Nghiên cứu đặc điểm sinh học và hoạt chất của nấm cordyceps phân lập tại langbiang lâm đồng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ XUYẾN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ HOẠT CHẤT CỦA NẤM CORDYCEPS PHÂN LẬP TẠI LANGBIANG – LÂM ĐỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ XUYẾN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ HOẠT CHẤT CỦA NẤM CORDYCEPS PHÂN LẬP TẠI LANGBIANG - LÂM ĐỒNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số chuyên ngành: 62 42 40 01 Phản biện 1: PGS.TS Trần Hồng Dũng Phản biện 2: TS Võ Đình Quang Phản biện 3: TS Nguyễn Thị Liên Thương Phản biện độc lập 1: PGS.TS Trần Hoàng Dũng Phản biện độc lập 2: TS Nguyễn Thị Liên Thương NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TSKH NGÔ KẾ SƯƠNG TS TRƯƠNG BÌNH NGUN TP Hồ Chí Minh – Năm 2018 LỜI CẢM ƠN Trước tiên em xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TSKH NGƠ KẾ SƯƠNG TS TRƯƠNG BÌNH NGUN, người Thầy tận tình hướng dẫn chỗ dựa vững mặt kiến thức lẫn tinh thần, ln tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành tốt luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Đinh Minh Hiệp truyền đạt kiến thức q báu, tận tình giúp đỡ động viên nhiều suốt thời gian thực luận án Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến PGS TS Phan Thị Phượng Trang giúp đỡ nhiệt tình, ln tạo điều kiện thuận lợi động viên suốt thời gian qua Tôi xin gửi lời cám ơn đến PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy hỗ trợ động viên thời gian thực luận án Tôi xin gửi lời cám ơn đến NCS Nguyễn Như Nhứt, NCS Vương Lợi, NCS Trần Minh Trang, NCS Lao Đức Thuận, NCS Huỳnh Thư, NCS Nguyễn Thị Mỹ Nương, Ths Đỗ Thị Thiên Lý Ths.Vũ Thị Ngân giúp đỡ nhiều tháng ngày qua Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô, anh chị công tác Viện Sinh Học Tây Nguyên – Đà Lạt; Công Ty TNHH Nguyên Long – Đà Lạt; PTN Sinh hóa, PTN Di truyền – Sinh học phân tử – Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên tạo điều kiện thuận lợi hết lòng giúp đỡ thời gian thực nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Bộ Môn Vi Sinh - Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên cung cấp cho kiến thức q báu suốt năm học qua Tơi xin gửi lời cám ơn đến Ban Giám Hiệu, Quý Thầy Cô Trường Đại Học Văn Lang, đặc biệt PGS TS Lê Thị Kim Oanh, PGS.TS Ngô Thị Xuyên hết lịng tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin gửi lịng biết ơn vơ hạn đến người thân yêu gia đình, bạn bè động viên chia sẻ tơi lúc khó khăn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày Luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Người viết cam đoan Võ Thị Xuyến ii MỤC LỤC Trang Mục lục … iii Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng ix Danh mục hình x MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Về nấm Cordyceps 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Sự phân bố 1.1.3 Một số đặc điểm sinh học 1.1.3.1 Đặc điểm thể 1.1.3.2 Đặc điểm khuẩn lạc sợi nấm 10 1.1.3.3 Ký chủ trình xâm nhiễm nấm 11 1.1.3.4 Vòng đời nấm Cordyceps 12 1.1.3.5 Di truyền nấm Cordyceps 13 1.2 Nuôi cấy thu sinh khối Cordyceps 14 1.2.1 Thu sinh khối Cordyceps nuôi cấy môi trường lỏng 14 1.2.1.1 Ảnh hưởng thành phần môi trường 15 1.2.1.