Xây dựng phương pháp phân tích một số kháng sinh nhóm cephalosporin bằng điện di mao quản

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HUỆ Mã sinh viên: 1201245 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM CEPHALOSPORIN BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HUỆ Mã sinh viên: 1201245 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM CEPHALOSPORIN BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướngdẫn: ThS Nguyễn Thị Thùy Linh Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Khóa luận hoàn thành môn hóa phân tích, trường Đại học Dược Hà Nội với bảo tận tình ThS.Nguyễn Thị Thùy Linh thầy cô môn Hóa phân tích Trường Đại học Dược Hà Nội Tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người cô, người tận tình hướng dẫn tôi, dành nhiều thời gian công sức giúp đỡ trình nghiên cứu hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô toàn thể cán nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ tận tình trình thực khóa luận Cuối vô cảm ơn gia đình, bạn bè người thân động viên hết lòng giúp đỡ để hoàn thành khóa luận Hà Nội, tháng năm 2017 Sinh viên Lê Thị Huệ MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN .2 1.1 Tổng quan nhóm kháng sinh cephalosporin 1.1.1 Công thức cấu tạo, phân loại, phổ tác dụng 1.1.2.Công thức, tính chất cephalosporin amoxicillin 1.1.3 Các phương pháp phân tích định lượng cephalosporin 1.2 Tổng quan điện di mao quản 11 1.2.1 Khái niệm .11 1.2.2 Nguyên lý trình điện di mao quản 12 1.2.3 Kỹ thuật đưa mẫu tiêm mẫu .13 1.2.4 Phân loại .14 1.3 Tổng quan phƣơng pháp chuẩn nội 16 1.3.1 Khái niệm .16 1.3.2 Yêu cầu đặt với chất chuẩn nội 16 1.3.3 Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm 17 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 18 2.1.1 Nguyên vật liệu .18 2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử dung dịch làm việc.20 2.3.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện điện di 21 2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 21 2.3.4 Ứng dụng 23 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu .23 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện điện di 25 3.1.1 Khảo sát dung dịch điện ly .25 3.1.2 Khảo sát bước sóng phát 25 3.1.3 Mao quản xử lý mao quản 26 3.1.4 Khảo sát pH dung dung dịch điện ly 27 3.1.5 Khảo sát nồng độ dung dịch điện ly 29 3.1.6 Khảo sát điện đặt vào hai đầu mao quản 30 3.1.7 Khảo sát thời gian bơm mẫu 31 3.1.8 Tổng kết điều kiện tối ưu .33 3.1.9 Định tính kháng sinh điện di đồ .33 3.2 Thẩm định phƣơng pháp phân tích 35 3.2.1 Độ phù hợp hệ thống .35 3.2.2 Độ đặc hiệu 37 3.2.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 39 3.2.4 Độ lặp lại .42 3.2.5 Độ 44 3.3 Ứng dụng định lƣợng chế phẩm .46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HPLC-RP Sắc ký pha đảo (Reversed-phase high-performance liquid chromatographic) CE Điện di mao quản (Capillary electrophoresis) CZE Điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis) EOF Dòng điện thẩm (electroosmotic flow) UV-VIS Bước sóng tử ngoại –khả kiến AMOX Amoxillin CPN Cephalexin CFR Cefdinir CFM Cefixim C Nồng độ tM Thời gian di chuyển S Diện tích RSD Độ lệch chuẩn tương đối DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên Nội dung Trang bảng 1.1 Công thức, tính chất, định CPN, CFR, CFM, AMOX 1.2 Một số nghiên cứu định lượng cephalosporin HPLC 2.1 Thông tin đặc điểm loại chế phẩm phân tích 18 3.1 Tổng kết điều kiện tối ưu 33 3.2 Độ phù hợp hệ thống cephalexin 