CHƯƠNG 3 LÊN MEN CÁC SẢN PHẨM TỪ SINH KHỐI TẾ BÀO VI SINH VẬT

1. Lên men sản xuất axit glutamic, lysin, metionin từ vi khuẩn corynebacterium glutamicum: 1.1. Lên men sản xuất axit glutamic: Quá trình sản xuất axit glutamic bằng phương pháp lên men theo sơ đồ sau: Nguyên liệu tinh bột H2O Phối chế HCl Thủy phân Phối chế dịch lên men Nguyên liệu phụ Men giống Thanh trùng dịch lên men Chuẩn bị men giống Lên men Trao đổi ion Tách axit glutamic Hình 16. quy trình lên men sản xuất acid glutamic 1.1.1. Nguyên liệu, phối chế và thủy phân Có thể sử dụng nguyên liệu là tinh bột (sắn, ngô, gạo...) hoặc rỉ đường. Đối với tinh bột phải được thủy phân bằng axit. Để thủy phân có thể phối chế nguyên liệu theo tỉ lệ: tinh bột nướcHCl 100% = 1003500,77. Tiến hành thủy phân ở nhiệt độ 148÷150oC, áp suất = 2,5 kgcm2, thời gian 30÷34 phút. Sau khi thủy phân xong làm nguội dung dịch xuống 60 ÷ 70 oC và tiến hành trung hòa: để trung hòa lần 1 người ta dùng Na2CO3 trung hòa đến pH = 4,8 ÷ 5, tốc độ cánh khuấy 65 vòngphút. Tiếp theo cho than hoạt tính để tẩy màu sơ bộ rồi lọc tách bã than và cặn. Tiếp tục dùng Na2CO3 trung hòa lần 2 đến pH = 6,7 ÷ 7, tốc độ cánh khuấy 60 vòngphút. Dùng Na2CO3 vừa rẻ tiền vừa làm cho dịch đường không có vị đắng như NaOH. 1.1.2. Chuẩn bị môi trường lên men Ngoài dịch đường thủy phân, trong môi trường lên men phải bổ sung thêm 1 số chất khác. Ví dụ: môi trường lên men sau: Dịch đường hóa 13% Cao ngô 0,7% K2HPO4 0,15% MgSO4 0,075% Urê cho ban đầu 2%, bổ sung giữa chừng 1,2% và MnSO4 2% Trong thực tế sản xuất người ta dùng rỉ đường mía thay cho cao ngô và đây cũng là nguồn cung cấp các loại đường cho vi khuẩn sinh tổng hợp axit glutamic. Sau khi phối chế, môi trường được thanh trùng và làm nguội. Yêu cầu dịch đường lên men phải vô trùng tuyệt đối, bảo đảm độ khô 5 ÷ 6 Be. 1.1.3. Lên men dịch đường Chủng nấm men: người ta có thể sử dụng chủng vi khuẩn sau để lên men tổng hợp axit glutamic: Corynebacterium glutamicum (ngoài ra có thể sử dụng Brevibacterium flavum...) Vi khuẩn sử dụng trực tiếp đường và NH3 của môi trường lên men để sinh tổng hợp Laxit glutamic có thể diễn ra theo 2 con đường: Glucoza Hexemonophotphat Axit pyruvic Axit α – xetoglutavic Con đường amin hóa – khử Con đường chuyển amin L – axit glutamic Hình 17. Quy trình lên men sản xuất acid glutamic từ dịch đường Con đường amin hóakhử: HOOCCOCH2–CH2COOH + NADPH2 HOOCCHCH2–CH2COOH + NH2 H2O + NADP Con đường chuyển amin: HOOCCOCH2CH2COOH + RCHCOOH HOOCCHCH2CH2 COOH NH2 NH2 + RCOCOOH Phương trình tổng quát của quá trình lên men: C6H12O6 + NH3 + 32O2 C5H9NO4 + CO2 + 3H2O Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: + Độ pH của môi trường Các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp Lglutamic đều thích hợp ở môi trường trung tính hay kiềm yếu ở pH = 6,7 ÷ 8. Trong quá trình lên men độ pH giảm vì tạo ra axit glutamic và 1 số axit hữu cơ khác. Do đó phải điều chỉnh độ pH thường xuyên bằng NH4+, Nguồn NH4+ sử dụng phổ biến là: urê, nước NH3, khí NH3, NH4Cl... + Sự cung cấp O2 Lên men tổng hợp axit glutamic là quá trình hiếu khí bắt buộc. Do đó sự cung cấp oxi trong khi lên men là hết sức quan trọng. Nếu thiếu O2 thì sản phẩm chủ yếu là axit lactic, nếu thừa oxi thì sản phẩm chủ yếu là axit αxetoglutavic. Oxy được cung cấp cho dịch lên men bằng cách sục không khí vô trùng kết hợp với khuấy trộn liên tục, vận tốc cánh khuấy 150 vòngphút. + Nhiệt độ Nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men là 26÷37oC, trong thực tế lên men giai đoạn đầu ở 30÷32oC và giai đoạn cuối 36÷37oC. + Chất kích thích sinh trưởng Quá trình tổng hợp axit glutamic rất cần biotin. Biotin không chỉ là chất sinh trưởng mà còn là chất xác định thành phần và số lượng các sản phẩm lên men. Sinh khối của vi khuẩn tăng tỉ lệ với hàm lượng biotin nhưng với axit glutamic thì không hoàn toàn như vậy: lượng axit glutamic được tạo thành nhiều nhất khi trong môi trường hàm lượng biotin thấp hơn nhiều so với lượng biotin cần thiết cho sự phát triển tối đa của sinh khối. Biotin không làm thay đổi hoạt lực của các enzim tổng hợp nên axit glutamic mà ảnh hưởng đến tính thẩm thấu của màng tế bào, làm cho axit glutamic từ bên trong tế bào vi sinh vật khuyếch tán ra ngoài môi trường lên men. Nồng độ biotin thích hợp nhất cho sinh tổng hợp axit glutamic 2÷5gl. Nguồn cung cấp biotin là cao ngô, rỉ đường mía. Trong quá trình lên men nếu dùng rỉ đường mía làm nguồn cung cấp đường và biotin thì thường xảy ra hiện tượng thừa biotin sẽ không có lợi, sinh tổng hợp axit glutamic ít, nếu sục khí kém sẽ tạo ra alanin và axit lactic. Vì vậy, người ta phải bổ sung thêm penicilin để kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường giàu biotin đồng thời tăng trưởng quá trình tổng hợp axit glutamic. 