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy 17 1.2.2 Nuôi cấy thu nhận thể nấm Cordyceps 24 1.3 Hoạt tính sinh học nấm Cordyceps 25 1.3.1 Hoạt tính kháng oxy hóa 25 1.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào 26 1.3.3 Hoạt tính điều hòa miễn dịch 27 1.3.4 Hoạt tính kháng khuẩn 28 1.3.5 Hoạt tính kháng viêm 29 1.3.6 Hoạt tính bảo vệ thận 29 1.3.7 Hoạt tính bảo vệ gan phổi 30 1.3.8 Hoạt tính bảo vệ hoạt động tim mạch 31 iii 1.4 Các nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học Cordyceps 34 1.4.1 Nucleosid 34 1.4.2 Polysaccharid 36 1.4.3 Protein peptid 38 1.4.4 Ergosterol mannitol 39 1.4.5 Các thành phần khác 40 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 42 2.1 Vật liệu 42 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 42 2.1.2 Các dòng tế bào dùng thử nghiệm 42 2.1.3 Các chủng vi khuẩn dùng thử nghiệm 42 2.1.4 Hóa chất thiết bị 43 2.1.4.1 Hóa chất 43 2.1.4.2 Thiết bị dụng cụ 44 2.1.5 Môi trường nuôi cấy 44 2.1.6 Nơi thực nghiên cứu 44 2.2 Phương pháp nghiên cứu 45 2.2.1 Thu bảo quản mẫu 45 2.2.2 Phân lập làm chủng nấm 45 2.2.3 Định danh dòng nấm 46 2.2.3.1 Phân tích đặc điểm hình thái thể hữu tính 46 2.2.3.2 Phân tích đặc điểm hình thái thể vơ tính 46 2.2.4 Phương pháp nuôi cấy thu sinh khối 46 2.2.4.1 Chuẩn bị giống 46 2.2.4.2 Nuôi cấy thu sinh khối sợi nấm 47 2.2.5 Tuyển chọn chủng có tiềm hoạt tính sinh học 47 2.2.5.1 Tìm thời gian ni cấy thích hợp 47 2.2.5.2 Chọn chủng có tiềm 47 2.2.6 Xác định môi trường điều kiện ni cấy thích hợp cho chủng chọn 48 2.2.6.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon nitơ 48 2.2.6.2 Tối ưu hóa thành phần mơi trường điều kiện ni cấy iv phần mềm BCPharSoft 48 2.2.7 Chiết xuất phân đoạn 51 2.2.7.1 Phát thành phần hóa học 51 2.2.7.2 Thu nhận cao chiết phân đoạn 54 2.2.8 Định lượng số hợp chất sinh học 55 2.2.8.1 Định lượng polysaccharid 55 2.2.8.2 Định lượng adenosin cordycepin 55 2.2.9 Khảo sát hoạt tính sinh học cao chiết 56 2.2.9.1 Hoạt tính kháng oxy hóa 56 2.2.9.2 Khả gây độc tế bào 59 2.2.9.3 Khả kích thích tăng sinh PBMC 60 2.2.9.4 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 62 2.2.10 Xử lý số liệu 62 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 63 3.1 Phân lập, làm định danh mẫu nấm thu 63 3.1.1 Phân lập làm 63 3.1.2 Đặc điểm hình thái, giải phẫu định danh mẫu nấm 66 3.1.2.1 Đặc điểm hình thái giải phẫu 66 3.1.2.2 Định danh mẫu nấm dựa vào đặc điểm hình thái giải phẫu 74 3.2 Tuyển chọn chủng có tiềm sử dụng 76 3.2.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh khối khô 76 3.2.2 Định tính thành phần hóa học sinh khối nấm thu 78 3.2.3 Thành phần hàm lượng hợp chất có HTSH sinh khối chủng nấm nuôi cấy 81 3.3 Tối ưu hóa mơi trường điều kiện ni cấy chủng DL0015 84 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn cacbon nitơ 84 3.3.1.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 85 3.3.1.