BÀI TẬP NHÓM MÔN CÔNG NGHỆ ENZYME

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - - BÀI BÁO CÁO NHĨM 17 MƠN CƠNG NGHỆ ENZYME GVHD:Ts.Nguyễn Minh Xn Hồng Thành viên nhóm: Nguyễn Thị Chúc An Phạm Thị Thúy Dung Cao Thị Diễm Mi Lê Thị Thu Sương Nguyễn Thị Thanh Trần Phương Thảo Ngô Diễm Thoa Trương Trần Tiến MỤC LỤC 16125090 16125004 16125309 16125426 16125444 16125456 16125462 16125502 Bài 1: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME 1 Tính đặc hiệu Enzyme Ảnh hưởng hiệt độ đến hoạt tính enzyme Ảnh hưởng PH đến hoạt tính enzyme 4 Khảo sát ảnh hưởng chất hoạt hóa ức chế đến hoạt tính enzyme: BÀI 2: ENZYME AMYLASE Xác định hoạt lực Enzyme Amylase phương pháp Heinkel .9 BÀI 3: ENZYME PROTEASE 10 Xác định hoạt tính pepsin thô phương pháp Anson cải tiến 10 BÀI 4: ENZYME PECTINASE 13 1.Phương pháp so màu 13 Ứng dụng pectinase làm nước ép trái .14 Thực tập môn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17 Bài 1: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ NGOẠI CẢNH ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME Tính đặc hiệu Enzyme  Nguyên tắc: Tính đặc hiệu enzyme thể điểm enzyme tác dụng lên chất định Chẳng hạn amylase thủy phân polysaccharide mà không tác dụng lên disaccharide Saccharose không cho phản ứng với Fehling phân tử có nhóm cetose aldehid tự Phản ứng dương tính saccharose thủy phân thành glucose fructose  Cách tiến hành - Cho vào ống nghiệm ống 0.5ml dung dịch amylase Thêm 1ml dung dịch tinh bột 1% vào ống thứ 1ml dung dịch saccharose 1% vào ống thứ hai Đặt hai ống bình ổn nhiệt 10-20 phút - Trộn 1ml dung dịch Fehling A 1ml dung dịch Fehling B với nhau, cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch Fehling vừa trộn đem đun phút nhận xét kết Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17 Hình 1.1  Kết quả: Ống nghiệm có tinh bột chuyển thành màu đỏ gạch, ống nghiệm cịn lại khơng có tượng  Nhận xét giải thích: Kết thí nghiệm cho thấy tính đặc hiệu enzyme amylase thủy phân tinh bột thành glucose phản ứng với Fehling tạo màu đỏ gạch mà không tủy phân disaccharide saccharose Ảnh hưởng hiệt độ đến hoạt tính enzyme  Nguyên tắc: Vận tốc phản ứng enzyme thường tăng khoảng hai lần nhiệt độ tăng khoảng 10°C Ở nhiệt độ thấp, ví dụ khoảng 0°C, vận tốc xúc tác men thấp, coi không đáng kể, nhiệt độ này, enzyme bảo quản tốt Ở 40-50°C, enzyme hoạt động mạnh nhất, cao 50°, enzyme bắt đầu biến tính, vận tốc xúc tác giảm dần Đến 60-80°C, enzyme khả hoạt động Ở 100°C, enzyme bắt đầu tác dụng  Cách tiến hành: Lấy ống nghiệm cho vào:  Ống 1: 1ml dung dịch hồ tinh bột 1% Thực tập môn Công nghệ Enzyme Nhóm 17  Ống 2: 0,5 ml dung dịch amylase pha loãng 0,5 ml dung dịch đệm pH Đặt ống vào bình ổn nhiệt 30°C vòng phút Tương tự làm với 60°C 90°C Sau trộn ống vào tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme dưới ảnh hưởng nhiệt độ cách