông số trình Nhược điểm loại thiết bị khơng sử dụng hết thể tích thiết bị, mơi trường lấp kín cửa tháo liệu làm cho chế độ tiệt trùng khó bảo đảm tháo liệu khơng hết Đặc tính kỹ thuật thiết bị tiệt trùng hai mức dạng nằm ngang Năng suất (kg/h): thiết bị tiệt trùng (mức trên): làm ẩm (mức dưới): 150 225 ÷ 250 Sức chứa giữ (m3) Kích thước (mm) 7000 × 2000 × 3000 Nước làm lạnh Hình Thiết bị tiệt trùng hai mức tác động chu kỳ, dạng nằm ngang 30 5.3 Thiết bị tiệt trùng tác động tuần hoàn dạng đứng Thiết bị dùng để tiệt trùng mơi trường thể hạt có hai mức Mức đầu nồi tiệt trùng dạng đứng dùng để đun nóng tiệt trùng môi trường làm ẩm, mức hai đảo trộn dạng nằm ngang dùng để làm ẩm, làm nguội cấy canh trường Khối lượng thiết bị tiệt trùng bảo đảm để nạp đến 600 kg mơi trường có độ ẩm 30% Bên thiết bị dạng đứng trang bị khuấy trộn có cánh bố trí theo chiều cao Khi quay, bề mặt cánh chuyển động song song với tiết diện ngang thiết bị, bề mặt cánh tạo thành mặt nghiêng môi trường dễ chuyển dịch Do cánh có sức cản diện nhỏ mơi trường khơng bị nén Bước cánh chọn cho trục quay đổ tràng mơi trường cách tự Khi phân bổ cánh theo kiểu bàn cờ trang bị chắn cố định trình khuấy trộn tăng cường 31 Nạp vào thiết bị tiệt trùng qua trục rỗng vào cánh Trong phần hình nón thiết bị có cánh khuấy trộn nhằm bảo đảm việc tháo môi trường cách tự qua cửa kín Cửa mở nhờ dẫn động thuỷ lực tự động Thiết bị có áo hơi, cửa quan sát, phương tiện tự động hoá để điều chỉnh nhiệt độ áp suất Đặc tính kỹ thuật thiết bị tiệt trùng dạng đứng cho mức 240 ÷ 300 Năng suất (kg/h) Thể tích (m3) Ap suất dư thiết bị áo (MPa) 0,147 Công suất động (kW) 5,5 Khối lượng môi trường (kg): 600 Độ ẩm môi trường (%) 30 Tiêu hao (kg/h) 210 Kích thước (mm) 1500 × 1400 × 4500 Khối lượng (kg) 1620 Mức thiết bị tiệt trùng - máy khuấy trộn, thiết bị hình trụ dạng nằm ngang chế tao loại thép X18H07 Bên có trục với cánh khuấy Đầu cánh khuấy có lưỡi nạo, cách thành thiết bị khoảng cách nhỏ Gối trục đặt Trong gối trục có phớt chắn Số vịng quay trục 0,166 ÷ 0,2 vịng/s Nếu số vịng quay lớn mơi trường bị nén chặt làm giảm độ rỗng làm cho canh trường phát triển yếu Trên nắp thiết bị có gắn lấy mẫu Bộ lấy mẫu vít tải kín nằm ống có rãnh phía cốc bịt kín để chứa mơi trường tiệt trùng, vít tải chuyển mơi trường vào cốc Cửa liệu có đoạn ống dẫn bố trí phần trụ phía khuấy trộn Tại môi trường tiệt trùng cấy vi sinh vật vào phịng ni Đặc tính kỹ thuật khuấy trộn Năng suất (kg/h) 300 ÷ 400 32 Thể tích (m3) 3,2 Áp suất (Mpa) + Bên thiết bị: 0,144 + Trong áo hơi: 0,288 Công suất động cho cấu khuấy trộn (kW) 7,5 Cơng suất động cho cấu đóng kín (kW) 0,8 Hệ số chứa đầy: 0,6 Tiêu hao nước để làm lạnh thiết bị (m3/h) 2,1 Tiêu hao nước tiệt trùng để làm lạnh 670 kg môi trường (m3) Kích thước (mm) Khối lượng (kg) 0,27 4800×1400×2100 5140 5.4.Thiết bị tiệt trùng dạng rung Thiết bị tiệt trùng tác dụng liên tục dạng rung gồm máng đóng kín dạng nằm ngang, máy rung lệch tâm đặt phần máng, lò nung cách lửa, cấu nén, phễu chứa nguyên liệu dụng cụ kiểm tra thơng số q trình Theo chiều dài máng chia làm ba