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 87 3.3.2 Tối ưu hóa thành phần mơi trường ni cấy C pseudomilitaris DL0015 89 3.3.2.1 Thiết kế mơ hình thực nghiệm 89 3.3.2.2 Tối ưu hóa cơng thức 91 v 3.3.2.3 Phân tích ảnh hưởng thông số đầu vào thông số đầu biểu đồ 3D 92 3.3.3 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy 97 3.3.3.1 Thiết kế mơ hình thực nghiệm 97 3.3.3.2 Tối ưu hóa cơng thức 99 3.3.3.3 Phân tích ảnh hưởng thơng số đầu vào thông số đầu biểu đồ 3D 100 3.4 Khảo sát hoạt tính sinh học cao chiết 106 3.4.1 Trích ly thu hồi cao chiết 106 3.4.2 Hoạt tính sinh học cao chiết 107 3.4.2.1 Khả bắt gốc tự DPPH ABTS 108 3.4.2.2 Khả kháng oxy hóa nội bào 110 3.4.2.3 Khả gây độc tế bào 113 3.4.2.4 Khảo sát khả kích thích tăng sinh PBMC 116 3.4.2.5 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 119 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 122 4.1 Kết luận 122 4.2 Kiến nghị 123 Đóng góp luận án 124 Danh mục cơng trình công bố 125 Tài liệu tham khảo 136 Danh mục phụ lục vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AAPH 2’-azobis (2-amidinopropane) dihydrochlorid 2,2 – azinobis – (3 – ethylbenzothiazoline – – sulphonat) tiểu phần ATP synthase ty thể ABTS ATP6 BU C DCF DCFH DCFH-DA 2’-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride 2,2 – azinobis – (3 – ethylbenzothiazoline – – sulphonate) Mitochondrially Encoded ATP Synthase n – Butanol Carbon 2’,7’-dichlorofluorescein Dichlorodihyddrofluorescein Dichloro-Dihydro- Fluorescein Diacetate Dimethylsulfoxide Deoxyribonucleic acid 2,2 – diphenyl – – picrylhydrazyl Exopolysaccharide Ethylacetate Ethanol N-formyl-methionyl-leucyl phenylalanine/cytochalasin B n – Butanol Cacbon 2’,7’-dichlorofluorescein dichlorodihyddrofluorescein 2’,7’-dichloro-DihydroFluorescein Diacetate Dimethylsulfoxid axit Deoxyribonucleic 2,2 – diphenyl – – picrylhydrazyl Đối chứng Polysaccharid ngoại bào Etylacetat Cồn etanol N-formyl-methionyl-leucyl phenylalanine/cytochalasin B HepG2 Liver Hepatocellular Carcinoma Tế bào ung thư gan IC50 IgAN IL Inhibitory concentration 50% Immunoglobulin a nephropathy Interleukin Nồng độ ức chế 50% Bệnh Berger Interleukin IPS Intra-Polysacharide Polysaccharid nội bào ITS LDL Internal transcribed spacer Low-density lipoprotein Vùng đệm mã Lipoprotein tỷ trọng thấp MeOH Methanol Metanol DMSO DNA DPPH ĐC EPS EtOAc EtOH FMLP/CB vii MT Môi trường MTT 3–(4,5–dimethylthiazol–2–yl)–2,5 –diphenyltetrazolium bromide 3–(4,5–dimethylthiazol–2– yl)–2,5 –diphenyltetrazolium bromid N Nitrogen Nitơ nrLSU nuclear large subunit ribosomal DNA nuclear small subunit ribosomal DNA Optical Density Peripheral blood mononuclear cell Phosphate buffer saline Petroleum ether Potato glucose agar Potato glucose tiểu phần lớn ribosome nhân nrSSU OD PBMC PBS PE PGA PG PK PS PTN RPB1 ROS SKK SOD SDS t-BHP TEF1 TLTK TN TUB tiểu phần nhỏ ribosome nhân Elongation factor 1 Độ hấp thu Tế bào đơn nhân máu ngoại vi Đệm PBS Ete dầu hỏa Thạch khoai tây glucose Khoai tây glucose Khoai tây, khống Polysaccharid Phịng thí nghiệm tiểu phần lớn RNA polymerase II Gốc oxy hóa Sinh khối khô Superoxide dismutase Natri dodecyl sulfate t-butyl hydroperoxit nhân tố kéo dài dịch mã 1α  tubulin Tài liệu tham khảo Thí nghiệm  tubulin Polysaccharide Largest subunit of RNA polymerase II Reactive oxygen species Superoxide dismutase sodium dodecyl sulfate t-butyl hydroperoxide viii Bảng: Kết định tính thành phần hóa học mẫu DL0075 Nhóm hợp chất Thuốc thử Cách thực Tinh dầu Chất béo Carotenoid Triterpenoid tự Bốc tới cắn Nhỏ dung dịch lên giấy Carr – Price Liebermann-Burchaard Alkaloid Coumarin Anthraquinon Flavonoid Glycosid tim Anthocyanosid Thuốc thử chung Phát quang kiềm NaOH 10% Mg/HCl đậm đặc