THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ GEN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ GEN 3-2021 Lưu hành nội GIỚI THIỆU Mục đích Giúp sinh viên thực hồn thiện quy trình tái tổ hợp chuyển gen vi sinh vật, qua hiểu rõ giảng lý thuyết sinh học phân tử công nghệ gen bước đầu tiến hành kỹ thuật thao tác gen Yêu cầu - Hiểu nguyên lý chung quy trình tái tổ hợp chuyển gen vi sinh vật; - Hiểu rõ nguyên lý bước thí nghiệm; - Thao tác thành thạo, cẩn thận; - Đi học đầy đủ, giờ; - Thực nội quy phịng thí nghiệm; - Ghi lại đầy đủ bước thí nghiệm thực tế, kết nhóm để viết thu hoạch Bố trí thí nghiệm Tuần-1: Lý thuyết - Chuẩn bị dụng cụ môi trường thí nghiệm Tuần-2: Tách chiết plasmid vector - Điện di kiểm tra plasmid thu Tuần -3: Phản ứng PCR gene đích - Điện di sản phẩm PCR - Tinh sản phẩm PCR - Điện di kiểm tra sản phẩm PCR sau tinh Tuần -4, 5: Tái tổ hợp gene vào vector - Cắt sản phẩm PCR plasmid với RE - Điện di kiểm tra sản phẩm cắt - Tinh sản phẩm PCR plasmid vector sau cắt RE - Phản ứng nối gen vào vector Tuần – 6, 7: Biến nạp sàng lọc - Chuẩn bị tế bào khả biến - Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli - Chuẩn bị môi trường sàng lọc - Cấy sàng lọc Tuần -8: Đánh giá dòng E.coli biến nạp PCR khuẩn lạc - Gửi sản phẩm PCR cho giải trình tự DNA - Tin sinh học - Nộp báo cáo thực hành - Q & A; Vệ sinh Tuần -9: Kiểm tra môn học/Vấn đáp Sơ đồ chung Hình-1: Sơ đồ tồn thí nghiệm tạo dòng gen g56 thực khuẩn thể IP008 vào pUC57, 10 kỹ thuật Tuần 1: LÝ THUYẾT Lý thuyết: giảng Powerpoint Chuẩn bị dụng cụ mơi trường thí nghiệm - Các loại đầu tip ống Eppendorf, ống phản ứng PCR; - Nước loại ion; - Môi trường Luria Broth (LB) có thành phần sau: Thành phần Khối lượng (cho lít) NaCl 10g Peptone 10g Cao nấm men 5g pH 7.0 Tất dụng cụ môi trường hấp tiệt trùng 121 oC, 15 phút TUẦN 2: TÁCH CHIẾT PLASMID VECTOR Các nội dung thí nghiệm chính: - Tách chiết plasmid vector pUC57 - Điện di kiểm tra độ lớn plasmid thu Chuẩn bị - Nuôi cấy vi khuẩn DHα (5 ml) mang plasmid pUC57 môi trường LB lỏng (1% v/v giống) có chứa 5μl kháng sinh ampicillin (100mg/μl), lắc 150 rpm, ủ 370C, qua đêm (1216 giờ) - lít dung dịch đệm TAE 10X: 48.5 g Tris-base + 11.4 mL glacial acetic acid + 20 mL 0.5M EDTA (pH 8.0) - Dung dịch nạp mẫu 6X (loading buffer) - Agarose - Thang DNA chuẩn (DNA ladder): mua từ nhà cung cấp NEB (0.1 kb-2 kb) Kít tách chiết plasmid: GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo) Tiến hành 3.1 Tách chiết plasmid pUC57 Trình tự thực hiện: - Bước 1: Ly tâm khoảng 1.5 ml dịch E.coli/pUC57 (sau tăng sinh) 12000 rpm oC, phút sử dụng ống eppendorf 2mL Hút bỏ dịch sử dụng pipetman 1000μl Lặp lại bước ba lần để ly tâm hết 4.5 mL dịch nuôi cấy vi khuẩn - Bước 2: Huyền phù tủa hoàn toàn 250μl Resupension Solution, sử dụng Vortex - Bước 3: Thêm 250μl Lysis Solution Trộn lên- xuống nhẹ nhàng lần pipetman Ủ nhiệt độ phòng, phút - Bước 4: Thêm 350μl Neutralization Solution Trộn lên-xuống nhẹ nhàng lần pipetman - Bước 5: Ly tâm 13000 rpm, phút nhiệt độ phòng - Bước 6: Lấy 800μl dịch vào eppendorf 1.5mL Ly tâm 13000 rpm, phút nhiệt độ phòng - Bước 7: Nạp 700μl dịch vào cột GeneJET Ly tâm 13000 rpm, phút nhiệt độ phòng Loại bỏ dịch - Bước 8: Thêm 500μl Washing Solution Ly tâm 13000rpm, phút nhiệt độ phòng Loại bỏ dịch - Bước 9: Lặp lại bước Phơi khơ cột 30 phút nhiệt độ phịng - Bước 10: Chuyển cột GeneJET vào Effpendort 1.5 mL Thêm 50μl Elution Buffer, ủ phút nhiệt độ phòng Ly tâm 13000rpm, phút nhiệt độ phòng Dung dịch chứa plasmid rửa khỏi cột thu ống Effpendort - Lấy μL để điện di kiểm tra Phần thể tích DNA cịn lại trữ tủ -20 oC 3.2 Điện di kiểm tra sản phẩm plasmid vector thu A Chuẩn bị gel agarose 1%: - Cân 0.7 g agarose bình erlen 250ml sạch, thêm vào 70 ml đệm TAE 1X - Đặt vào lị viba, đun cho nóng chảy hồn toàn (lắc vài