xác định thời gian thủy giải amylase Phương pháp xác định thời gian thủy giải amylase: Cứ sau phút, nhỏ giọt dung dịch lugol ( iod) lên mặt kiếng, sau nhỏ vị giọt hổn hợp dung dịch Khi không thấy màu xanh xuất lúc tinh bột bị thủy phân hoàn toàn amylase  Kết quả:  Ống 30°C: Thời gian không xuất màu xanh phút  Ống 60°C: Thời gian không xuất màu xanh phút  Ống 90°C: không màu xanh  Đồ thị: 10 9 6 4 30 60 90  Nhận xét giải thích:  Nhận xét: Với ống 30°C thời gian thủy phân tinh bột amylase nhanh nhất, ống 60°C chậm hơn, ống 90°C amylase thủy phân tinh bột Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17  Giải thích: Vì nhiệt độ ảnh hưởng đến vận tốc khả xúc tác enzyme Ở 30°C nhiệt độ enzyme có vận tốc xúc tác tương đối cao nên nhanh chóng thủy phân hết tinh bột phút, Ở nhiệt độ 60°C enzyme bắt đầu biến tính biến tính vận tốc xúc tác chậm lại, 90°C với nhiệt độ enzyme bị biến tính hồn tồn khơng thể thủy phân tinh bột màu xanh không biến Ảnh hưởng PH đến hoạt tính enzyme  Nguyên tắc : -Hoạt tính enzyme thể vùng PH tương đối hẹp PH tối ưu PH tối ưu số enzyme pepsin 1.2-2.5; catalase 7.0 ; trysin 8.09.0; … -Mức độ ion hóa enzyme phụ thuộc vào mơi trường Enzyme có hoạt tính cao dạng tích điện dương hay tích điện âm trạng thái đẳng điện  Cách tiến hành:  Lấy ống nghiệm , cho vào : - Ống : ml dung dịch hồ tinh bột 1% ml dung dịch đệm PH - Ống : ml dung dịch hồ tinh bột 1% ml dung dịch đệm PH - Ống 3: ml dung dịch hồ tinh bột 1% ml dung dịch đệm PH  Pha loãng enzyme amylase 10 lần : hút ml enzyme amylase sau cho vào ml nước  Cho enzyme amylase vào : hút 1ml dung dịch enzyme pha loãng cho vào ống nghiệm trên( làm với ống thời gian màu nhanh)  Tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme dưới ảnh hưởng PH cách xác định thời gian thủy giải amylase: - Cứ sau vài giây nhỏ giọt lugol (hoặc iod) lên mặt kiếng ,sau nhỏ vào giọt hỗn hợp dung dịch.( có màu xanh đậm) Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17 - Làm đến không thấy màu xanh xuất lúc tinh bột bị thủy phân hoàn toàn amylase - Ghi nhận lại thời gian thủy giải( tính từ lúc cho enzyme vào ) Hình 1.3  Kết khảo sát: - Với ống có PH=4 thời gian thủy giải phút 45s - Với ống có PH=6 thời gian thủy giải 36s - Với ống có PH=8 thời gian thủy giải phút 10s  Biểu đồ: Thực tập môn Công nghệ Enzyme Nhóm 17  Nhận xét gải thích : -Nhận xét: với ống có PH =6 có thời gian thủy giải nhanh , cịn với PH=4 PH=8 có thời gian thủy giải chậm -Giải thích: Tùy thuộc vào nguồn gốc enzyme amylase có PH tối ưu khác nhau, dựa vào kết thí nghiệm ta có PH tối ưu enzyme amylase dùng làm thí nghiệm 6( thời gian enzyme thủy giải tinh bột nhanh nhất), với độ PH thích hợp cho enzyme hoạt động thủy giải tinh bột,chỉ khoảng có 36s để thủy giải lượng tinh bột ống nghiệm Còn đối với PH=4 PH=8 độ PH tối ưu amylase độ PH ức chế hoạt tính enzyme nên khả thủy