Thuốc thử vòng lacton HCl NaOH HCl/nhiệt độ Dung dịch FeCl3 Dung dịch gelatin muối Lắc mạnh dd nước Na2CO3 Thuốc thử Fehling A, B Pha loãng với cồn 95% Proanthocyanidin Tannin Saponin Acid hữu Chất khử Polyuronic Phản ứng dương tính Có mùi thơm Vết mờ Xanh chuyển sang đỏ Đỏ nâu –tím, lớp có màu xanh lục Kết tủa Phát quang mạnh Dung dịch kiềm có màu hồng tới đỏ Dung dịch có màu hồng tới đỏ Tím Đỏ Xanh Đỏ Xanh rêu hay xanh đen (polyphenol) Tủa trắng (tannin) Sủi bọt Tủa gạch đỏ Tủa trắng – vàng nâu PL- 34 Kết định tính dịch chiết Dịch Dịch chiết cồn Dịch chiết nước chiết Không Thủy Không Thủy ether thủy phân thủy phân phân phân +++ ++ + - ++ + +++ - ++ + +++ ++ - Kết +++ ++ + +++ ++ Phụ lục 4.3 Kết dự đoán kiểm chứng cơng thức tối ưu hóa thành phần mơi trường không khác mặt thống kê (p > 0,05) (One - sample T Test) Thông số đầu Kết dự Kiểm chứng (NT18) đoán từ Lần Lần Lần phần mềm SKK (g/l) 17,15 18,92 17,13 Adenosin (mg/kg SKK) 352,93 363,00 352,00 357,50 0,29 > 0,05 Polysaccharid (% SKK) 9,82 10,22 9,80 0,24> 0,05 18,95 10,61 Giá trị P 0,19> 0,05 Phụ lục 4.4: Phân tích ảnh hưởng thông số đầu vào biểu đồ 3D khảo sát tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy C pseudomilitaris DL0015 a/ Ảnh hưởng saccharose, pepton MgSO4.7H2O lên SKK (a) (b) (c) Hình 1: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng saccharose, pepton MgSO4.7H2O lên SKK Hình 1a: muốn tăng SKK cần phải tăng lượng saccharose khoảng 40 – 55g/l lượng pepton mức cao (từ 10g/l trở lên) (với giá trị MgSO4.7H2O cố định mức 0,2g/l) Hình 1a cho thấy saccharose bổ sung mức cao (60g/l) pepton bổ sung mức thấp (6g/l) SKK khơng tăng; ngược lại pepton bổ sung mức cao (từ 12 – 14g/l) mà PL- 35 saccharose mức thấp (từ 20 – 25g/l) SKK không tăng Nhưng pepton bổ sung từ 10g/l trở lên kết hợp với saccharose mức từ 40 – 55g/l SKK tăng cao Như vậy, saccharose pepton có ảnh hưởng nhiều lên SKK, pepton ảnh hưởng có phần mạnh Hình 1b: cho thấy muốn tăng SKK cần phải tăng lượng saccharose khoảng từ 45 – đến 55g/l MgSO4.7H2O khoảng 0,2 – 0,5g/l (với hàm lượng pepton cố định 14,9g/l), nghĩa saccharose mức từ trung bình đến cao kết hợp với lượng khống vừa đủ (từ thấp đến trung bình) SKK gia tăng Hình 1c cho thấy với giá trị saccharose cố định mức (58,7g/l), lượng pepton tăng cao từ 10g/l trở lên lượng MgSO4.7H2O từ 0,2 đến 0,5g/l SKK thu đạt mức cao Hình cho thấy pepton mức thấp từ khoảng đến 8g/l kết hợp với MgSO4.7H2O từ thấp đến cao không làm gia tăng giá trị SKK Hình lần khẳng định, pepton cần cho tăng trưởng nấm C pseudomilitaris DL0015 nuôi cấy Kết luận: từ biểu đồ hình thấy, muốn tăng SKK cần phải tăng lượng pepton mức từ 10g/l trở lên lượng saccharose khoảng 45 – 55g/l Qua thấy, tăng trưởng C pseudomilitaris DL0015 nuôi cấy chịu ảnh hưởng nhiều nguồn cacbon, nitơ tăng theo gia tăng hàm lượng hai thành phần này, cần lượng vừa đủ MgSO4.7H2O (trong khoảng 0,2 – 0,5g/l) b/ Ảnh hưởng saccharose, pepton MgSO4.7H2O lên hàm lượng adenosin Từ phân tích hình cho thấy, để tăng trưởng lượng pepton cần bổ sung vào mơi trường mức từ 10g/l trở lên Nếu áp dụng kết adenosin hình 2a hồn toàn phù hợp Cụ thể, với giá trị MgSO4.7H2O cố định 0,2g/l, để adenosin đạt mức cao pepton phải bổ sung mức cao; hình 2a pepton bổ sung mức từ 10g/l trở lên saccharose khơng ảnh