1.1.4.Các phương pháp lên men Có thể lên men gián đoạn, bán liên tục và liên tục. Ở nước ta các nhà máy sản xuất bột ngọt đều dùng phương pháp gián đoạn. Men giống phải được nuôi cấy sẵn từ ống thạch nghiêng và cho đến khi đạt tỉ lệ giống theo yêu cầu. Môi trường sau khi chuẩn bị và thanh trùng xong được làm nguội đến nhiệt độ lên men và cấy men giống vào với tỉ lệ 1% để lên men. Thời gian lên men 32÷38h, nhiệt độ lên men 32÷38oC. Trong quá trình lên men phải cung cấp không khí vô trùng liên tục, bổ sung thêm urê để chỉnh pH của môi trường lên men và phải khuấy trộn. Do môi trường lên men tạo nên axit glutamic cùng với thành phần của môi trường có xu hướng làm tăng sức căng bề mặt. Vì vậy, trong quá trình lên men tạo thành nhiều bọt ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp nên phải sử dụng chất phá bọt (dầu lạc, dầu đậu tuơng, axit oleic...).

CHƯƠNG LÊN MEN CÁC SẢN PHẨM TỪ SINH KHỐI TẾ BÀO VI SINH VẬT Lên men sản xuất axit glutamic, lysin, metionin từ vi khuẩn corynebacterium glutamicum: 1.1 Lên men sản xuất axit glutamic: Quá trình sản xuất axit glutamic phương pháp lên men theo sơ đồ sau: Nguyên liệu tinh bột H2O Phối chế HCl Thủy phân Phối chế dịch lên men Men giống Chuẩn bị men giống Nguyên liệu phụ Thanh trùng dịch lên men Lên men Trao đổi ion Tách axit glutamic Hình 16 quy trình lên men sản xuất acid glutamic 1.1.1 Nguyên liệu, phối chế thủy phân Có thể sử dụng nguyên liệu tinh bột (sắn, ngô, gạo ) rỉ đường Đối với tinh bột phải thủy phân axit Để thủy phân phối chế nguyên liệu theo tỉ lệ: tinh bột /nước/HCl 100% = 100/350/0,77 Tiến hành thủy phân nhiệt độ 148÷150oC, áp suất = 2,5 kg/cm2, thời gian 30÷34 phút Sau thủy phân xong làm nguội dung dịch xuống 60 ÷ 70 oC tiến hành trung hòa: để trung hòa lần người ta dùng Na2CO3 trung hòa đến pH = 4,8 ÷ 5, tốc độ cánh khuấy 65 vịng/phút Tiếp theo cho than hoạt tính để tẩy màu sơ lọc tách bã than cặn Tiếp tục dùng Na2CO3 trung hịa lần đến pH = 6,7 ÷ 7, tốc độ cánh khuấy 60 vòng/phút Dùng Na2CO3 vừa rẻ tiền vừa làm cho dịch đường khơng có vị đắng NaOH 57 1.1.2 Chuẩn bị môi trường lên men Ngồi dịch đường thủy phân, mơi trường lên men phải bổ sung thêm số chất khác Ví dụ: mơi trường lên men sau: Dịch đường hóa 13% Cao ngô K2HPO4 0,7% 0,15% MgSO4 0,075% Urê cho ban đầu 2%, bổ sung chừng 1,2% MnSO4 2% Trong thực tế sản xuất người ta dùng rỉ đường mía thay cho cao ngơ nguồn cung cấp loại đường cho vi khuẩn sinh tổng hợp axit glutamic Sau phối chế, môi trường trùng làm nguội Yêu cầu dịch đường lên men phải vô trùng tuyệt đối, bảo đảm độ khô ÷ Be 1.1.3 Lên men dịch đường *Chủng nấm men: người ta sử dụng chủng vi khuẩn sau để lên men tổng hợp axit glutamic: Corynebacterium glutamicum (ngồi sử dụng Brevibacterium flavum ) Vi khuẩn sử dụng trực tiếp đường NH môi trường lên men để sinh tổng hợp L-axit glutamic diễn theo đường: Glucoza Hexemonophotphat Axit pyruvic Axit α – xetoglutavic Con đường amin hóa – khử Con đường chuyển amin L – axit glutamic Hình 17 Quy trình lên men sản xuất acid glutamic từ dịch đường Con đường amin hóa-khử: HOOC-CO-CH2–CH2-COOH + NADPH2 HOOC-CH-CH2–CH2-COOH + NH2 H2O + NADP 58 Con đường chuyển amin: HOOC-CO-CH2-CH2-COOH + R-CH-COOH HOOC-CH-CH2-CH2- COOH NH2 + NH2 RCO-COOH *Phương trình tổng quát trình lên men: C6H12O6 + NH3 + 3/2O2 C5H9NO4 + CO2 + 3H2O * Những yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men: + Độ pH môi trường Các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp L-glutamic thích hợp mơi trường trung tính hay kiềm yếu pH = 6,7 ÷ Trong trình lên men độ pH giảm tạo axit glutamic số axit hữu khác Do phải điều chỉnh độ pH thường xuyên NH4+, Nguồn NH4+ sử dụng phổ biến là: urê, nước NH 3, khí NH3, NH4Cl + Sự cung cấp O2 Lên men tổng hợp axit glutamic q trình hiếu khí bắt buộc Do cung cấp oxi lên men quan trọng Nếu thiếu O sản phẩm chủ yếu axit lactic, thừa oxi sản phẩm chủ yếu axit α-xetoglutavic Oxy cung cấp cho dịch lên men cách sục khơng khí vơ trùng kết hợp với khuấy trộn liên tục, vận