lần), lấy để nguội đến khoảng 40-50 oC - Đổ dung dịch vào khuôn đổ gel - Đợi đến gel đơng hồn tồn (sau 30 phút), tháo lược ra, đặt gel vào bồn điện di Gel chuẩn bị từ ngày trước phải ngâm TAE - Đổ dung dịch TAE 1X vào bồn điện di đến vượt bề mặt gel agarose B Chuẩn bị mẫu DNA - Trên miếng paraffin nhỏ: trộn μL nước cất, 1μL 6X loading buffer, μL mẫu khuôn DNA C Nạp mẫu điện di - Nạp hết μL mẫu trộn miếng paraffin cho giếng - Nạp μL thang DNA chuẩn cho gel agarose - Đóng nắp buồng điện di, cắm điện cực (chú ý chiều điện cực vị trí gel) - Chạy điện di với điện 110V 25 phút (hoặc quan sát vạch màu xanh thứ chạy đến khoảng gel) D Quan sát vạch DNA - Đảm bảo ngắt nguồn điện!! - Lấy gel khỏi buồng điện di Quan sát vạch DNA buồng UV chụp hình để lưu lại kết 3.3 Yêu cầu tường trình Giải thích bước q trình tách chiết plasmid? Nồng độ agarose có liên quan đến độ lớn plasmid DNA cần điện di? Thang DNA nên có thành phần để phù hợp với độ lớn plasmid cần xác định? Gắn hình ảnh gel vào tường trình cho biết cách xác định kích thước vạch DNA plasmid? Giải thích kết xuất vạch DNA không mong muốn TUẦN 3: CHUẨN BỊ ĐOẠN DNA CẦN CHÈN Các nội dung thí nghiệm - Phản ứng PCR gene đích (khuếch đại gene mục tiêu g56 (từ genome thực khuẩn thể IP008) cần tạo dòng dựa cặp mồi chuyên biệt; - Điện di sản phẩm PCR; - Tinh sản phẩm PCR; - Điện di kiểm tra sản phẩm PCR sau tinh Chuẩn bị - Các vật liệu dung dịch cho phản ứng PCR (mồi PCR kits mua từ Phusa.Biochem) - Các vật liệu dung dịch cho chạy điện di sản phẩm PCR: agarose, thang DNA 0.2 kb10 kb mua từ nhà cung cấp Bioline Tiến hành 3.1 Đặt phản ứng PCR - Lấy hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR, để rã đông đá lạnh; - Cài đặt chương trình PCR máy PCR sau: - Chu trình Nhiệt độ Thời gian Chu kì Tiền Biến tính 950C phút Biến tính 950C 30 giây Bắt cặp 550C 30 giây Kéo dài 720C phút Ổn định 720C phút 30 Lần lượt hút thành phần phản ứng vào ống PCR loại 0,2 ml sau: (chuẩn bị sẵn stock thành phần phản ứng) Chú ý: Trộn dung dịch phản ứng PCR thực đá lạnh H2 O Mồi xuôi Mồi ngược DNA mẫu (template) Dream Taq PCR Master Mix (2X) Tổng thể tích - 11 µl 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl (dịch nuôi thực khuẩn thể) 12.5 µl 25 µl Trộn nhẹ nhàng pipetman (3-5 lần); Tiếp tục để đá lạnh; Mỗi nhóm làm tương tự phản ứng âm tính (sử dụng 0.5 µl nước deionized tiệt trùng thay 0.5 µl DNA khn); Khởi động (Start) chương trình PCR cài đặt; Khi nhiệt độ bắt đầu đạt 95 oC, nhanh chóng đặt ống phản ứng PCR vào máy; 3.2 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR A Chuẩn bị gel agarose 1.5%: - Cân 1.05 g agarose bình erlen 250-ml sạch, thêm vào 70 ml đệm TAE 1X - Đặt vào lị vi sóng, đun cho nóng chảy hoàn toàn (lắc vài lần), lấy để nguội đến khoảng 40-50 oC - Đổ dung dịch vào khuôn đổ gel - Đợi đến gel đơng hồn tồn (sau 30 phút), tháo lược ra, đặt gel vào bồn điện di Gel chuẩn bị từ ngày trước phải ngâm TAE - Đổ dung dịch TAE 1X vào bồn điện di đến vượt bền mặt gel agarose B Chuẩn bị mẫu DNA - Sau hoàn thành phản ứng PCR, lấy 2µl sản phẩm chạy điện di kiểm tra - Trên miếng paraffin nhỏ: trộn μL nước cất, 1μL 6X loading buffer, μL mẫu khuôn DNA C Nạp mẫu điện di - Nạp hết μL mẫu trộn miếng paraffin cho giếng - Nạp μL thang DNA chuẩn cho gel agarose - Đóng nắp buồng điện di, cắm điện cực (chú ý chiều điện cực vị trí gel) - Chạy điện di với điện 110V 25 phút (hoặc quan sát vạch màu xanh chạy đến khoảng gel) D Quan sát vạch DNA - Đảm bảo ngắt nguồn điện!! - Lấy gel khỏi buồng điện di - Quan sát vạch DNA buồng UV chụp hình để lưu lại kết 3.3 Tinh sản phẩm PCR Bước 1: Thêm lượng thể tích Binding Buffer với thể tích mẫu DNA vào eppendorf chứa mẫu DNA Trộn Chú ý: Nếu hỗn hợp màu vàng pH tối ưu Nếu màu cam tím thêm 10uL Natri acetate 3M, pH 5.2 trộn đều, màu hỗn hợp chuyển vàng Nếu kích thước đoạn tinh