giải tinh bột enzyme giảm nên thời gian màu xanh( màu xanh tinh bột phản ứng với iod) lâu hơn(với ống có PH=4 thời gian thủy giải phút 45s ;với ống có PH=8 thời gian thủy giải phút 10s ) Khảo sát ảnh hưởng chất hoạt hóa ức chế đến hoạt tính enzyme:  Nguyên tắc: Amylase nước bọt (α – amylase) tăng hoạt động môi trường có NaCl ngược lại CuSO4 ức chế tác dụng enzyme Trong ống nghiệm có chứa α – amylase tinh bột Cho NaCl vào ống 1, CuSO4 vào ống 2, nước vào ống Sau cùn thời gian tác dụng ta thấy: ống 1: tinh bột thủy giải hồn tồn ống 2: khơng có thủy phân tinh bột ống 3: tinh bột thủy giải đến dextrin  Các tiến hành: Chuẩn bị ống nghiệm: Thực tập môn Công nghệ Enzyme Nhóm 17 - ống 1: 0,5 ml dd amylase đá pha loãng 0,5 ml NaCl 1% - ống 2: 0,5 ml dd amylase pha loãng 0,5 ml CuSO4 1% - ống 3: 0,5 ml dd amylase pha lỗng 0,5 ml nước cất Sau đó, cho vào ống 1ml đ hồ tinh bột 1% Để ống vào nhiệt độ phòng ( khoảng 25oC) tronbg từ 3-5 phút Tiếp theo nhỏ giọt Iod vào ống nghiệm 1, 2, Rồi lắc nhẹ cho phản ứng xảy xa  - Kết quả: ống có màu vàng nâu ống có màu xanh rêu đậm ống có màu vàng nâu Hình 1.4 Giải thích kết quả: - ống 1: Vì có Cl- tác nhân hoạt hóa cho amylase nên tinh bột thủy phân hoàn toàn Khi chi iod vào khơng có tinh bột để bắt màu nên dd thu có màu thuốc thử iod - ống 2: Vì có Cu2+ ức chế hoạt động amylase nên tinh bột không bị thủy phân Do cho thuốc thử iod vào có màu tím kết hợp với màu xanh lam dd CuSO4 nên cho màu xanh rêu đậm Thực tập môn Công nghệ Enzyme Nhóm 17 - ống 2: Do có nước cất nên nồng độ enzyme amylase bị loãng Do hiệu suất thủy phân tinh bột đến phân tử dextrin, không bắt màu với iod nên cho iod vào dd thu có màu thuốc thử iod BÀI 2: ENZYME AMYLASE Xác định hoạt lực Enzyme Amylase phương pháp Heinkel  Nguyên tắc: Xác định lượng tinh bột bị phân hủy dựa sở xác định mức độ giảm cường độ màu hỗn hợp phản ứng với dung dịch iot Đơn vị hoạt động Enzyme lượng Enzyme có khả phân giải mg tinh bột sau 30 phút 300C  Cách tiến hành: - Lấy hai ống nghiệm ghi lên ống thứ ống enzyme; ống thứ hai ống đối chứng - Chuẩn bị dung dịch NaCl 0,1% : ta cân 0,1g muối NaCl cho vào 10ml nước cất, khuấy ta dung dịch NaCl 0,1% - Dùng pipette 1ml hút 1ml dung dịch tinh bơt cho vào ống nghiệm sau lại cho vào ống nghiệm ml dung dịch NaCl 0,1% 2ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH= 6, lắc Sau để nhiệt độ phịng 20 phút - Sau đó, cho vào ống Enzyme ml dung dịch Enzyme nhiệt độ phòng; ống đối chứng 1ml nước cất, lắc đều, tiếp tục để nhiệt độ phịng 30 phút - Sau cho vào ống 5ml dung dịch acid sulfosalisilic 20% để ngừng phản ứng Rồi cho vào ống 9ml dung dịch iod pha lỗng 150 lần - Sau đem đo màu bước sóng 560nm 10 Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17  Số liệu lập đồ thị chuẩn: Ống Số mg tinh bột OD560nm 1’ 0,064 2’ 0,2 0,275 3’ 0,4 0,491 4’ 0,6 0,751 5’ 0,8 0,987 6’ 1,262 