35 3.3 Độ phù hợp hệ thống cefdinir 36 3.4 Độ phù hợp hệ thống cefixim 36 3.5 Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích kháng sinh 39 cephalexin 3.6 Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích kháng sinh 40 cefdinir 10 3.7 Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích kháng sinh 41 cefixim 11 3.8 Kết đánh giá độ lặp lại mẫu kháng sinh cephalexin 43 500mg 12 3.9 Kết đánh giá độ lặp lại mẫu kháng sinh cefdinir 43 300mg 13 3.10 Kết đánh giá độ lặp lại mẫu kháng sinh cefixim 44 200mg 14 3.11 Kết đánh giá độ cephalexin 45 15 3.12 Kết đánh giá độ cefdinir 45 16 3.13 Kết đánh giá độ cefixim 46 17 3.14 Kết định lượng chế phẩm cefalexin 47 18 3.15 Kết định lượng chế phẩm cefnivid 48 19 3.16 Kết định lượng chế phẩm lecefti 49 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên Nội dung Trang hình 1.1 Công thức chung kháng sinh cephalosporin 2 1.2 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo hệ điện di mao quản 11 3.1 Điện di đồ sử dụng dung dịch đệm photphat borat 25 3.2 Phổ hấp thụ kháng sinh 26 3.3 Điện di đồ kháng sinh pH khác 28 3.4 Điện di đồ nồng độ borat 10mM, 20mM, 30mM, 40mM 30 3.5 Điện di đồ điện 10kV, 15kV, 20kV, 25kV 31 3.6 Điện di đồ bơm mẫu 6s, 8s, 10s, 12s 32 3.7 Điện di đồ kháng sinh cephalosporin điều kiện tối 33 ưu 10 3.8 Điện di đồ kháng sinh AMOX, AMOX+CPN, 34 AMOX+CFR, AMOX+CFM 11 3.9 Điện di đồ định tính kháng sinh 35 12 3.10 Điện di đồ kháng sinh chứng minh độ đặc hiệu 38 13 3.11 Đường chuẩn kháng sinh cephalexin 40 14 3.12 Đường chuẩn kháng sinh cefdinir 41 15 3.13 Đường chuẩn kháng sinh cefixim 42 16 3.14 Điện di đồ định lượng viên cefalexin 48 17 3.15 Điện di đồ định lượng viên cefnirvid 48 18 3.16 Điện di đồ định lượng viên lecefti 49 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, xã hội ngày phát triển vấn đề sức khỏe người ngày trọng đặc biệt sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe Kháng sinh nhóm thuốc quan trọng công tác phòng, chữa bệnh Các kháng sinh phân thành nhiều nhóm khác dựa vào cấu tạo hóa học (kháng sinh nhóm β-lactam, aminoglycosid, tetracyclin, quinolon, macrolid ); kháng sinh nhóm β-lactam sử dụng rộng rãi Trong nhóm βlactam kháng sinh nhóm cephalosporin sử dụng ngày nhiều Cephalosporin nhóm kháng sinh bán tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho người, thú y, phổ kháng khuẩn rộng tác dụng vi khuẩn Gr(+) Gr(-), định rộng rãi việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn nước ta Nhóm đứng thứ số 10 loại thuốc dùng nhiều để điều trị bệnh nhiễm khuẩn với doanh số 7,2 tỷ đô la năm 1999, sau penicillin nhóm kháng sinh khác[2] Hàm lượng kháng sinh chế phẩm không với hàm lượng ghi nhãn không đạt hiệu điều trị, vi khuẩn dễ nhờn thuốc, kháng thuốc, từ việc chữa trị bệnh khó khăn Vì kiểm soát chất lượng kháng sinh quan trọng cần thiết, có việc xác định hàm lượng kháng sinh chế phẩm Ở Việt Nam có nhiều công trình nghiên cứu tách định lượng đồng thời kháng sinh cephalosporin mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm môi trường, phần lớn làm sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) HPLC kỹ thuật tách chọn lọc, độ lặp lại tốt Tuy nhiên kỹ thuật phải sử dụng lượng lớn dung môi hữu cơ, giá thành phân tích cao Hiện nay, điện di mao quản kỹ thuật phát triển với số ưu điểm như: hiệu lực tách tốt, dung môi, hóa chất ít, an toàn, tiết kiệm chi phí Kỹ thuật điện di mao quản (CE) đưa vào phương pháp chung DĐVN IV[3], chuyên luận sử dụng CE chưa có nhiều