tốc cánh khuấy 150 vịng/phút + Nhiệt độ Nhiệt độ thích hợp cho q trình lên men 26÷37 oC, thực tế lên men giai đoạn đầu 30÷32oC giai đoạn cuối 36÷37oC + Chất kích thích sinh trưởng Q trình tổng hợp axit glutamic cần biotin Biotin khơng chất sinh trưởng mà chất xác định thành phần số lượng sản phẩm lên men Sinh khối vi khuẩn tăng tỉ lệ với hàm lượng biotin với axit glutamic khơng hồn toàn vậy: lượng axit glutamic tạo thành nhiều môi trường hàm lượng biotin thấp nhiều so với lượng biotin cần thiết cho phát triển tối đa sinh khối Biotin không làm thay đổi hoạt lực enzim 59 tổng hợp nên axit glutamic mà ảnh hưởng đến tính thẩm thấu màng tế bào, làm cho axit glutamic từ bên tế bào vi sinh vật khuyếch tán ngồi mơi trường lên men Nồng độ biotin thích hợp cho sinh tổng hợp axit glutamic 2÷5g/l Nguồn cung cấp biotin cao ngơ, rỉ đường mía Trong q trình lên men dùng rỉ đường mía làm nguồn cung cấp đường biotin thường xảy tượng thừa biotin khơng có lợi, sinh tổng hợp axit glutamic ít, sục khí tạo alanin axit lactic Vì vậy, người ta phải bổ sung thêm penicilin để kìm hãm phát triển vi khuẩn môi trường giàu biotin đồng thời tăng trưởng trình tổng hợp axit glutamic 1.1.4.Các phương pháp lên men Có thể lên men gián đoạn, bán liên tục liên tục Ở nước ta nhà máy sản xuất bột dùng phương pháp gián đoạn Men giống phải nuôi cấy sẵn từ ống thạch nghiêng đạt tỉ lệ giống theo yêu cầu Môi trường sau chuẩn bị trùng xong làm nguội đến nhiệt độ lên men cấy men giống vào với tỉ lệ 1% để lên men Thời gian lên men 32÷38h, nhiệt độ lên men 32÷38oC Trong q trình lên men phải cung cấp khơng khí vô trùng liên tục, bổ sung thêm urê để chỉnh pH môi trường lên men phải khuấy trộn Do môi trường lên men tạo nên axit glutamic với thành phần mơi trường có xu hướng làm tăng sức căng bề mặt Vì vậy, trình lên men tạo thành nhiều bọt ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp nên phải sử dụng chất phá bọt (dầu lạc, dầu đậu tuơng, axit oleic ) Sau lên men xong ta chuyển dung dịch sang thiết bị trao đổi ion để tách axit glutamic 1.1.5 Tách tinh chế axit glutamic Người ta sử dụng phương pháp trao đổi ion Nhựa trao đổi ion (hay gọi rezin) hợp chất cao phân tử, không tan 60 nước, axit, bazơ dung môi hữu Trong phân tử có chứa nhóm hoạt động hóa học có khả phân li thành ion Có loại rezin: rezin trao đổi ion dương (gọi rezin dương tính) rezin trao đổi ion âm (rezin âm tính) Bao gồm rezin dương tính mạnh rezin dương tính yếu, rezin âm tính mạnh rezin âm tính yếu Để tách axit glutamic người ta sử dụng rezin dương tính mạnh, chịu nhiệt độ 100oC, mức độ trao đổi ion: Fe3+ > Ca+3 > Mg2+ > K+ > NH4+ > Axit glutamic> H+ Do vậy, dùng NaOH nhả hấp phụ axit glutamic rezin *Tách axit glutamic bao gồm công đoạn: - Phối liệu để dịch trao đổi đảm bảo lượng axit glutamic: 0,45÷0,5kg/m 3, pH ≤ 5, khơng 3,2 để tránh tự kết tinh axit glutamic tạo điểm đẳng điện - Tiến hành trao đổi: dịch lên men từ lên cột chứa đầy rezin: v = 8÷10 m/h; Q = 150÷180 l/phút; t = 150÷180 phút Dùng nước nóng 70oC cho chảy qua cột trao đổi để rửa chống kết tinh axit glutamic bề mặt nhựa - Nhả hấp phụ: dùng NaOH 4÷5%; nhiệt độ = 65oC; v = 6m/h; Q = 100 l/phút; t = 30phút * Phương trình nhả hấp phụ: RSO3NH - CH - CH2 - CH2 – COOH + Na+ RSO3Na + C5H9NO4 COOH 1.1.6 Tinh chế axit glutamic Axit glutamic sau tách lẫn tạp chất HCl, chất màu, tạp chất sắt, Vì vậy, cần phải qua tinh chế Quá trình gồm khâu sau: Tẩy rửa: Sau thu axit glutamic ngậm HCl, dùng HCl 31% để rửa nhằm hòa tan hết axit amin khác khỏi axit glutamic ngậm HCl Không nên rửa nhiều để đỡ tốn hóa chất Trung hịa: Để tách HCl khỏi axit glutamic ngậm HCl, người ta dùng Na2CO3 NaOH để trung hòa Khử sắt canxi: Do trình sản xuất dùng axit mạnh, 61 nồng độ cao nên sắt từ thiết bị hoà tan vào, canxi nước sử dụng để sản xuất rơi vào sản phẩm Do người ta phải khử sắt, canxi hỗn hợp Na 2S axit oxalic: FeCl2 + Na2S FeS + NaCl C2H2O4 + Ca2+ C2O4Ca + 2H+ FeS C2O4Ca kết tủa tách khỏi dung dịch lọc li tâm Tẩy màu: Để bảo đảm tốc độ kết tinh natriglutamat chất lượng sản phẩm, trước kết tinh cần tẩy màu dung dịch than hoạt tính nhiệt độ thích hợp (60oC), sau lọc ép tách bã than 1.2 Kỹ thuật sản xuất acid L – Lyzin methionin 1.2.1 Chủng vi sinh vật 62 Chủng sản xuất thể đột biến cần homoxerin Corinebacterium glutamicum (hay gọi Micrococus glutamicus) Dưới điều kiện lên men thích hợp chủng sản xuất tới 50 g