Phân tích hàm lượng kháng sinh nhóm tetracyclin trong thủy sản bằng HPLC RP HPLC

Phân tích hàm lượng kháng sinh nhóm tetracyclin thủy sản HPLC RP - HPLC Nội Dung  Đặc điểm chất phân tích  Nguồn gốc tetracyclin tồn dư thực phẩm  Chuẩn bị mẫu  Điều kiện chạy sắc ký  Kết luận Đặc điểm chất phân tích Đặc điểm chất phân tích  Tetracyclin kháng sinh phổ rộng sử dụng chăn nuôi thủy sản  Tetracyclin chia làm loại: tetracyclin (CT), oxytetracyclin (OTC) clortetracyclin (CTC)  Cấu trúc có vịng, vịng có cạnh khác gốc gắn vào vịng  Có tác dụng ức chế tổng hợp protein vi khuẩn  Được hấp thu qua đường tiêu hóa, thấm vào loại dịch thể mô, tan mạch lipuid  Giảm hấp thu ước có Fe2+, Mg2+, Al3+, Ca2+ Tác hại việc tồn dư kháng sinh  Gây dị ứng sử dụng  Tạo thể vi sinh kháng thuốc  Làm giảm đáp ứng miễn dịch  Gây ung thư  Phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật đất  Sự tồn luân chuyển nguồn gen kháng kháng sinh môi trường Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu  Cân 5g mẫu, băm nhuyễn cho vào ống ly tâm Thêm đệm McIlvaine – EDTA Nghiền 30s ly tâm 10min tốc độ 3000 vòng/phút  Lấy dịch cho vào ống ly tâm Thêm 20ml đệm, trộn đều, ly tâm 10min, 3000 vòng/phút Lấy dịch  Thêm 10ml đệm vào ống 1, ly tâm gạn dịch vào ống  Ly tâm ống 20min, 3000 vòng/phút  Lọc dịch rửa ống ly tâm lần, lần dung 2ml đệm  Chuẩn bị mẫu trắng không chứa kháng sinh  Chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi Làm dịch chiết  Chuẩn bị cột: Nối cột Sep – Pak C18 vào đầu xi lanh thủy tinh 100ml Thêm 20ml methanol, 20ml nước cất vào xi lanh loại bỏ dung dịch chảy cột  Làm dịch chiết: cho dịch chiết vào cột Tráng rửa bình 2ml dung dịch đệm Làm khơ cột khơng khí 2min Điều kiện chạy sắc ký HPLC LOẠI SẮC KÝ PHA ĐẢO RP – HPLC Pha tĩnh RP-HPLC (khơng phân cực phân cực)  Silicagel trung tính bị alkyl hóa bởi: CH3-, =C8H17=, =C18H37=  Nhân phenyl (=C6H5=), nhóm =CN…  Bề mặt khơng hay phân cực  Cỡ hạt: – 10 μm  Diện tích xốp: 100 – 500 m2/g  Chịu áp: 600bar  Kị nước Pha động RP-HPLC  Là pha động phân cực;  Ưa nước tan tốt nước;  Nước dung môi pha động;  Là dung môi hữu phân cực hỗn hợp chúng;  Hỗn hợp nước dung môi hữu Chọn Pha động  Dung môi: hỗn hợp dung dịch axit oxalic – metanol – axetonitrile  Tỉ lệ: hoà tan 1,26 g axít oxalic nước cất bình định mức 1000 ml Định mức tới vạch Thêm vào dung dịch 500 ml axetonitril 166 ml metanol Lọc đuổi khí Điều kiện phân tích  Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng  Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút  Thể tích tiêm: 60ul  Ổn định cột sắc ký 30 phút  Tiêm dịch chuẩn theo nồng độ thấp đến cao Mỗi dung dịch tiêm lần  Tiêm dung dịch mẫu thử, mẫu trắng, mẫu xác định độ thu hồi Mỗi dịch tiêm lần, tính trung bình Độ xác  Độ lặp lại lần tiêm Độ lệch chuẩn (CVS) tính theo chiều cao pic sắc ký lần tiêm dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %  Độ thu hồi (RĐộ thu hồi xác định cho lần chạy mẫu phải lớn 80 %  Đường chuẩn kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn 0,995  Đối với mẫu chứa 0,5µg/g kháng sinh nhóm TC, phải kiểm tra xác nhận kết quả bằng cách tiêm lại dịch chiết mẫu dung dịch chuẩn cột C18 chạy chế độ như cột C8 so sánh thời gian lưu píc mẫu píc chuẩn Phạm vi đo phương pháp  UV detetor loại detetor sử dụng nhiều máy HPLC UV detetor có khoảng tuyến tính rộng, thể tích chết tương đối nhỏ nên kết hohwp hiệu với HPLC Nếu cần thiết, phạm vi bước sóng mở rộng sang vùng ánh sáng nhìn thấy để phân tích chất có màu Điều kiện lọc detector  Sử dụng đầu dò hấp thu tia tử ngoại UV bước sóng 350nm  Ưu điểm: Khơng chạy nhiệt độ, có đáp ứng tuyến tính hấp thu UV với lượng mẫu chất  Nhược điểm: kén chọn loại chất phân tích Kết luận Kết luận Hàm lượng kháng sinh có mẫu tính cơ sở đường chuẩn dạng y = ax + b: C (µg/kg) = (Y-b)/a.F.1000 Trong đó: C: nồng độ các kháng sinh có mẫu, tính theo µg/kg Y: hiệu số giữa chiều cao pic của dịch chiết chiều cao pic mẫu trắng a, b: thông số củađườ ng chuẩn y = ax + b, F: hệ số pha loãng mẫu Phạm vi đo  Phương pháp sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) có phạm vi ứng dụng cao, tách chất phân cực không phân cực Đặc biệt ứng dụng cho chất vô hữu cơ, amin, aminoaxit, HCBVTV…  UV detetor loại detetor sử dụng nhiều máy HPLC UV detetor có khoảng tuyến tính rộng, thể tích chết tương đối nhỏ nên kết hợp hiệu với HPLC Nếu cần thiết, phạm vi bước sóng mở rộng sang vùng ánh sáng nhìn thấy để phân tích chất có màu  ... Đặc điểm chất phân tích  Nguồn gốc tetracyclin tồn dư thực phẩm  Chuẩn bị mẫu  Điều kiện chạy sắc ký  Kết luận Đặc điểm chất phân tích Đặc điểm chất phân tích  Tetracyclin kháng sinh phổ rộng... dư kháng sinh  Gây dị ứng sử dụng  Tạo thể vi sinh kháng thuốc  Làm giảm đáp ứng miễn dịch  Gây ung thư  Phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật đất  Sự tồn luân chuyển nguồn gen kháng kháng sinh. .. chạy sắc ký HPLC LOẠI SẮC KÝ PHA ĐẢO RP – HPLC Pha tĩnh RP -HPLC (không phân cực phân cực)  Silicagel trung tính bị alkyl hóa bởi: CH3-, =C8H17=, =C18H37=  Nhân phenyl (=C6H5=), nhóm =CN… 