hưởng đến tích lũy adenosin Như thấy, muốn tăng giá trị adenosin cần tăng chủ yếu lượng pepton (từ 10g/l trở lên), lượng PL- 36 saccharose khoảng từ 20 – 55g/l, để phù hợp với kết tăng trưởng lượng pepton bổ sung từ 10g/l trở lên với saccharose khoảng 40 – 55g/l Hình 2b: từ phân tích trên, với hàm lượng pepton cố định mức 14,9g/l, hình 2b cho thấy muốn adenosin đạt mức cao lượng saccharose bổ sung khoảng 40 – 55g/l kết hợp với MgSO4.7H2O bổ sung khoảng từ 0,2 – 0,4g/l Hình 2c: với giá trị saccharose cố định mức 58,7g/l, để adenosin đạt mức cao lượng pepton bổ sung vào mức từ 10g/l trở lên đồng thời kết hợp với MgSO4.7H2O mức thấp từ gần 0,2 đến 0,4g/l Như thấy muốn tăng adenosin cần tăng chủ yếu lượng pepton, qua thấy pepton ln ảnh hưởng đến việc tích lũy adenosin (a) (b) (c) Hình 2: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng saccharose, pepton MgSO4.7H2O lên adenosin Kết luận: từ biểu đồ hình với kết phân tích tăng trưởng hình 1, thấy muốn tăng adenosin cần tăng lượng pepton bổ sung mức cao (từ 10g/l trở lên), lượng saccharose khoảng 45 – 55g/l kết hợp với lượng thấp MgSO4.7H2O (từ 0,2 - 0,4g/l) Kết tạo thành adenosin chịu ảnh hưởng chủ yếu pepton tăng theo gia tăng hàm lượng thành phần này, MgSO4.7H2O Trong saccharose lại ảnh hưởng PL- 37 không nhiều đến tạo thành adenosin Như thấy pepton cần cho tạo thành adenosin C pseudomilitaris DL0015 nuôi cấy saccharose c/ Ảnh hưởng saccharose, pepton MgSO4.7H2O lên tích lũy polysaccharid (a) (b) (c) Hình 3: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng saccharose, pepton MgSO4.7H2O lên polysaccharid Hình 3a cho thấy, muốn tăng giá trị polysaccharid chủ yếu cần tăng lượng saccharose từ 50g/l trở lên, lượng pepton cần mức cao (từ 14g/l trở lên) Hình 3a cịn lượng pepton bổ sung mức cao hay thấp kết hợp với lượng saccharose mức thấp (khoảng từ 25 – 35g/l) lượng polysaccharid tạo thành khơng cao Như dựa hình 3a, với lượng MgSO4.7H2O mức tối thiểu (0,2g/l), cho thấy saccharose thành phần dinh dưỡng ảnh hưởng mạnh lên tích lũy polysaccharid pepton Hình 3b: cho thấy muốn polysaccharid đạt mức cao lượng saccharose phải bổ sung vào môi trường từ 20 đến gần 60g/l, lượng MgSO4.7H2O khoảng từ 0,2 đến 0,7g/l Để phù hợp với phân tích lượng saccharose bổ sung từ 50g/l trở lên MgSO4.7H2O bổ sung nằm khoảng từ 0,2 đến 0,4g/l Hình 3c cho thấy, để tăng tích lũy polysaccharid lượng pepton bổ sung mức cao từ 14g/l trở lên MgSO4.7H2O mức thấp khoảng 0,2 – 0,4g/l (với PL- 38 giá trị saccharose mức 58,7g/l) Hình cịn pepton ảnh hưởng mạnh lên tạo thành polysaccharid MgSO4.7H2O Kết luận: từ biểu đồ hình 3, đồng thời để phù hợp với kết phân tích tăng trưởng sinh khối tích lũy adenosin hình hình cho thấy muốn tăng tích lũy polysaccharid chủ yếu cần phải tăng lượng saccharose khoảng từ 50g/l trở lên (từ 50 – 55g/l) kết hợp với lượng pepton mức cao, 14g/l MgSO4.7H2O mức thấp (trong khoảng 0,2 – 0,4g/l) Trong yếu tố dinh dưỡng saccharose thành phần cần cho tạo thành polysaccharid so với pepton Từ kết phân tích hình 1, nhận thấy, để tăng trưởng, tích lũy adenosin polysaccharid đạt giá trị cao mơi trường ni cấy cần bổ sung lượng lớn pepton, khoảng 15g/l saccharose khoảng từ 55g/l trở lên với lượng MgSO4.7H2O bổ sung thấp, khoảng 0,2g/l Trong pepton thành phần có ảnh hưởng nhiều lên tăng