lyzin/ lít mơi trường Ngun liệu thường dùng glucoza hay mật rỉ với nồng độ 150g/lit 1.2.2 Phương trình lên men tổng quát 100C6H12O6 + 219O2 + 86NH3 35C6H14N2O2 + 16C8H13O4 + 262CO2 1.2.3.Cơ chế Glucoza Pyruvat Oxalaxetat Aspactat (1) β– Aspactyl – photphat Aspactat – β – Semialdehyt (2) Lyzin (3) Homoxerin Treonin methionin Izoleuxin Hình 18 Sơ đồ chế tổng hợp L – Lyzin Corinebacterium glutamicum (1) – enzym Aspactokinaza; (2) – Enzym homoxerindehydrogenaza; (3) – Enzym dihydropicolinat – syntetaza Lyzin axit amin thuộc họ aspactat tổng hợp qua đường phân nhánh mà qua homoxerin, methionin, treonin, izoleuxin đựoc tạo thành Những đường chấm biểu diễn ức chế sản phẩm cuối Ở chủng hoang dại lyzin treonin gây ức chế phối hợp aspactokinaza (1) Do khuyết homoxerindehydrogenaza (3) mà khơng có tạo thành treonin Dihydropicolinat – Syntetaza (2) không mẫn cảm dị lập thể nên ức chế sản phẩm cuối bị triệt tiêu có tổng hợp thừa lyzin (50g/lit) 63 1.2.4 Lên men Nguồn hydrocacbon thích hợp cho tổng hợp lyzin glucoza, fructoza, maltoza saccharoza Các đường lactoza, rafinoza, pentoza chủng sinh lyzin khơng đồng hóa Cho nên người ta thường sử dụng loại nguyên liệu rỉ đường, dịch thủy phân từ tinh bột (ngô, sắn) để làm môi trường sản xuất lyzin Nồng độ đường môi trường lên men khoảng 10-12% Trong trình lên men, nhằm để tăng hiệu suất thu hồi lyzin có thê bổ sung thêm đường để nâng cao nồng độ đường lên 25% (nhưng thận trọng có hiệu suất sinh lyzin khơng tăng mà ảnh hưởng xấu đến vi sinh vật làm tăng áp suất thẩm thấu môi trường) Nguồn nitơ dùng ure, NH3 muối amon Tỷ lệ C:N đóng vai trị quan trọng, ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp lyzin Thường bổ sung muối amon với hàm lượng 2% Ngồi cịn phải bổ sung vào môi trường chất cung cấp nguồn photpho KH2PO4 K2HPO4 (đảm bảo lượng photpho đạt 0,008 -0,02mg/lít, nơng độ lên đến 1,6 – mg/lit trình tổng hợp lyzin bị ngừng) Do khơng nên dùng muối amon để làm nguồn cung cấp photpho nitơ Phải bổ sung muối có chứa nguyên tố Mg, Fe, Cu, Mn (thường bổ sung muối MgSO4 – 0,03%, Fe, Cu, Mn có cao ngơ, rỉ đường) Các chất kích thích sinh trưởng: + Biotin: cần khoảng 8-15 mg/lít, q (1 – mg/lít) sản phẩm chủ yếu axit glutamic Biotin B1 có cao ngơ, đặc biệt rỉ đường mía có nhiều biotin + Thiamin (B1): Nếu khơng có tạo thành alanin + Treonin: Khơng có kìm hãm phát triển vi sinh vật dư dẫn tới ức chế sản phẩm cuối Hàm lượng thích hợp khoảng 200-800 mg/lít + Methionin: có ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển vi sinh vật Hàm lượng thích hợp 150 – 250 mg/lít Có thể dùng homoxerin để thay cho treonin methionin 64 Bảo đảm môi trường phải có pH = – 7,6 phải trùng Lượng giống cho vào để lên men – 10% Nhiệt độ lên men 30 – 32 oC, cung cấp oxy 24g/lit.h trình lên men dùng ure nước NH3 để điều chỉnh pH Tổng thời gian lên men 50-72h 1.2.5 Thu hồi sản phẩm Tùy vào dạng chế phẩm (dịch nuôi cấy, dịch đặc, bột tinh thể) mà q trình thu nhận sản phẩm có khác - dịch ni cấy chế phẩm thu sau lên men dùng trực tiếp pha vào thức ăn gia súc - Dịch đặc: Để tránh hư hỏng dịch sau lên men axit hóa HCl đến pH = bổ sung dung dịch NaHSO3 25% (tỷ lệ 0,4% so với dịch lên men) đem cô chân không đạt nồng độ chất khô 35 – 40% Chế phẩm dùng chăn ni - Bột: Từ dịch đặc bổ sung thêm chất độn (bột xương, cám…) sấy khô nghiền nhỏ Hoặc dịch cô đặc đem sấy phun để thu chế phẩm dạng bột - Để thu nhận tinh thể lyzin phải sử dụng nhiều phương pháp tiến hành theo nhiều bước Hỗn hợp lên men Lọc (ly tâm) Sinh khối Dung dịch Nhả hấp phụ trao đổi ion Dùng dung dịch NH4OH -3,5% để nhả hấp phụ Dùng HCl để axit hóa đến pH = đặc đến đạt nồng độ 30 -50% sau làm lạnh đến 10 – 12 oC để trợ tinh Để có chế phẩm tinh khiết đem chế phẩm kết tinh lần kết tinh lại nhiều lần (hòa tan cồn) 1.3.Kỹ thuật sản xuất acid L – Triptophan Nhờ vào tổng hợp vi sinh vật, L – triptophan thu nhận hai đường: chuyển tiền chất triptophan thành triptophan nhờ giúp đỡ 65 hệ enzym vi sinh vật; thu nhận triptophan nhờ đột biến thiếu tirozin fenylalanin chủng vi sinh vật 1.3.1.Phương pháp chuyển tiền chất 1.3.1.1 Tiền chất Nhờ vi sinh vật thu nhận triptophan từ tiền chất khác Hiệu suất thu hồi sản phẩm từ tiền chất khác không giống Một số tiền chất hay sử dụng: Axit antranilic Hiệu suất thu hồi 98,8% Indol 87,2% Indol + Cerin (1:2) 92,5% Indol + Cestein (1:2) 89,5% Indol + Alanin (1:4) 87,0% 1.3.1.2.Chủng vi