phần: phần nạp liệu có chức định lượng, phần tiệt trùng lị nung cách lửa để đun nóng tiệt trùng mơi trường nhiệt độ 130 ÷140oC phần cấy lò nung cách lửa khác để làm nguội làm ẩm môi trường bổ sung nước tiệt trùng lạnh, gieo cấy khuấy trộn Ví dụ: Cám gạo từ thùng chứa cho vào phần nạp liệu máy tiệt trùng, chiều cao lớp cám xác định nhờ van điều chỉnh Định lượng cám điều chỉnh tần số dao động máy rung Khi chuyển đảo theo máng rung, cám hay loại nguyên liệu khác tiệt trùng nguồn nhiệt xạ với nhiệt độ quy định Sau cho vào phịng cấy, làm lạnh nước ruột xoắn nước lạnh trực tiếp tiệt trùng dùng để 33 làm ẩm cám Sau làm lạnh, nạp lượng huyền phù nấm mốc định lượng vào thiết bị xung rung động truyền liên tục cho máng làm tăng mạnh khuấy trộn môi trường Việc nạp môi trường dinh dưỡng tiệt trùng vào phịng ni cấy định lượng máy tiệt trùng rung Hình Thiết bị tiệt trùng dạng rung Đặc tính kỹ thuật máy tiệt trùng rung: Năng suất tính theo chủng nấm mốc (tấn/ngày) Nhiệt độ tiệt trùng (oC) Tần số dao động (Hz) 3,5 120 ÷ 140 ÷ 29,5 Biên độ dao động (mm) Cơng suất động (kW) 4,5 Kích thước (mm) Khối lượng (kg) 1400 × 1500 × 1400 5840 34 Dùng nhiệt từ nguồn truyền nhiệt bên ngồi để bổ sung nung nóng chất nền; nhiệt truyền vào bên chất độ dẫn nhiệt vật thể tồn trường khơng Cho nên tốc độ đun nóng phụ thuộc vào hình dạng thể tích vật liệu hạn chế đại lượng grandient nhiệt Nhược điểm việc sử dụng để tiệt trùng vỏ thiết bị phải kín cách nhiệt Sự phân bổ nhiệt khối tiệt trùng không đồng khuấy trộn làm cho mơi trường đun nóng khơng đều; phải sử dụng thiết bị nhiệt khác; tạo vón cục mơi trường dinh dưỡng q trình tiệt trùng; tạo hồ hoá tinh bột làm giảm đáng kể trình phát triển canh trường 5.5 Tiệt trùng mơi trường dòng điện cao tần Khác nguyên tắc việc nung nóng vật liệu dịng điện cao tần chỗ: đun nóng vật liệu đến nhiệt độ cần thiết xảy nhanh tạo lượng trực tiếp dòng điện cao tần thành lượng nhiệt Tốc độ đun nóng phân tử vật liệu xác định cường độ dòng điện, thông số điện - lý vật liệu khơng phụ thuộc vào hình dạng Thiết bị tiệt trùng cao tần tác dụng liên tục gồm máy phát điện cao tần, phễu nạp liệu có định lượng dạng rơto, dẫn điện 2, cấu chuyển dịch bảng mỏng ngưng tụ 3, hai bảng phẳng song song 4, vận chuyển băng tải chịu nhiệt bố trí bên phịng kín chuyển dịch bảng mỏng ngưng tụ, định lượng nước tiệt trùng 6, định lượng huyền phù cấy 7, vít hai đoạn 8, dẫn động vít tải dẫn động băng vận chuyền 10 Theo chiều dài phần làm việc băng tải, lắp biên chắn để xác định mặt cắt lớp rải Nhờ cấu định lượng môi trường dinh dưỡng nạp vào phễu chứa vào băng tải vận chuyển với lớp có chiều dày 30 mm Khi chuyển vào vùng có trường điện cao tần (tạo nước ngưng giàn phẳng) mơi trường đun nóng đến nhiệt độ tiệt trùng Theo mức độ từ vùng đun nóng, môi trường dinh dưỡng làm nguội toả nhiệt tự nhiên đến 40 ÷ 50oC sau đổ từ băng tải vận chuyển vào mức để làm lạnh làm ẩm 35 làm lạnh sơ thiết bị trao đổi nhiệt dạng tấm, cịn mơi trường dinh dưỡng chưa tiệt trùng đẩy vào đun nóng từ thu nhiệt Bộ giữ nhiệt bình hình trụ hai đáy dạng elip, bên theo chiều cao