OD560nm 1.4 1.2 f(x) = 1.2x + 0.04 R² = OD560nm 0.8 OD560nm Linear (OD560nm) 0.6 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 số mg tinh bột  Số liệu thu : - Ống Enzyme: OD560nm= 0,098 - Ống đối chứng: OD560nm= 0,77  Gọi A1 kết ống Enzyme: A2 kết ống đối chứng:  Tra lên biểu đồ ta X= 0,556 mg tinh bột Số tinh bột phân giải X = 0,556mg tinh bột*150=83,4 mg tinh bột  Vậy số tinh bột bị phân giải thí nghiệm 83,4 mg BÀI 3: ENZYME PROTEASE Xác định hoạt tính pepsin thơ phương pháp Anson cải tiến  Nguyên tắc: Casein pepsin phân giải môi trường acid tạo đoạn peptit ngắn không tủa T.C.A (trichloro acetic acid) lượng 11 Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17 tyrosin, trytophan xác định phản ứng màu với thuốc thử folin Đo mmật độ quang dung dịch suy nồng độ sản phẩm tính hoạt tính protein  Quá trình thực hiện:  Chuẩn bị ống nghiệm cho vào ống 1ml dung dịch sau:  Ống A1: Enzyme pepsin dày heo  Ống A2: Enzyme thương mại (protease pha loãng 100 lần)  Ống B (đối chứng): H2O  Cho vào ống 5ml dung dịch casein 2% để nhiệt độ phịng vịng 10 phút  Sau cho 10ml TCA 5% Để yên ống 30 phút đem lọc  Lấy 1ml dịch lọc thêm 2ml NaOH 0,5N 0,6ml thuốc thử Folin  Sau 15 phút đo OD bước sóng 660nm (pha lỗng dung dịch 10 lần để đo) Hình 3.1  Xây dựng đường chuẩn tyrosin nguyên chất: Ống µ mol tyrosin 0.2 0.4 0.6 0.8 OD660nm 0.021 0.312 0.497 0.687 0.83 1.019 12 Thực tập môn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17 đường chuẩn t yros in 1.2 f(x) = 96 x + 0 R² = 99 od 660nm 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1.2 µmol tyrosin  Kết quả:  Ồng A1: 1,52  Ống A2: 1,65*100=165  Ống B: 0,178  Tính kết quả:  Hiệu số giá trị OD mẫu thí nghiệm mẫu kiểm tra:  OD1 = ODA1 - ODB = 1,52 – 0,178 = 1,342  OD2 = ODA2 - ODB = 165 – 0,178 = 164,822  OD = = 163,48  Từ OD dựa theo đồ thị chuẩn tính lượng mol tyrosin tương ứng: 163,48 = 0,962*X + 0,08 => X cần tìm 169,854  Hoạt tính protease pepsin biểu thị số đơn vị Protease/1g chế phẩm theo công thức:  Hoạt độ protease/1ml enzyme = = = 271,77 13 Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17 V: thể tích toàn hỗn hợp (cơ chất + enzyme + TCA = 5+1+10=16 ml) t: thời gian thủy giải 10 phút Hình BÀI 4: ENZYME PECTINASE 1.Phương pháp so màu  Nguyên tắc: Là phương pháp dựa việc so sánh cường độ màu dung dịch nghiên cứu với cường độ màu dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định Dùng phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ chất phân tích Phương pháp thời gian so với phương pháp hóa học khác Nguyên tắc phương pháp xác định lượng acicd galacturonic tạo q trình thủy phân pectinase Cơ chất pectin khơng kết tủa ZnSO4 14 Thực tập môn Công nghệ Enzyme Nhóm 17  Định nghĩa đơn vị hoạt tính: Một đơn vị hoạt tính pectinase lượng Enzyme điều kiện tiêu chuẩn ( nhiệt độ 30°C pH 3,9-4,1, thời gian phản ứng 60 phút với