sinh vật Để chuyển tiền chất người ta sử dụng nhiều chủng vi sinh vật khác Riêng axit antranilic người ta hay dùng nấm men candica utilis hansunella 1.3.1.3 Cơ chế Khi sử dụng axit antranilic làm tiền chất chế trình sau: Hình 19 Cơ chế chuyển tiền chất antranilic thành triptophan 1.3.1.4 Kỹ thuật lên men 66 Lên men sản xuất thạch dừa (Nata decoco) từ vi khuẩn Acetobacter xylinum Thạch dừa (Nata de coco) loại thức ăn phổ biến, có nguồn gốc từ Philippin, tạo từ lên men nước dừa vi khuẩn Acetobacter xylinum Đây số loại thực phẩm thương mại ứng dụng từ cellulose vi khuẩn Sản phẩm thạch dừa ăn tráng miệng dai, suốt ngon Hơn nữa, người Nhật cho thạch dừa giúp thể người chống lại bệnh ung thư ruột kết Trong thạch dừa có hàm lượng chất xơ cao tốt cho hệ thống tiêu hố Thạch dừa cung cấp lượng không chứa cholesterol 5.1 Cấu trúc thạch dừa - Bản chất thạch dừa màng nhày có cấu trúc hemicellulose Do thạch dừa có chất polysaccharide ngoại bào nên có khả ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác Cho đến nay, việc ứng dụng thạch dừa dừng lại nghiên cứu chế biến thành sản phẩm kẹo, jelly, sản phẩm giải khát - Hàm ẩm thạch dừa: Theo kết nghiên cứu khảo sát cấu trúc thạch dừa thầy cô Phan Tiến Mỹ Quang, Đống Thị Anh Đào, Nguyễn Ánh Tuyết 113 mơn cơng nghệ hố học dầu khí trường Đại Học Bách Khoa TPHCM, thạch dừa mạng polymer sinh học, có khả giữ nước lớn Miếng thạch dừa sau sấy 900C mỏng tờ giấy, bề mặt láng bóng dai Kết xác định hàm ẩm thạch dừa 99%, thể rõ chất háo nước thạch dừa ( chuỗi polymer mạng thạch dừa chứa nhóm –OH nên dễ dàng tạo liên kết hidro với nước) - Cấu trúc mạng polysaccharide thạch dừa: Thạch dừa có cấu trúc mạng polysaccharide, chúng xếp không theo trật tự, không theo quy luật - Chúng đan xen vào chằng chịt theo phía Do q trình lên men, vi khuẩn Acetobacter xylinum chuyển động hỗn loạn khơng theo quy luật Đó ngun nhân tạo nên tính dai phía miếng thạch Bên cạnh đó, mạng ln ln ngậm lượng nước đáng kể (99%) - Thành phần monosaccharide thạch dừa socboza nằm dạng Lsocboza, thường chứa vi khuẩn lên men dịch trái Công thức cấu tạo L-socboza : CH2OH-CO-HOCH-HCOH-HOCH-CH2OH 5.2 Vi sinh vật sản xuất thạch dừa Giống vi sinh vật dùng sản xuất thạch dừa Acetobacter xylinum Giống Acetobacter xylinum a Đặc điểm - Chủng Acetobacter xylinum có nguồn từ Philippin Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn acetic Theo hệ thống phân loại nhà khoa học - Bergey Acetobacter xylinum thuộc: lớp Schizommycetes, Pseudomonadales, họ Pseudomonadieae - A.xylinum loại vi khuẩn hình que dài khoảng 2μm, gram âm, đứng riêng lẽ xếp thành chuỗi, có khả di động nhờ tiên mao - Có khả tạo váng hemicellulose dày, bắt màu với thuốc nhuộm Iod H2SO4 114 - A.xylinum sinh trưởng điều kiện pH < 5, nhiệt độ khoảng 28-32 oC tích luỹ 4.5% acid acetic Hình3.22 Vi khuẩn A xylinum - Acid acetic sản phẩm sinh trình hoạt động vi khuẩn, chúng vượt mức cho phép, chúng quay ngược trở lại làm ức chế hoạt động vi khuẩn b Sinh lý, sinh hoá - A.xylinum hấp thụ đường glucose từ môi trường nuôi cấy Trong tế bào vi khuẩn, glucose kết hợp với acid béo tạo thành tiền chất nằm màng tế bào Kế ngồi tế bào với enzyme Enzyme polyme hoá glucose thành cellulose - A.xylinum tạo nên lớp cellulose dày môi trường nuôi cấy nước dừa có bổ sung chất dinh dưỡng cần thiết Cellulose polisaccharide không tan nước mà tan mơi trường kiềm Đó thành phần màng tế bào thực vật - Polysaccharide vi sinh vật thường tích tụ đáng kể mơi trường lỏng Vi sinh vật có khả tổng hợp oligo polysaccharide Lượng oligo polysaccharide nội bào đạt tới 60% trọng lượng khơ tế bào - Tất oligo polysaccharide tổng hợp cách kéo dài chuỗi saccharide có trước nhờ vào việc thêm vào đơn vị monosaccharide Đơn vị monosaccharide thêm vào tham gia phản ứng dạng nucleotide, monosaccharide hoạt hoá thường dẫn xuất uridin diphosphat - (UDP-X) với nucleotide, purin pirimidin khác - Sự tổng hợp diễn theo phản ứng sau: …X-X-X-X- + UDP-X = …X-X-X-X-X + UDP n nhánh - (n+1) nhánh Cơ chế trình sinh tổng hợp diễn theo tổng hợp loại polysaccharide phân nhánh chưa rõ 115 - Người ta cho thứ tự gốc đường tính đặc trưng tham gia chúng vào chuỗi polysaccharide phụ thuộc vào enzyme transferase - Acetobacter xylinum sống thích hợp nhiệt độ 28-32oC Ở nhiệt độ trình hình thành sản phẩm có thạch dừa tốt 5.3 Bản chất sinh hố q trình  Q trình hình thành cellulose nhà bác học Muhlethaler