bố trí 10 lơ Mỗi lơ có đoạn ống trung tâm với đĩa 2, đĩa gắn đoạn ống, đoạn ống hàn cuối đoạn ống dẫn hướng Các lô tạo hai dãy hình trụ: mơi trường từ phòng số qua rãnh số vào đoạn ống trung tâm mơi trường có tốc độ lớn khỏi đoạn ống trung tâm qua khe hở nhỏ vào phòng số Nhờ đoạn ống hướng mà môi trường chuyển động xốy làm cho q trình khuấy - trộn tốt Sau vào phận khác qua khe vịng đĩa số đoạn ống thiết bị số Khi qua liên tục từ lên môi trường giữ lại nhiệt độ cho thời gian định trước, mơi trường từ đoạn ống nắp giữ nhiệt qua đoạn ống vào giữ nhiệt thứ sau tiếp tục vào giữ nhiệt thứ Đường kính giữ nhiệt 600 mm, chiều cao 6000 mm, Sức chứa giữ nhiệt 1,7 m3 Để giữ nhiệt độ môi trường, giữ nhiệt cần phải phủ lớp cách nhiệt có chiều dày 35 mm, ống nối liên kết lớp 50 mm Bộ thu nhiệt thiết bị trao đổi nhiệt dạng có bề mặt trao đổi nhiệt 100 m2 Trong q trình thu hồi nhiệt mơi trường tiệt trùng chưa tiệt trùng chuyển động thành lớp mỏng rãnh hình thành từ cặp Mỗi bao bọc hướng từ môi trường nóng hướng khác từ mơi trường làm lạnh, nhờ bề mặt uốn sóng mà thiết lập chế độ chảy rối dung dịch nhằm bảo đảm trao đổi nhiệt mạnh Hiệu suất làm việc thu hồi nhiệt đặc trưng hệ số thu hồi nhiệt Hệ số YHC - 20 đạt 77% Hệ thống thiết bị lắp đặt dụng cụ đo - kiểm tra nhằm đảm bảo việc tự động trình 42 Những nguyên tắc điều hòa trao đổi chất Trong hoạt động sống mình, VSV tạo sản phẩm trao đổi chất thành phần cấu tạo lên tế bào mức cần thiết cho sinh trưởng, phát triển, sinh sản trì lồi Có nghĩa là, tự nhiên khơng có sinh sản dư thừa sản phẩm trao đôi chất bâc 1,2,… Sự trao đổi chất tế bào có tính chất kinh tế bảo đảm nhờ VSV tồn chế điều hòa trao đổi chất tổng hợp phát triển mức độ cao 6.1.Điều hịa hoạt tính enzym nhờ ức chế sản phẩm cuối hay gọi kìm hãm liên kết ngược Người ta nhận thấy sản phẩm cuối trình sinh tổng hợp chất có khả gây ức chế q trình tổng hợp Sản phẩm cuối dù tế bào tổng hợp hay thu nhận từ mơi trường ngồi, nồng độ dư thừa so với nhu cầu thể vi sinh vật ảnh hưởng đến enzym chuỗi sinh tổng hợp Ta có sơ đồ chuỗi phản ứng sinh hóa xảy để tổng hợp chất (X): A a B b C c X Enzym (a) enzym dị lập thể Nó có đặc điểm thay đổi cấu hình khơng gian có mặt sản phẩm cuối nhằm giảm bớt hoạt tính xúc tác Ở enzym này, ngồi vị trí gắn với chất A (trung tâm xúc tác), cịn có hay nhiều vị trí gắn với sản phẩm cuối X gọi trung tâm dị lập thể Trung tâm xúc tác trung tâm dị lập thể tách biệt không gian khác cấu trúc Trạng thái hoạt động enzym đặc trưng chỗ: có khả gắn với chất bên cạnh chất A có diện X mức độ dư thừa so với nhu cầu thể vi sinh vật xảy bao vây trung tâm dị lập thể, làm cho trung tâm xúc tác bị biến đổi cấu hình khơng gian đến mức khiến cho enzym (a) gắn với chất A mà gắn với X Như 43 enzym (a) khơng có hiệu lực việc chuyển hóa thành B Chuối sinh tổng hợp X bị gián đoạn Do X bị giảm số lượng Sự ức chế trình sinh tổng hợp xảy nhanh có hiệu Người ta nhận thấy enzym (a) thể vi sinh vật tổng hợp nên bị bất hoạt Sự điều hòa mức độ enzym 6.2 Sự cảm ứng ức chế q trình tổng hợp enzym Khi mơi trường ni cấy vi sinh vật có chất