Tách xác định đồng thời kháng sinh cephalosporin phương pháp điện di mao quản mẫu dược phẩm hướng nghiên cứu Vì định chọn đề tài 1.4 y = 0.008x - 0.004 R² = 0.996 1.2 Sc/Sis 0.8 0.6 0.4 0.2 0 50 100 nồng độ CFR (µg/ml) 150 200 Hình 3.12 Đường chuẩn kháng sinh cefdinir Bảng 3.7 Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích pic kháng sinh cefixim Nồng CFM độ Amoxicillin tM (phút) (µg/ml) 80,00 Cefixim SIS*102 tM (phút) (mAU.s) 4,667 SC*102 SC/SIS (mAU.s) 430,9 7,225 743,4 1,725 90,00 4,633 460,2 7,129 937,6 2,037 100,0 4,638 476,4 7,121 1067 2,239 120,0 4,604 476,1 7,088 1252 2,629 130,0 4,596 457,4 7,075 1292 2,824 150,0 4,583 452,2 7,063 1505 3,329 Phương trình hồi quy tuyến tính y=0,021x+0,015 Hệ số tương quan tuyến tính r=0,997 41 3.5 y = 0.021x + 0.015 R² = 0.995 Sc/Sis 2.5 1.5 0.5 0 50 100 nồng độ CFM (µg/ml) 150 200 Hình 3.13 Đường chuẩn kháng sinh cefixim Từ đồ thị cho thấy có mối quan hệ tuyến tính chặt chẽ nồng độ với tỷ lệ diện tích chất phân tích với chất chuẩn nội khoảng nồng độ từ 80 µg/ml đến 150 µg/ml (chất chuẩn nội 200 µg/ml) Đường hồi quy có dạng đường thẳng có hệ số tương quan R>0,995 (hay R2>0,99) 3.2.4 Độ lặp lại Độ lặp lại phương pháp xác định mẫu thử song song mẫu với điều điện di, ngày Chuẩn bị thử cephalexin: Cân xác lượng bột viên tương ứng với khoảng 0,01g cephalexin cho vào bình định mức 10ml (± 0,025 ml) Thêm khoảng 0,5 ml methanol lắc nhẹ phút thêm khoảng 6ml nước loại ion Đem siêu âm 15 phút, sau bổ sung nước loại ion tới vạch Lọc qua giấy lọc để loại bỏ tá dược Khi dung dịch có nồng độ cephalexin khoảng 1000 µg/ml Sau đem pha loãng để nồng độ cephalexin khoảng 100 µg/ml (lượng chuẩn nội thêm vào 200 µg/ml) Dung dịch lọc qua màng lọc 0,2 µm trước chạy điện di Mẫu thử cefdinir, cefixim chuẩn bị tương tự 42 Kết khảo sát độ lặp lại trình bày bảng 3.8; 3.9; 3.10 Bảng 3.8 Kết đánh giá độ lặp lại mẫu kháng sinh cephalexin500mg STT mcân (g) Amoxicillin tM Cephalexin SIS*102 ST/SIS ST*102 tM Nồng độ Hàm (µg/ml) lượng (mg) (phút) (mAU.s) (phút) (mAU.s) 0,0112 5,037 359,2 5,267 499,3 1,390 100,4 502,3 0,0114 4,967 462,8 5,188 653,3 1,412 101,9 501,1 0,0127 4,979 441,4 5,204 696,1 1,577 113,7 501,9 0,0117 4,975 456,2 5,200 662,0 1,451 104,7 501,6 0,0127 4,967 463,8 5,192 731,5 1,577 113,7 501,9 0,0104 4,983 417,4 5,204 535,1 1,282 92,65 499,3 Trung bình 501,4 RSD(%) 0,18 Bảng 3.9 Kết đánh giá độ lặp lại mẫu kháng sinh cefdinir 300mg STT mcân (g) Amoxicillin Cefdinir ST/SIS tM SIS*102 ST*102 (phút) (mAU.s) (phút) (mAU.s) tM Nồng độ Hàm (µg/ml) lượng (mg) 0,0199 5,229 358,7 6,254 313,7 0,8750 109,8 301,9 0,0182 5,100 476,6 5,867 378,8 0,7950 99,84 300,1 0,0190 5,075 492,2 5,850 408,4 0,8300 104,2 300,0 0,0166 5,013 478,2 5,767 340,9 0,7130 89,62 295,3 0,0165 5,008 481,9 5,758 340,8 0,7070 88,90 294,7 0,0181 5,063 363,7 5,854 287,0 0,7890 99,14 299,6 Trung bình RSD(%) 43 298.6 0,97 Bảng 3.10 Kết đánh giá độ lặp lại mẫu kháng sinh cefixim 200mg STT mcân (g) Amoxicillin tM ST/SIS Nồng độ Hàm Cefixim SIS*102 tM ST*102 (phút) (mAU.s) (phút) (mAU.s) (µg/ml) lượng (mg) 0,0164 5,279 422,0 8,875 987,3 0,0167 5,279 351,7 8,925 814,0 2,314 109,5 199,1 0,0155 5,250 397,5 8,867 854,8 2,150 101,7 199,2 0,0150 5,225 395,9 8,821 826,1 2,086 98,65 199,7 0,0156 5,237 404,0 8,846 895,6 2,217 104,8 204,0 0,0150 5,217 448,1 8,783 942,9 2,104 99,48 201,4 Trung bình RSD(%) 2,339 110,7 204,9 201,4 1,27 Với điều kiện điện di lựa chọn, kết định lượng kháng sinh nhóm cephalosporin chế phẩm có RSD