trưởng, tích lũy adenosin protein, saccharose thành phần có ảnh hưởng nhiều lên tạo thành polysaccharid Như công thức tối ưu phù hợp với nghiệm thức 18 kết thu không khác mặt thống kê (p > 0,05) so với kết dự đoán từ phần mềm, nên công thức 18 chọn công thức tối ưu Phụ lục 4.5 Kết dự đoán kết kiểm chứng công thức tối ưu hóa điều kiện ni cấy khơng khác mặt thống kê (p > 0,05) (One - sample T Test) Thông số đầu Kết dự Kiểm chứng (NT13) đoán từ Lần Lần Lần phần mềm SKK (g/l) 19,71 20,19 20,15 19,60 0,29> 0,05 Adenosin (mg/kg SKK) 825,93 835,50 827,00 844,00 0,19 > 0,05 Polysaccharid (% SKK) 10,66 11,50 10,65 11,57 0,19> 0,05 PL- 39 Giá trị P Phụ lục 4.6: Phân tích ảnh hưởng thông số đầu vào biểu đồ 3D khảo sát tối ưu hóa điều kiện ni cấy C pseudomilitaris DL0015 a/ Ảnh hưởng pH, ánh sáng nhiệt độ lên SKK (a) (b) (c) Hình 1: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng pH, ánh sáng nhiệt độ lên tăng trưởng C pseudomilitaris DL0015 ni cấy Hình 1a: muốn tăng giá trị tăng trưởng C pseudomilitaris DL0015 ni cấy điều kiện pH 5,5 – 7,5 ánh sáng khoảng mức (từ 1,5 đến 2,5), tức loại trừ điều kiện ánh sáng liên tục mức tối liên tục mức (với giá trị nhiệt độ cố định mức 3) Hình 1a cho thấy ánh sáng mức pH mức thấp (khoảng 5,3) tăng trưởng giảm mức thấp nhất; ánh sáng mức gần kết hợp với pH từ đến 8,5 không làm gia tăng giá trị tăng trưởng Như thấy pH ánh sáng ảnh hưởng đến tăng trưởng nấm Hình 1b cho thấy muốn tăng giá trị tăng trưởng nấm cần nuôi cấy pH từ 6,5 – kết hợp với nhiệt độ mức từ đến Hình cịn cho thấy pH mức từ – 8,7 kết hợp với ánh sáng khoảng - từ đến 1,5 mức tăng trưởng giảm tới mức thấp Hình 1b pH khoảng 6,5 – nhiệt độ ảnh hưởng đến giá trị tăng trưởng Như thấy pH nhiệt độ ảnh hưởng đến tăng trưởng nấm, pH ảnh hưởng mạnh PL- 40 Hình 1c: để tăng trưởng đạt giá trị cao ánh sáng từ 1,2 đến nhiệt độ khoảng từ – (với giá trị pH cố định mức 6,7) Hình 1c so với điều kiện ánh sáng nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Kết luận: từ biểu đồ hình thấy, muốn tăng trưởng C pseudomilitaris DL0015 cần ni cấy điều kiện pH từ 5,5 – 7,5; ánh sáng khoảng (từ 1,5 – 2) nhiệt độ mức từ – Như thấy, phát triển C pseudomilitaris DL0015 chịu ảnh hưởng chủ yếu pH chế độ chiếu sáng, bị ảnh hưởng mức nhiệt độ khảo sát b/ Ảnh hưởng pH, ánh sáng nhiệt độ lên tích lũy adenosin (a) (b) (c) Hình 2: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng pH, ánh sáng nhiệt độ lên tích lũy adenosin Hình 2a cho thấy để tăng tích lũy adenosin pH mơi trường nằm khoảng từ 5,5 đến 7,5 tùy thuộc điều kiện chiếu sáng Hình cịn cho thấy pH từ – ánh sáng khơng ảnh hưởng đến giá trị adenosin tích lũy Như thấy pH ánh sáng có ảnh hưởng đến việc tích lũy adenosin pH ảnh hưởng mạnh Để phù hợp với kết tăng trưởng hình pH mơi trường phải nằm khoảng từ 5,5 –7,5 ánh sáng khoảng (từ 1,5 – 2) Hình 2b: từ phân tích trên, với ánh sáng cố định mức 2, hình 1b cho thấy muốn tăng tích lũy adenosin C pseudomilitaris DL0015 phải nuôi PL- 41 môi trường có pH giới hạn khoảng 6,5 – nhiệt độ mức từ đến Hình cho thấy pH mức từ thấp đến cao (từ 5,2 – 8,7) với nhiệt độ khoảng mức tích lũy adenosin đạt giá trị thấp Từ hình 1b thấy pH nhiệt độ ảnh hưởng mạnh đến việc sản xuất adenosin Hình 2c: với giá trị pH cố định mức 6,7, để tích lũy adenosin đạt mức