khó đồng hóa Vi sinh vật phải tiết vào mơi trường enzym tương ứng để phân hủy chất thành chất đồng hóa Enzym hình thành gọi enzym cảm ứng, chất kích thích q trình – tức chất khó đồng hóa gọi chất cảm ứng Sự cảm ứng ức chế trình tổng hợp enzym vi sinh vật F Jacob J Monod giải thích dựa sở thuyết Operon Đây học thuyết F Jacob J Monod đề nghiên cứu đối tượng vi khuẩn đường ruột Escherichia Coli Hai ông nhận giải Nobel năm 1966 Học thuyết Operon giúp làm sáng tỏ chế điều hịa chương trình làm việc gen trình sinh tổng hợp protein – enzym Theo F Jacob J Monod AND nhiễm sắc thể phân hóa mặt chức phận jthành số gen: 44 Hình 12 Sơ đồ điều hịa sinh tổng hợp protein-enzym theo F Jacob J Monod a nhóm gen cấu trúc Nhóm gen đảm nhận việc mã hóa cấu trúc phân tử protein – enzym Các gen thường xếp liền Trong trường hợp Lac Operon E Coli gen cấu trúc gồm ba gen ký hiệu A, B C - Gen A: Mã hóa thứ tự amino acid β – galactosidase - Gen B: mã hóa cấu trúc enzym thảm thấu galactosidepermease cần thiết cho trình vận chuyển lactoza tế bào - Gen C: mã hóa cấu trúc enzym thiogalactoseacetyltransferase Cả ba gen cấu trúc nói tạo thành đơn vị phiên mã b Gen điều khiển (Operator) Là đoạn AND nằm kề bên gen cấu trúc, ký hiệu O nhờ tác dụng gắn với chất ức chế , Operator làm việc “công tắc” phụ trách việc đóng mở hoạt động nhóm gen cấu trúc c Gen khởi động (Promoter) – ký hiệu P Là đoạn AND nằm kề phía trước Operator, nơi gắn ARN thơng tin nhóm gen cấu trúc Khi chất ức chế gắn vào Operator phân tử ARN polymerase bị 45 cản trở, không di truyển dọc theo mạch khuôn AND, dẫn đến gen cấu trúc bị ức chế không tạo đựoc protein enzym tương ứng vị trí chức nên người ta gọi gen Promoter (gen khởi động) d Gen điều hòa (Regulator) Gen chịu trách nhiệm mã hóa việc tổng hợp nên protein đặc biệt đóng vai trị chất ưc chế Thường tổng hợp với lượng không đáng kể tế bào (khoảng 10-20 phẩn tử/tế bào) Đặc điểm chất ức chế: protein biến cấu oligomer; có hai tâm đặc thù, hai tâm cho chất ức chế có khả gắn với chất cảm ứng với Operator: Chất ức chế có lực lớn Operator, thơng thường hay gắn với Operator Nhóm gen cấu trúc, gen Operator gen promoter tổ hợp lại thành đơn vị gọi OPERON Mỗi Operon tương ứng với gen điều hịa chịu kiểm sốt nghiêm ngặt gen Khi môi trường xuất chất cảm ứng Chất có lực với chất ức chế, tác dụng với chất ức chế Điều đáng ý chất cảm ứng tác dụng với chất ức chế làm cho chất ức chế bị bất hoạt Cụ thể: chất cảm ứng gứn với chất ức chế, làm thay đổi cấu trúc khơng gian chất ức chế, làm giảm lực tâm gắn chất ức chế với Operator, từ giúp Operator tự giải khổi chất ức chế Lúc Operon giải phóng Liên đới gen Promoter giải phóng Phẩn tử ARN polymerase khơng bị cản trở di chuyển dọc theo mạch khn ADN Q trình tổng hợp ARN thơng tin bắt đầu Các gen cấu trúc làm việc để tiến tới tơng hợp protein Enzym hình thành Chính enzym hình thành có trách nhiệm phân hủy co chất khó đơng hóa (chất cảm ứng) nói Đó enzym cảm ứng Người ta khái quát nhứng điều kiện tổng hợp enzym cảm ứng sau: - Trên nhiễm sắc thể tế bào phải có gen tương ứng với enzym hình thành - Các