sử dụng kính hiển vi điện tử để nghiên cứu cho rằng: Đầu tiên tế bào vi khuẩn tiết chất nhầy bao bọc xung quanh chúng, tiếp hình thành sợi cellulose polimer hố từ đơn phân glucose vị trí -1,6 tác dụng enzym có bao nhầy Các sợi ngày dày lên kết nối với tạo thành lớp cellulose bên bao nhầy Lớp cellulose sau khỏi tế bào hồn tồn  Dung dịch mơi trường ban đầu có dạng huyền phù mịn, chuyển sang dạng rời rạc, sau kết lại thành khối lớn dạng gel chứa tế bào vi khuẩn Bộ khung gel mạng lưới cellulose với thành phần chủ yếu nước Nó hình thành mức tối đa 30 phút sau có tiếp xúc vi khuẩn Acetobacterium xylium với glucose oxy 5.4 Nguyên liệu sản xuất thạch dừa 5.4.1 Nguyên liệu - Nước dừa: trung bình trái dừa có chứa 300ml nước, chiếm 25% trọng lượng trái dừa Nước dừa loại nước giải khát phổ biến chứa nhiều chất dinh dưỡng như: đường, protein, lipid, vitamin, khoáng với nồng độ loãng Bảng : Thành phần hoá học nước dừa STT Thành phần Chất khô Đường tổng số Tro K Na Ca Mg Fe Cu Khối lượng (g) 4.71 2.08 0.02 3.12 1.5 2.9 3.0 0.01 0.04 116 10 11 12 13 14 P S Protein Dầu béo Tỉ trọng 3.7 3.4 0.55 0.74 1.02 Nguồn : Adapted from Lapuz et al (1967) and Ramos (1977) Bảng : Các vitamin có nước dừa STT Vitamin Acid ascorbic Penthothennic Acid nicotinic Acid folic Riboflavin Hàm lượng (g/l) 0.052 0.064 0.03 0.00001 Nguồn : Adapted from Lapuz et al (1967) and Ramos (1977) Bảng : Các acid amin có nước dừa Hàm lượng STT Acid amin (% khối lượng/ amin tổng số) 14.5 Acid glutamic Arginine 12.75 Leucine 4.18 Lysine 4.51 Proline 4.12 Aspartic 3.6 Tyrosine 2.83 Alamine 2.41 Histidine 2.05 10 Phenyl alanin 1.23 11 Senine 0.91 12 Cystein 1.17 Nguồn : Adapted from Lapuz et al (1967) and Ramos (1977) Ở vùng có nhiều dừa sản xuất thạch dừa từ nguồn nguyên liệu nước dừa già có hiệu kinh tế cao vừa tốt cho q trình lên men lại vừa giải vấn đề môi trường (nước dừa già phế thải từ nhà máy sản xuất cơm dừa nạo sấy) Tuy nhiên, số vùng khơng có dừa vấn đề ngun 117 liệu lại điểm hạn chế dẫn đến khó ứng dụng sản xuất quy mơ cơng nghiệp Vì vậy, vấn đề đặt cần phải giải môi trường lên men phải xuất phát từ nguồn nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền, có số lượng lớn, dễ vận chuyển mang quy mô công nghiệp, không mang tính cục bộ, địa phương, tận dụng phế phụ liệu từ trình thực phẩm khác Xuất phát từ yêu cầu đó, nhóm nghiên cứu Vương Thị Việt Hoa, Trương Nguyễn Quỳnh Hương, khoa công nghệ thực phẩm trường đại học Nông Lâm TPHCM tiến hành nghiên cứu, đa dạng hố mơi trường sản xuất thạch dừa từ A.xylinum Kết nghiên cứu cho thấy, ta thay nước dừa già nước dứa nước cốt dừa với tỉ lệ pha lỗng thích hợp - Nguồn ngun liệu khơng thể thiếu lên men tạo thạch dừa dung dịch chứa vi khuẩn A xylinum *Thành phần môi trường sản xuất - Môi trường 1: môi trường nước dừa già, - môi trường : môi trường nước cốt dừa Acid acetic (NH4)2SO4 ml – 8g SA (NH4)2PO4 Saccharose Nước dừa già Tỉ lệ cơm dừa/nước (g/ml) SA (%) DAP Saccharose (%) 1/10 0.6 0.6 2g 20g 1000 ml - Môi trường : môi trường nước ép dứa - Môi trường 4: môi trường nước ép dứa Tỉ lệ dứa/nước (g/ml) SA (%) DAP (%) Saccharose (%) 1/10 0.8 0.6 Tỉ lệ dứa/nước (g/ml) SA (%) DAP (%) Saccharose (%) 1/30 0.8 0.6 118 3.5.4.2 Quy trình sản xuất thạch dừa Nguye ân liệu Lọc Nước đườn g Trộn DAP, SA Đun sôi 10 – 45’ Để nguội Giống Nhân giống Cho acid acetic Cấy giống Lên men 28 -320C – 15 ngày Thạch dừa thơ 119 Hình 3.23 sơ đồ quy trình sản xuất thạch dừa Thuyết minh quy trình : Lên men Đổ môi trường vào dụng cụ, cấy giống theo tỷ lệ 1:10 Đậy thau, chậu vải mỏng giấy báo Giữ nhiệt độ phòng 28-32 oC vòng 9-15 ngày Trong thời gian tránh khuấy động môi trường để tránh làm cho lớp thạch hình thành bị tách lớp Chuẩn bị môi trường  Nước dừa già thu nhận nhà máy sản xuất cơm dừa nạo sấy Thành phần gồm: đường, protein, dầu béo, khống ,vitamin…hồ tan số tạp chất khác Có thể sử dụng nguyên liệu thay trình bày phần  Dùng vải lọc để loại bỏ tạp chất.Vải lọc cố định rổ lọc Dịch nước dừa sau lọc thu vào thùng chứa Cặn vải lọc tách  Bổ sung dinh dưỡng: SA, DAP, đường glucose nguồn cung cấp Nitơ, khống… tạo mơi trường tối ưu cho q trình sinh tổng hợp sản phẩm  Mơi trường sau bổ sung dinh dưỡng trùng cách đun sôi khoảng 30-45 phút để tiêu diệt vi sinh vật có mơi trường Sau làm nguội  Dùng acid acetic 40% chỉnh pH = - 3,5, chỉnh nhiệt độ đến 28-32C (pH, nhiệt độ thích hợp cho q trình lên