cao nhiệt độ khoảng mức (từ 2,5 đến 3) đồng thời kết hợp với ánh sáng khoảng đến Hình 2c cịn nhiệt độ mức từ 1- 1,8 kết hợp với ánh sáng mức từ - không làm gia tăng giá trị adenosin Như ánh sáng nhiệt độ ảnh hưởng đến tích lũy adenosin Kết luận: Từ biểu đồ hình với kết phân tích tăng trưởng hình 1, thấy muốn tăng giá trị adenosin tích lũy nhiệt độ cần có khoảng mức 3, pH khoảng 6,5 – với ánh sáng mức Kết tạo thành adenosin chịu ảnh hưởng yếu tố, pH nhiệt độ ảnh hưởng mạnh ánh sáng c/ Ảnh hưởng pH, ánh sáng nhiệt độ lên tích lũy polysaccharid (a) (b) (c) Hình 3: Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng pH, ánh sáng nhiệt độ lên polysaccharid Kết phân tích biểu đồ hình hình cho thấy, để tăng giá trị tăng trưởng tích lũy adenosin pH mơi trường phải từ – ánh sáng mức 2, áp dụng kết với polysaccharid hình 3a hồn toàn phù hợp Cụ PL- 42 thể muốn tăng giá trị polysaccharid pH mơi trường nằm khoảng - với ánh sáng mức đến Như với nhiệt độ cố định mức 3, hình 3a cho thấy pH ánh sáng ảnh hưởng lên giá trị polysaccharid tích lũy, pH ảnh hưởng mạnh Hình 3b: Muốn polysaccharid đạt mức cao pH mơi trường phải khoảng – với nhiệt độ khoảng từ đến Từ kết phân tích hình 3a với ánh sáng cố định mức 2, pH – với nhiệt độ mức 2,5 – thích hợp Hình 3c: hình cho thấy để tăng giá trị polysaccharid tích lũy nhiệt độ phải từ mức đến với ánh sáng từ mức đến 2,5 (pH mức cố định 6,7) Hình 3c nhiệt độ ảnh hưởng lên việc tích lũy polysaccharid mạnh so với ánh sáng Kết luận: Từ kết phân tích biểu đồ hình đồng thời để phù hợp với kết phân tích tăng trưởng hình tích lũy adenosin hình nhận thấy, muốn đạt giá trị polysaccharid tích lũy mức cao pH môi trường phải khoảng 6,5 – 7, ánh sáng mức nhiệt độ khoảng mức (2,5 – 3) Trong yếu tố pH nhiệt độ ảnh hưởng lên việc tích lũy polysaccharid mạnh ánh sáng Tóm lại: Từ kết phân tích biểu đồ hình 1, nhận thấy, để tăng trưởng, tích lũy adenosin polysaccharid đạt mức giá trị cao C pseudomilitaris DL0015 cần nuôi cấy môi trường tối ưu với giá trị pH 6,5 - 7, ánh sáng mức (tức theo chu kỳ ngày đêm) nhiệt độ mức (25 ± 2oC/16 ngày, ± 2oC/7ngày trở lại 25 ± 2oC/7 ngày) Như công thức tối ưu phù hợp với nghiệm thức 13 sơ đồ thực nghiệm không khác mặt thống kê (p > 0,05) so với kết dự đoán từ phần mềm, nên nghiệm thức 13 chọn công thức tối ưu Trong yếu tố pH yếu tố có ảnh hưởng nhiều lên thông số đầu tăng trưởng, tích lũy adenosin polysaccharid Cịn nhiệt độ ánh sáng có tác động khác tùy thuộc vào loại thơng số đầu ra; nhiệt độ yếu tố có ảnh hưởng lên tạo PL- 43 thành adenosin, polysaccharid mạnh so với ánh sáng; ngược lại ánh sáng có ảnh hưởng lên tăng trưởng mạnh so với nhiệt độ Phụ lục 4.7: Kết thu hồi cao chiết Bảng: Hàm lượng cao EtOH, cao PS tính theo nguyên liệu cao phân đoạn tính theo cao tổng từ C pseudomilitaris DL0015 ni cấy STT Loại cao EtOH Hàm lượng cao (%) 24,24 ± 3,31 Độ ẩm (%) 10,18 ± 1,30 PE 12,86 ±1,76 9,56 ± 1,12 EtOAc 0,37 ± 0,02 9,04 ± 0,98 Bu 6,29 ± 1,03 7,88 ± 1,59 Nước 6,34 ± 0,95 2,38 ± 1,62 29,55 ± 3,68 5,36 ± 0,77 Cao phân đoạn Cao PS Phụ lục 4.8: Khả khử gốc tự DPPH ABTS Bảng: Hoạt tính bắt gốc tự DPPH ABTS cao chiết từ C pseudomilitaris DL0015 ni cấy Giá trị IC50 (µg/ml) Tên mẫu DPPH ABTS Cao EtOH 502,84±0,61 1.616,39±81,17 Cao PE 738,95±9,80 1.290,12±19,05 Cao EtOAc 112,64 ± 2,82 