nguyến liệu xây dựng phân tử enzym: amino acid hợp phần nhóm ngoại (nếu enzym cần có nhóm phân tử) - Năng lượng cần thiết cho việc hình thành liên kết 46 - Chất cảm ứng - Theo sơ đồ Jacob Monod, dù có ba điều kiện mà khơng có chất cảm ứng enzym cảm ứng khơng hình thành Như vậy, để hình thành enzym cảm ứng phải hội tụ bốn điều kiện: gen, nguyên liệu xây dựng, lượng chất cảm ứng 6.3 Điều hòa tổng hợp enzym sản phẩm cuối giải kiềm chế Trong chế lại gặp lại chất X – chất có phân tử khối thấp, sản phẩm cuối chuỗi sinh tổng hợp Ví dụ X amino acid chẳng hạn: a b Hình 13 Điều hịa tổng hợp enzym nhờ ức chế sản phẩm cuối giải kiềm chế a Khơng có amino acid enzym tổng hợp b Có amino acid enzym khơng tổng hợp Người ta nhận thấy X có tác dụng đặc hiệu với chất ức chế (chất gen điều hịa tổng hợp lên) Khi mơi trường có tượng dư thừa X so với nhu cầu tế bào, X gắn với chất ức chế, làm thay đổi cấu hình khơng gian chất ức chế, làm cho chất ức chế có khả gắn với operator (cịn gọi hoạt hóa chất ức chế) Do gọi chất X chất đồng kìm hãm Khi chất ức chế gắn với operator làm ngừng trệ 47 trình phiên mã, ức chế operon, dẫn đến enzyme khơng tổng hợp được, việc sản xuất X bị gián đoạn Trong tế bào tiếp tục sử dụng chất X, khiến cho chất bị giảm tới mức không đủ để đáp ứng nhu cầu tế bào Lúc xảy trình giải phóng kiềm chế operon nói trên, thiếu chất X, chất ức chế lúc thiếu yếu tố hoạt động hóa học, khơng có khả gắn với operator, điều dẫn đến giải phóng operon, dẫn tới enzyme tổng hợp việc sản xuất X tiến hành trở lại Đó tượng giải kiềm chế 6.4 Điều hòa tổng hợp enzym nhờ kiềm chế dị hóa Trong ni cấy VSV có nhiều nguồn chất, trước hết xảy việc tổng hợp enzyme xúc tác cho phân giải chất dễ sử dụng Sự tổng hợp enzyme xúc tác phân huỷ chất khác bị ức chế kiềm chế dị hóa Ví dụ: Trong mơi trường ni cấy có hai nguồn carbohydrate là: glucose lactose Trước tiên vi sinh vật hình thành enzyme phân giải glucose Sự cảm ứng để tổng hợp enzyme phân giải lactose β- galactosidase bị ức chế kiềm chế dị hóa Cơ chế kiềm chế dị hóa nghiên cứu chi tiết vi khuẩn E coli với việc điều hòa tổng hợp enzyme β- galactosidase Nếu trường hợp carbohydrate, glucose nguồn chất sử dụng thích hợp nhất, có mặt glucose nhiều enzyme khác q trình dị hóa trao đổi chất trung gian không tổng hợp Người ta gọi tượng hiệu ứng glucose + Khi mơi trường khơng có glucose,có lactose a 48 Hình 14 Điều hịa tổng hợp enzym nhờ kiềm chế dị hóa Mơi trường khơng có glucose, dẫn đến tích luỹ lượng lớn AMPv (adenosine monophosphate vịng) Lúc AMPv phản ứng với protein nhận ký hiệu CAP - (catabolite activato rprotein) Người ta gọi tượng vùng Promoter bị “chất đầy” Chính chất đầy tiền đề cho hoạt động enzyme RNA polymerase, có nghĩa thúc đẩy hoạt hóa 49 nhờ “chất đầy” Đồng thời mơi trường cịn có mặt lactose, lactose đóng vai trị chất cảm ứng, phản ứng với chất ức chế, làm thay đổi cấu hình khơng gian chất ức chế để tạo phức hệ ức chế - chất cảm ứng Điều khiến cho chất ức chế không gắn với operator Như Lac-operon giải phóng + Khi mơi trường có glucose, có lactose: Trong mơi trường ngồi lactose