men) Chuẩn bị giống để sản xuất:  Giống Acetobacter xylinum nuôi môi trường thạch nghiêng, thành phần gồm: SA 8g DAP 2g Saccharose 20g Agar 20g Nước dừa 1000ml  Các ống nghiệm chứa môi trường trùng 121C 20 phút  Cấy giống , để tủ ấm 3- ngày 120  Tiến hành nhân giống, qua cấp hoăc hai cấp nhiều tuỳ theo qui mô sản xuất Thành phần mơi trường nhân giống khơng có Agar gọi môi trường dịch thể Môi trường khử trùng 100C 30 Để nguội đến 30C, cấy giống theo tỉ lệ 10% Lắc hay sục khí thời gian 18- 20 Sau giống đưa vào sản xuất 3.5.4.3 Quy trình chế biến thạch dừa Sau khoảng 9-15 phút dùng vợt đề vớt khối cellulose khỏi dịch lên men Sau rửa khối cellulose nước lạnh Thạch dừa thô Cắt nhỏ (1x1.5x2cm) Ngâm đường 70-80% Ngâm đường 20% Sên lửa nhẹ Ngâm dd Na2CO3 3-5% 15’ Để nguội Xả nước lạnh Bổ sung hương trái Đun sôi 10 – 15’ Vô keo, dán nhãn xuất xưởng Để Bổ sung nước siro, hương trái Vô hộp Thanh trùng Mứt thạch dừa Dán nhãn xuất xưởng Cocktail thạch dừa 121 Hình 3.24 Quy trình chế biến thạch dừa Vì thạch dừa thô khối hemicellulose nên không mùi, khơng vị Chính cần phải chế biến để phù hợp với vị người tiêu dùng Quy trình chế biến thạch dừa trình bày sơ đồ phía  Dùng máy cắt để cắt khối cellulose tạo miếng nhỏ, đặn  Ngâm sản phẩm dung dịch Na2CO3 3-5% 15 phút để trung hồ acid acetic cịn sót bên thạch Sau xả lại nước lạnh  Đun sơi để làm sản phẩm tao độ dai cách bổ sung chất tạo  Ngâm đường tạo đô tăng độ cho sản phẩm  Bổ sung màu, mùi để hoàn thiện giá trị cảm quan dai *Bảo quản thạch dừa - Ức chế vi khuẩn nấm men cách sử dụng nồng độ đường cao Với nồng độ đường khoảng 70-80% tạo áp suất thẩm thấu cao, hồn tồn ức chế hoạt động vi khuẩn nấm men Phương pháp bảo quản áp dụng sản phẩm mứt thạch dừa Sử dụng muối natribenzoate : Với nồng độ muối sử dụng khoảng 0.05 – 0.1%, sản phẩm thạch dừa giữ phẩm chất ban đầu sau tháng Những biến động trình lên men  Sự thay đổi pH trình lên men : điều kiện quan trọng để có hoạt động sống vi sinh vật độ acid môi trường Acetobacter xylinum lịai chịu acid nên mơi trường điều chỉnh pH 3.5-4 acid acetic nồng độ 40% Nhận thấy ngày đầu pH tăng dần từ 3.78 đến 3.91 Sau giảm dần đến ngày thứ 10 đạt giá trị 3.35 Các trình đồng hóa dị hóa vi sinh vật có liên quan đến việc tạo thành acid hữu sản phẩm trung gian sản phẩm cuối trao đổi chất Nếu nguồn C khơng vi khuẩn sử dụng hết có tích lũy acid hữu tương tứng dịch ni cấy Sự tích lũy tỷ lệ acid hữu phụ thuộc vào chủng lồi vi khuẩn , vào thành phần mơi trường, vào thơng khí nhân tố khác Đối với Acetobacter xylinum việc 122 lên men liền với hình thành acid dicacboxylic khơng bay (acid malic.fumaric,sucxinic), keto acid ( acid oxaloacetic , pyruvic) sản phẩm trung gian acid mono carboxylic bay (acid propionic, acetic, acid formic) sản phẩm cuối 5.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men 5.5.1 Ảnh hưởng (NH4)2SO4 Tỉ lệ thành phần dinh dưỡng mơi trường ni cấy có ý nghĩa định sinh trưởng phát triển A xylinum Nhân tố (NH4)2SO4 nhân tố ảnh hưởng lớn đến phát triểncủa A xylinum (NH4)2SO4 nhân tố quan trọng cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triển Để xác định ảnh hưởng (NH4)2SO4 tới trình tạo màng nhầy, Đặng Thị Kim Dung - trường ĐH Sư phạm HN tiến hành sau: trước tiên cấy hai chủng vi khuẩn A.xylinum.sp T7 A xylinum A24 môi trường thay đổi nồng độ (NH4)2SO4 nồng độ khác nhau: 0,25; 0,2; 0,15; 0,1; 0,08; 0,05; 0,03; 0,01 (%) Môi trường nuôi cấy tĩnh sau 20 ngày đem xác định độ dày màng nhày giá trị nồng độ (NH 4)2SO4 khác Kết kiểm tra cho thấy độ dày màng tăng từ ngày thứ trở đạt giá trị cực đại ngày thứ 20 Ở giá trị nồng độ (NH4)2SO4 0.08% hàm lượng hemicellulose tạo cao Kết giải thích sau: Mỗi lồi vi sinh vật có ngưỡng hấp thụ thích hợp chất dinh dưỡng khác khác (NH4)2SO4 nguồn cung cấp nito cần thiết cho sinh trưởng phát triển vi khuẩn A xylinum Nồng độ (NH4)2SO4 0.25, 0.2, 0.15, 0.1 % cao yêu cầu Acertobacter xylinum khơng hấp thụ hết lượng sulphate amone, lượng cịn lại mơi trường ức chế phát triển tế bào vi khuẩn Vì vậy, lượng hemicellulose tạo thấp so với môi trường có nồng độ (NH4)2SO4 0.08% Cịn nồng độ sulphate amone 123 0,05; 0,03; 0,01% thấp so với yêu cầu cho phát triển vi khuẩn nên lượng hemicellulose tạo thành thấp Mặt khác, nitơ cịn có mặt nhiều thành phần cấu tạo acid nucleic, phospholipid, số coenzyme quan trọng ATP, ADP, NADP, FAD số vitamin tham gia vào trình tạo thành