235, 26±3,62 Cao BU 581,98±3,14 698,36±10,94 Cao nước 362,71±4,70 974,78±18,78 Cao PS - 882,65±5,46 Vitamin C 3,36±0,05 54,81±0,28 Ghi chú: (-): không xác định PL- 44 Phụ lục 4.9: Khảo sát khả kháng oxy hóa nội bào Bảng: Tỷ lệ (%) giảm gốc oxy hóa tự tế bào ung thư gan HepG2 Tên mẫu Nồng độ (µg/ml) Tỷ lệ (%) giảm gốc tự 400 27,90 ± 7,69 200 17,53 ± 3,44 100 11,35 ± 1,59 400 37,42 ± 7,56 200 37,51 ± 8,67 100 22,10 ± 9,97 400 56,74 ± 2,36 200 31,84 ± 4,57 100 20,56 ± 4,96 50 4,64 ± 1,58 25 4,64 ± 6,69 EtOH Cao PE Cao EtOAc IC50 = 329,43 ± 34,87 µg/ml Cao BU Cao nước Cao PS Chứng dương (Quercetin) 400 16,61 ± 1,54 200 27,62 ± 1,58 100 8,05 ± 1,08 400 21,43 ± 2,70 200 4,11 ± 1,62 100 3,48 ± 1,15 400 15,70 ± 4,00 200 16,06 ± 4,68 100 4,80 ± 1,60 µM Chứng âm (DMSO) 65,26 ± 3,15 -7,32 ± 0,70 PL- 45 Phụ lục 4.10: Khảo sát khả gây độc tế bào Bảng: Tỷ lệ (%) tế bào chết dòng tế bào ung thư nồng độ 100µg/ml STT Tên mẫu Dịng tế bào MCF-7 HeLa NCI-H460 HepG2 Cao EtOH 10,15 ± 1,93 5,78 ± 3,74 10,24 ± 1,97 Cao PE 15,97 ± 1,42 2,58 ± 2,02 15,50 ± 2,06 -10,89 ± 3,03 Cao EtOAc 78,08 ± 0,75 39,45 ± 1,67 77,63 ± 1,08 33,77 ± 0,60 Cao Bu 16,90 ± 2,20 9,79 ± 5,24 4,79 ± 0,42 -0,71 ± 2,12 Cao nước -1,34 ± 3,41 5,13 ± 1,47 -2,95 ± 1,71 -2,17 ± 1,64 Cao PS -0,65 ± 2,93 4,35±3,66 -6,10 ± 3,79 -2,67 ± 1,59 67,23±0,29 53,78±3,20 63,50±1,63 53,97±1,48 0,05µg/l 1µg/l 0,007µg/l 0,07µg/l Camptothecin Nồng độ Camptothecin -5,07 ± 3,12 Bảng: Kết xác định IC50 cao EtAOc với dòng tế bào ung thư MCF-7 NCI-H460 Dòng tế bào Nồng độ cao EtAOc Tỷ lệ (%) tế bào chết (µg/ml) MCF-7 NCI-H460 100 78,08 ± 0,75 70 73,72 ± 0,75 55 69,88 ± 0,41 45 48,77 ± 2,88 20 16,75 ± 2,68 IC50 = 42,65 ± 1,71 (µg/ml) 100 77,63 ± 1,08 55 70,19 ± 2,46 45 61,42 ± 5,47 30 53,80 ± 2,89 20 20,86 ± 13,32 15 13,81 ± 17,30 IC50 = 34,39 ± 4,02 (µg/ml) PL- 46 Phụ lục 4.11: Khảo sát khả kích thích tăng sinh PBMC Bảng: Tỷ lệ (%) tăng sinh tế bào PBMC nồng độ khảo sát Tên mẫu Nồng độ (µg/ml) Tỷ lệ tăng sinh PBMC (%) 200 11,75±1,23 100 16,93±4,84 50 17,70±3,78 200 -12,74 ±2,26 100 -11,10±3,01 50 -9,97±4,24 200 -58,94±5,55 100 -63,63±7,17 50 -27,48±7,83 200 11,14±3,40 100 13,86±2,28 50 4,81±2,33 200 -9,16±2,84 100 -8,81±3,7 50 -8,02±2,92 200 -10,88±3,95 100 -10,38±3,47 50 -13,87±4,12 PHA 20 90,10±16,72 DMSO 0,25% -4,20±1,12 Nước 0,50% -6,73±1,83 Cao EtOH Cao PE Cao EtOAc Cao BU Cao nước Cao PS PL- 47 Phụ lục 4.12 Kết khảo sát khả kháng khuẩn cao chiết từ C pseudomilitaris DL0015 nuôi cấy Khả kháng E coli cao chiết Khả kháng P aeruginosa cao chiết Khả kháng S typhimurium cao chiết Khả kháng En faecalis cao chiết Khả kháng S aureus cao chiết Khả kháng MRSA cao chiết PL- 48 ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ XUYẾN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ HOẠT CHẤT CỦA NẤM CORDYCEPS PHÂN LẬP TẠI LANGBIANG - LÂM ĐỒNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học. .. Langbiang – Lâm Đồng nơi có nhiều khả để phát thêm chủng nấm ký sinh côn trùng, đặc biệt Cordyceps có tiềm ứng dụng y dược Từ vấn đề nêu trên, đề tài ? ?Nghiên cứu đặc điểm sinh học hoạt chất nấm. .. quốc gia phân lập Do đó, đặc tính xem marker phân tử nghiên cứu loài C militaris [199] Nghiên cứu đặc điểm di truyền sợi nấm in vitro mẫu tự nhiên cho thấy đặc tính hóa sinh học sợi nấm C sinensis