cịn bổ sung glucose, lúc hàm lượng AMPv bị giảm đi, hậu CAP không tạo phức hệ với AMPv, khơng có “chất đầy” Promoter Liên đới RNA polymerase không mở đầu hoạt động mở yếu Vì có mặt chất cảm ứng (lactose) khơng có tổng hợp RNA thơng tin có nghĩa khơng có tạo thành enzyme + Khi mơi trường khơng có glucose khơng có lactose: Nếu mơi trường khơng có hai glucose lactose, chất ức chế gắn vào operator nên Operon bị phong tỏa Do RNA thơng tin khơng tổng hợp Khơng có tổng hợp protein- enzyme 6.5 Những sai hỏng di truyền điều hòa trao đổi chất tượng siêu tổng hợp Những chế điều hịa nói giúp cho thể VSV đảm bảo hoạt động sống tiến hành cách nhịp nhàng sở tiết kiệm nguyên liệu, lượng cách hợp lý Tuy nhiên, VSV có hoạt động sống bình thường khơng có lý để quan tâm đặc biệt đến chúng Trong hoạt động sống VSV chúng ln tiết sản phẩm đó, mà sản phẩm lại cần thiết cho người So với nhu cầu cho hoạt động sống vi sinh vật, sản phẩm chúng tổng hợp chắn dư thừa lượng lớn Người ta nói: Những thể VSV có khả siêu tổng hợp chất Với phát triển khoa học, người tạo nhiều chủng giống VSV có khả siêu tổng hợp chất Đây kết 50 trình chọn lọc nhân tạo với phương pháp gây đột biến Những chủng đột biến có sai hỏng di truyền đáng quan tâm 6.5.1 Các chủng đột biến chế điều hịa hoạt tính enzyme sản phẩm cuối Lợi dụng chế điều hịa hoạt tính enzyme sản phẩm cuối cùng, người ta dùng đột biến làm hỏng trung tâm dị lập thể enzyme (a), làm cho khả gắn với chất X thân enzyme (a) cịn hoạt tính xúc tác chất A Do có mặt chất X sản phẩm cuối với số lượng dư thừa so với nhu cầu VSV, enzyme (a) xúc tác chuyển A thành B, dẫn đến chất X - tiếp tục tổng hợp 6.5.2 Các chủng đột biến có sai hỏng chế điều hòa tổng hợp enzyme Người ta dùng chất gây đột biến để làm sai hỏng chế điều hòa tổng hợp enzyme Cụ thể đụng chạm đến gen điều hòa (Regulator) - gen chi phối tạo nên chất ức chế, dẫn đến sai hỏng chất ức chế chí phá huỷ trình tổng hợp chất ức chế Hay có đột biến đụng chạm đến gen điều khiển (Operator) làm cho gen khả gắn với chất ức chế Kết tác động chất có nồng độ dư thừa so với nhu cầu vi sinh vật, enzyme cần thiết cho tổng hợp chúng hình thành chất tiếp tục tổng hợp tế bào Ý nghĩa kỹ thuật di truyền Để tìm chủng VSV theo mong muốn, người tìm cách tác động vào quy luật điều khiển trình trao đổi chất chúng Việc tạo nên chủng đột biến dựa sở hiểu biết quy luật di truyền biến dị VSV, dựa kinh nhiệm công tác lai tạo giống Những thành công công nghệ vi sinh cho phép chủ động tạo DNA tái tổ hợp điều kiện in vitro Càng hiểu thêm sinh học phân tử, di truyền học công nghệ gen Có thể nói ngày người chuyển đoạn gen từ sinh vật 51 sang sinh vật khác có khác biệt lớn di truyền, hay nói cách khác cắt bỏ hàng rào lồi tạo hóa gây dựng nên để cản trở giao phối khác lồi, nhằm bảo tồn tính đặc trưng loài Những hiểu biết chuyển tải gen Đây vấn đề phức tạp, tìm hiểu khái quát hai vấn đề sau: + Những cấu trúc tham gia chuyển tải gen + Quá trình hóa chuyển tải gen nhờ vi sinh vật 8.1 Những cấu trúc tham gia chuyển tải gen gọi thể mang (vector) Các vector chuyển hóa gen phải thoả