nồng độ pectin môi trường phản ứng 0,66%, mức độ thủy phân pectin 30%) có khả xúc tác, làm biến đổi 1g pectin sau 60 phút thành acid galacturonic  Hóa chất: - Dung dịch petin 1% - Dung dịch ZnSO4 15% - Dung dịch Enzyme 1% - Dung dịch Antrone 0,2% (C6H4COH4CH2) acid sulfuric đậm đặc  Tiến hành: Cho 20ml dung dịch pectin 10% vào ống nghiệm cho 10ml dung dịch Enzym 1%, lắc cho vào tủ ấm nhiệt độ 30°C (dung dịch pectin có PH = 3,9-4,1) Sau 60 phút lấy thêm 2ml ZnSO 15%, đem lọc qua giấy lọc, dung dịch lọc đem pha loãng lần dùng cho phản ứng với Anthrone Lấy 5ml Anthrone cho vào ống nghiệm, cho 2,5ml dung dịch lọc pha loãng, lắc mạnh thời gian 10 phút Sau đặt nồi thủy nhiệt độ 70°C thời gian 12 phút lấy nguội đến nhiệt độ phòng tiến hành đo giá trị OD bước sóng X = 584 nm  Tính hoạt độ Giá trị OD bước sóng X=584 0,363 (đã pha loãng dung dịch 100 lần) Hoạt tính pectinase = 0,34OD  0,0104/m = 0,34.0,3630,0104/10 =0,011302  OD = ODTN  ODĐC = 0,363 0,3= 0,063 ODTN: Giá trị OD thí nghệm OD ĐC: Giá trị OD đối chứng 15 Thực tập môn Công nghệ Enzyme Nhóm 17 Ứng dụng pectinase làm nước ép trái  Hóa chất - Nước ép táo - Dung dịch pectinase 1%  Các bước tiến hành - Cân 30g táo, ép lấy dịch quả, pha loãng thành 100ml nước cất - Hút 8ml dung dịch cho vào ống nghiệm ống nghiệm khác - Thêm dung dịch pectinase 1% vào ống nghiệm với thể tích ống 0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6ml - Sau thêm nước cất vào cho ống có đủ 10ml - Để tất ống nghiệm 45-50 độ C 30 phút - Sau lấy 5ml dung dịch bên ống đem độ truyền suốt bước sóng 584nm  Kết Ống nghiệm ml 31,5 Ống nghiệm 0,4ml 27,5 Ống nghiệm 0,8ml 28,8 16 Ống nghiệm 1,2 ml 34,6 Ống nghiệm 1,6ml 20,9 Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17 Hình 4.2 - Đường biểu diễn độ truyền suốt dung dịch nước ép táo Biêu diên đô truyên suốt cua dung dich 40 35 30 25 20 Biêu diên đ ô truyên suôt cua dung dịch 15 10  Nhận xét giải thích: 17 Thực tập mơn Cơng nghệ Enzyme Nhóm 17  Nhận xét: Dịch ống nghiệm 1,2ml có độ cao nhất, dịch ống nghiệm 1,6ml có độ thấp  Giải thích: Enzyme pectinase thủy phân pectin, làm giảm độ nhớt, giúp dịch thoát dễ dàng, nâng cao hiệu suất ép làm dịch Vì vậy, dịch có độ truyền suốt lớn dịch trong, tức có nhiều enzyme pectinase làm dịch 18 ... suốt bước sóng 584nm  Kết Ống nghiệm ml 31,5 Ống nghiệm 0,4ml 27,5 Ống nghiệm 0,8ml 28,8 16 Ống nghiệm 1,2 ml 34,6 Ống nghiệm 1,6ml 20,9 Thực tập mơn Cơng ngh? ?? Enzyme Nhóm 17 Hình 4.2 - Đường... ưu khác nhau, dựa vào kết thí nghiệm ta có PH tối ưu enzyme amylase dùng làm thí nghiệm 6( thời gian enzyme thủy giải tinh bột nhanh nhất), với độ PH thích hợp cho enzyme hoạt động thủy giải tinh... loãng enzyme amylase 10 lần : hút ml enzyme amylase sau cho vào ml nước  Cho enzyme amylase vào : hút 1ml dung dịch enzyme pha loãng cho vào ống nghiệm trên( làm với ống thời gian màu nhanh)