hemicellulose Nếu hàm lượng chất cao hay thấp ảnh hưởng đến tính chất lý hố mơi trường, ảnh hưởng tới trình tạo thành hemicellulose vi khuản acertobacter xylinum, độ dày màng giảm so với mức 0.08% 5.5.2 Ảnh hưởng (NH4)2PO4 (NH4)2PO4 vừa nguồn cung cấp nitơ, vừa nguồn cung cấp phospho cho trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn acertobacter xylinum Sự ảnh hưởng (NH4)2PO4 tương tự ảnh hưởng (NH4)2SO4 5.5.3 Ảnh hưởng loại đường Trạng thái thạch dừa tạo thành chịu ảnh hưởng nhiều đường Acetobacter xylinum sử dụng glucose , sucrose , lactose , maltose , dextrin galactose ứng với lọai đường khác mà ta sử dụng cho thạch dừa có trạng thái khác Bảng Ảnh hưởng loại đường khác đến hình thành thạch dừa nước dừa pH = 5.0 Khối lượng thạch Đường Độ dày – Trạng thái dừa sau 15 ngày lên men (g) Glucose Sucrose Lactose Maltose Dextrin Galactose Không đường bổ sung Dày – 198,50 Dày – 193,79 Màng mỏng – mềm 84,50 Màng mỏng – mềm 86,35 Màng mỏng – mềm 81,20 Màng mỏng – mềm 50,45 Màng mỏng – mềm 50,00 Nguồn : Adapted from Lapuz et al (1967) and Ramos (1977) 124 Dựa vào bảng nghiên cứu ta thấy sử dụng glucose cho trình lên men cho khối lượng thạch dừa cao trạng thái thạch dừa thu tốt Tuy nhiên người ta làm thí nghiệm sử dụng sucrose nồng độ khác cho trình lên men người ta thấy sucrose nồng độ 10% cho khối lượng thạch dừa cao nhất.Trong thực tế sản xuất người ta thường sử dụng sucrose giá thành rẻ cho suất cao Bảng 7: Ảnh hưởng nồng độ sucrose đến trạng thái cấu trúc thạch dừa Nồng độ sucrose (%) Độ dày – Trạng thái Khối lượng thạch dừa sau 15 ngày lên men (g) 112,08 2.0 Trung bình – 4.0 Trung bình – 146,45 6.0 Trung bình – 165,76 8.0 Trung bình – 187,54 10.0 Dày – 198,58 12.0 Trung bình – 188,78 14.0 Trung bình – 185,65 Màng mỏng 95,88 Không bổ sung đường Nguồn : Adapted from Lapuz et al (1967) and Ramos (1977) 5.5.4 Ảnh hưởng nồng độ chất khô Nồng độ chất khơ thích hợp cho q trình hình thành thạch dừa 11,5-12% Nếu nồng độ chất khô cao , vi sinh vật khơng sử dụng hết gây lãng phí đồng thời gây ức chế họat động vi sinh vật Nếu nồng độ chất khô thấp không đủ để cung cấp cho trình sống VSV 5.5.5 Ảnh hưởng nhiệt độ Ngoài yếu tố nhiệt độ lên men ảnh hưởng đáng kể đến hình thành sản phẩm Bảng 8: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành thạch dừa pH = 5.0 Khối lượng trung Nhiệt độ (oC) Trạng thái thạch dừa bình sau 15 ngày lên men (g) 125 15 Không phát triền 0.00 20 Màng mỏng – mềm 87.50 25 Trung bình – 128.82 28-32 Dày – 195.02 35 Đặc sệt , no nata 0.00 40 Đặc sệt , no nata 0.00 Nguồn : Adapted from Lapuz et al (1967) and Ramos (1977) Như nhiệt độ tối ưu thích hợp cho trình lên men tạo thạch dừa 28 – 320C 5.5.6 Ảnh hưởng pH Độ pH ảnh hưởng nhiều đến suất hình thành sản phẩm Bảng 9: Ảnh hưởng pH đến hình thành thạch dừa Khối lượng thạch dừa pH Độ dày – Trạng thái 2.5 No nata formation 3.0 No nata formation _ 3.5 Màng mỏng – mềm 92.60 4.0 Trung bình – mềm 148.52 4.5 Dày – 188.32 5.0 Dày – 193.89 5.5 Dày – 184.20 6.0 Dày – 173.70 6.5 Trung bình – 163.85 7.0 Màng mỏng – mềm 86.90 7.5 No nata formation _ 8.0 No nata formation _ sau 15 ngày lên men (g) _ Nguồn : Adapted from Lapuz et al (1967) and Ramos (1977) Trong khoảng pH 4,5 đến lượng sinh khối BC tạo tương đối cao Kiểm tra đánh giá chất lượng sản phẩm 9.1 Kiểm tra sản phẩm thô  Trong điều kiện tối ưu pH = 5,0 , t = 28-32 oC , lít nước bổ sung 100g đường , 5g (NH4)2HPO4 , ml acid acetic băng thu 483g thạch dừa thô 126  Độ ẩm thạch dừa thu vào khoảng 96-98,6% Như yêu cầu thạch dừa sau lên men phải đạt :  Cấu trúc : độ dày (1.5-3 cm), dai ,  Màu sắc : trắng ngà 9.2 Chất lượng dinh dưỡng thạch dừa (trong 100g thạch dừa) Calo : 146; Lipid : 0,2%; Carbonhydrate : 36,1%; Ca : 12mg; P : 2mg Fe :0,5 mg Trong 100g thạch dừa 127 ... bị trùng xong làm nguội đến nhiệt độ lên men cấy men giống vào với tỉ lệ 1% để lên men Thời gian lên men 32 ? ?38 h, nhiệt độ lên men 32 ? ?38 oC Trong q trình lên men phải cung cấp khơng khí vơ trùng... Sấy (tốt dùng phương pháp sấy phun) Sản xuất vitamin phương pháp lên men vi sinh vật 3. 1 Lên men sản xuất vitamin B12 Vitamin B12 vitamin nhóm B mà thể cần với khối lượng ít, khoảng vài microgam... đồng thời nhiều nguồn cacbon khác 2 .3. Vi sinh vật dùng sản xuất protein đơn bào 2 .3. 1 Nấm men Trong đối tượng vi sinh vật sử dụng sản xuất protein đơn bào nấm men nghiên cứu sử dụng sớm đến sử