mãn yêu cầu tối thiểu sau: - Là đoạn phân tử DNA có khả tự chép tích cực tế bào chủ, tồn độc lập tế bào không phụ thuộc chép gen tế bào chủ - Có kích thước nhỏ Càng nhỏ tốt, vector có kích thước nhỏ dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn khác chép nhanh, có hiệu - Có trình tự nhận biết enzyme giới hạn (RE) - Có khả chứa mẫu DNA ngoại lai - Có gen đánh dấu, tức có khả biểu bên ngồi để dễ nhận biết Gen đánh dấu gọi Marker, người nghiên cứu nhận biết dễ dàng tách tế bào có chứa gen cần chuyển tải khỏi quần thể vi khuẩn Ví dụ: Người ta thường dùng gen chi phối tính trạng đề kháng với chất kháng sinh làm gen đánh dấu Trong mơi trường có chứa kháng sinh, vi khuẩn có mang gen kháng kháng sinh sống sót Trong số cấu trúc sử dụng tham gia chuyển tải gen kể đến plasmid, phage, cosmid, YAC , mà phổ biến plasmid phage + Plasmid: Ở tế bào Prokaryote, cụ thể vi khuẩn, qua kính hiển vi điện tử quan sát chất nhân phân tử DNA ngun vẹn có dạng vịng trịn hình nhẫn Đó nhiễm sắc thể - nơi chứa nguyên liệu di truyền tế bào Cùng với nhiễm sắc thể cịn có cấu trúc hình nhẫn nhỏ người ta gọi plasmid Đem tách plasmid dạng tinh khiết để tìm hiểu cấu trúc tính chất nó, thấy 52 plasmid có cấu tạo từ DNA có khả tự nhân đơi cách độc lập tồn cách độc lập với gen vi khuẩn Vì người ta coi plasmid phần tử di truyền nằm máy di truyền vi khuẩn Ở nhóm Eukaryote, người ta phát plasmid nấm men Người ta thấy plasmid có hàng loạt đặc điểm riêng là: - Plasmid tham gia vào chế tái tổ hợp gen nội bào - Plasmid có khả di chuyển từ vi khuẩn sang vi khuẩn khác - Plasmid có khả vận chuyển gen - Plasmid có khả sinh sản cực nhanh có hoạt tính mạnh + Bacteriophage (Phage hay thực khuẩn thể) - Phage có kích thước nhỏ qua màng lọc vi khuẩn - Phage thể tính độc vi khuẩn qua chu trình sinh sản gây độc phage, có khả xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, đình trình trao đổi chất vi khuẩn lấy nguyên liệu từ vi khuẩn để xây dựng nên thành phần kể nguyên liệu di truyền Do hình thành đoạn DNA tái tổ hợp, bao gồm đoạn gen phage vi khuẩn Qua thực nghiệm cho thấy, việc sử dụng phage làm thể mang có nhiều ưu điểm so với plasmid, phage có đặc điểm giúp xâm nhập vào tế bào vi khuẩn hiệu nhiều so với chuyển plasmid vào vi khuẩn Hơn phage, kích thước đoạn DNA tiếp nhận lớn nhiều so với tiếp nhận plasmid 8.2 Q trình hóa chuyển tải gen nhờ vi sinh vật Thuần hóa gen trình bắt gen phải làm việc theo ý muốn người Quá trình phức tạp, địi hỏi có hiểu biết sâu sắc đặc tính gen kỹ thuật phân tử Trong kỹ thuật phân tử, vai trị enzyme quan trọng Enzyme gồm nhiều loại: nuclease, ligase, polymerase (DNA polymerase RNA polymerase) 8.2.1 Các enzyme phân cắt DNA (RNA) gọi nuclease 53 Các nuclease gồm hai nhóm: endonuclease exonuclease - Endonuclease enzyme cắt DNA phân tử, exonuclease cắt từ hai đầu mút phân tử DNA Trong nhóm endonuclease có enzyme giới hạn (RE -zyme), enzyme nhà khoa học đặc biệt quan tâm có đặc tính q, có tính đặc hiệu cao, cắt DNA mạch kép chỗ định không linh động Những điểm nhận biết enzyme thường có trình tự - cặp nucleotide đối xứng đảo ngược gọi palindrome Mỗi RE có trình tự nhận biết đặc trưng - Hiện người ta phát 500 loại RE, số có 100 loại RE bán thị trường Mới phát RE nhóm sinh vật nhân sơ Prokaryote, cịn nhóm nhân thật chưa phát thấy Do đặc tính RE có khả nhận biết cắt trình tự xác định phân tử DNA, mà người ta chia RE thành loại sau: Loại I: Khi enzyme nhận biết trình tự, di chuyển phân tử DNA đến cách khoảng 1000 - 5000 nucleotide cắt Loại II: Enzyme nhận biết trình tự cắt vị trí Loại III: Enzyme nhận biết trình tự cắt DNA vị trí cách khoảng 20 nucleotide Trong số loại RE trên, loại II quan tâm sử dụng nhiều lĩnh vực phân tử 8.2.2 Các enzyme gắn Trong nhóm người ta sử dụng phổ biến enzyme xúc tác hình thành liên kết nối đoạn DNA (DNA ligase) hay RNA (RNA ligase) + Trong ligase thường sử dụng phải kể đến: - E coli DNA ligase: Enzyme trích ly từ trực khuẩn E coli xúc tác phản ứng nối hai trình tự DNA có đầu so le - T4 DNA ligase: Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E coli, enzyme có chức với ligase trích từ E coli nói trên, đặc biệt cịn có khả nối hai trình tự DNA đầu bằng, nên ligase chuộng kỹ thuật tạo 54 chủng - T4 RNA ligase: Enzyme trích ly từ phage T4 xâm nhiễm E coli, xúc tác trình nối hai trình tự RNA liên kết phosphodiester + Q trình hóa chuyển gen chia thành bước sau: - Thu nhận gen cần chuyển: Có thể thu nhận gen trực tiếp từ gen cách lắc học hay cắt RE, tổng hợp hóa học theo trình tự nucleotide biết gen sinh tổng hợp gen từ RNAm nhờ enzyme phiên mã ngược reverse - Tạo vector tái tổ hợp: Sau có dạng khiết người ta gắn vào vector tái tổ hợp Trước tiên người ta cắt vector gen loại RE trình tự nhận biết Như hai đầu đoạn gen cần chuyển hai đầu vector bị cắt có đầu dính (trình tự DNA mạch đơn bổ sung nhau), trộn lẫn DNA cần chuyển vector đầu dính bắt cặp với Dùng ligase để hàn dính lại, người ta có vector tái tổ hợp - Chuyển vector vào tế bào nhận, làm clone hóa gen (tức nhân gen) vừa tạo nên tế bào nhận, chọn dòng tế bào chứa gen mong muốn Bước trình chuyển tải gen chuyển vector tái tổ hợp tạo thành điều kiện in vitro vào tế bào nhận thích hợp Đối với vector plasmid, trình biến nạp, hỗ trợ nhiều cách khác Đối với vector phage, có khả tự động thực tải nạp với hiệu suất cao nhiều Tuỳ đối tượng nhận gen yêu cầu cụ thể mà người ta lựa chọn áp dụng phương pháp hiệu nhất: vi khuẩn E coli, xử lý tế bào CaCl2 nhiệt độ thấp để làm cho màng tế bào trở nên dễ tiếp nhận plasmid số vi khuẩn khác nấm men phải xử lý để tạo dạng tế bào trần (protoplast) biến nạp thực 55 Hình 15 Sơ đồ chuyển tải gen nhờ plasmid Vi khuẩn (1) với plasmid (2) vịng nhẫn khép kín Plasmid mở nơi định sẵn (3) nhờ enzym cắt giới hạn Đồng thời nhờ enzym cắt gắn gen cần chuyển tải (4) tách ghép vào plasmid nơi vòng mở sẵn Plasmid tái tổ hợp gen (5) đưa trở lại tế bào vi khẩn nhận (6) có chứa plasmid với gen cần chuyền tải tạo hệ tế bào thể nhận (7) 56 ... 5000 nucleotide cắt Loại II: Enzyme nhận biết trình tự cắt vị trí Loại III: Enzyme nhận biết trình tự cắt DNA vị trí cách khoảng 20 nucleotide Trong số loại RE trên, loại II quan tâm sử dụng nhiều