BÁO cáo TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ GENE đề tài kỹ thuật gene nghiên cứu hệ vi sinh vật ở người

Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Trường Đại học Bách Khoa Khoa Kỹ thuật Hóa học BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ GENE Đề tài: Kỹ thuật gene nghiên cứu hệ vi sinh vật người GV hướng dẫn: Hồng Anh Hồng Nhóm: Thái Đỗ Đăng Khoa 1711 Nguyễn Lê Nam Phương 1811163 Trần Phạm Thiên Phương 1811165 Huỳnh Thị Kim Trang 1811283 Lý Quang Phương Năm học: 2020 – 2021 1813 MỤC LỤC I Giới thiệu I.1 Hệ vi sinh vật người I.2 Lịch sử nghiên cứu hệ vi sinh vật người I.3 Tầm quan trọng việc nghiên cứu hệ vi sinh vật người II Các kỹ thuật gene nghiên cứu hệ vi sinh vật người II.1 Giải trình tự gene thị (Marker gene survey) II.2 Giải trình tự toàn hệ gene (Whole genome sequencing) II.3 Nghiên cứu đa hệ gene (Metagenomic) 11 II.4 Single-Cell Genomic 11 II.5 Metatranscriptomics 12 III Quy trình thực 16 IV Tiềm năng, thách thức định hướng tương lai 18 IV.1 Tiềm 18 IV.2 Thách thức 18 IV.3 Định hướng tương lai 19 DANH MỤC BẢNG BIỂU I Giới thiệu I.1 Hệ vi sinh vật người Hệ vi sinh vật người tập hợp vi sinh vật bao gồm virus, sinh vật nhân sơ (vi khuẩn, vi khuẩn cổ) sinh vật nhân chuẩn (nấm, động vật nguyên sinh, protis) tìm thấy vị trí thể người (da, đường ruột, phổi,…) Một vài ước tính cho thấy hệ vi sinh vật người có tổng cộng từ 900 – 1000 loài khác nhau, tạo nên sưu tập genome vi sinh vật vô đa dạng Hệ vi sinh vật khác biệt cá nhân chí phần thể người Các vi sinh vật định cư nhiều vị trí khác thể người, nơi chúng thích nghi với đặc điểm cụ thể phận Vi khuẩn kị khí chiếm ưu đường tiêu hóa, vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối sống đường hô hấp, khoang mũi bề mặt da Các sinh vật cư ngụ thể người thích nghi tốt với hệ thống miễn dịch, tương tác sinh học sinh vật với hệ thống miễn dịch theo thời gian Thông thường thể người khoẻ mạnh khơng có vi sinh vật tồn phận máu, não, cơ, dịch tuỷ não mà thường xuất vị trí da, mắt (niêm mạc), mũi (đường hô hấp), khoang miệng, tai, đường tiết niệu,… Hệ vi sinh vật thể người chia làm nhóm theo thời gian chúng tồn tại:  Vi sinh vật cư ngụ tồn thể người  Vi sinh vật tạm thời sống thể người khoảng thời gian (từ vài đến vài tháng) sau chúng di chuyển chết Chúng tồn lâu dài thể người nhiều lý do, bao gồm:  Sự cạnh tranh với loại vi sinh vật khác  Bị loại bỏ tế bào miễn dịch thể  Những thay đổi hoá học hay học thể Vị trí Miệng Ống tiêu Vi sinh vật Actinomyces naeslundii, Bifidobacterium dentium, Streptococcus salivarius, Streptococcus oralis, Streptococcus mutants, Staphylococcus epidermidis,… Bacteroides vulgatus, Eubacterium aerofaciens, hóa Ruột Bacteroides uniformis, Fusobacterium prausnitzii, Bifidobacterium adolescentis, Ruminococcus bromii, Bacteroides stercoris, Bifidobacterium longum,… Actinobacteria (Corynebacterium sp., Propionibacterium sp., Micrococcus sp., Brevibacterium sp ); Firmicutes ( Staphylococcus sp., Streptococcus sp.); Da Proteobacteria ( Acinetobacter sp., Methylobacterium sp ) Lactobacilli, Actinomyces sp., Aerococcus sp., Anaerococcus sp., Arcanobacterium sp., Atopobium sp., Âm đạo Bacteroides sp., , Bifidobacterium sp., Blastococcus sp., Citrobacter sp., Enterobacter sp., Escherichia sp., Peptostreptococcus sp., Proteobacteria sp., Rhizobialis sp., Salmonella sp., Shigella sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp … Khoang mũi Đường Vòm hầu Staphylococcus spp., Propionibacterium spp., Corynebacterium spp., Moraxella spp., Streptococcus spp Moraxella spp., Staphylococcus spp., Corynebacterium spp., Dolosigranulum spp., Haemophilus spp., Streptococcus spp., hô hấp Khẩu hầu Phổi Streptococcus spp., Rothia spp., Veillonella spp., Prevotella spp., Leptotrichia spp Prevotella spp., Veillonella spp., Streptococcus spp., Tropheryma whipplei Bảng Một số vi khuẩn tồn thể người vị trí chúng Hệ vi sinh vật người xem quan khác thể sản phẩm chúng sản sinh, phản ứng chúng tới môi trường tương tác chúng tới phận lại Các vi sinh vật tồn người tác động đến vật chủ theo nhiều cách khác Đa số chúng có lợi góp phần xây dựng nên đặc trưng sinh lý thể Các vi sinh vật cần thiết cho phát triển thể, liên quan đến hệ miễn dịch dinh dưỡng người Ví dụ số chủng vi khuẩn lactic tìm thấy đường ruột người có khả hấp thu chất dinh dưỡmg từ thức ăn để hỗ trợ trình phân giải chúng ngăn chặn xâm nhập hại khuẩn Hệ vi sinh vật khoang miệng góp phần tạo khả miễn dịch thơng qua việc kích thích sinh kháng thể mức thấp phản ứng chéo với mầm bệnh Ngoài chúng cịn giúp chống lại vi sinh khơng gây độc tố cách sản sinh acid béo ức chế, peroxide,… Lactobacilli âm đạo phụ nữ sản sinh lactic acid hydrogen peroxide cân pH, ức chế vi khuẩn có hại xâm nhập, từ làm giảm nguy viêm âm đạo Tuy nhiên số lồi khác có khả gây hại cho thể mà chúng có mặt Ví dụ Staphylococcus aureus (vi khuẩn tụ cầu vàng) gây nhiễm khuẩn huyết xâm nhập vào máu qua vết thưởng hở da Nhiễm khuẩn tụ cầu vàng loại nhiễm khuẩn nặng, gây ổ áp xe, viêm nội tâm mạc hay viêm tắc tĩnh mạch Một số vi sinh vật khoang miệng Treponema denticola gây phá hủy nướu mô nâng đỡ dẫn tới bệnh viêm nha chu hay Streptococcus mutans có khả lên men đường thành lactic acid làm tan men răng, gây sâu Một số bệnh tự miễn tiểu đường, viêm khớp dạng thấp, đa xơ cứng, loạn dưỡng cơ,… có liên quan tới rối loạn chức hệ vi sinh vật Các vi sinh vật gây bệnh tích tụ theo thời gian, thay đổi hoạt động gene hoạt động trao đổi chất, dẫn đến phản ứng miễn dịch bất thường chất mơ bình thường thể I.2 Lịch sử nghiên cứu hệ vi sinh vật người Ngay từ năm 1680, Antonie van Leewenhoek so sánh ghi chép lại khác biệt hệ vi sinh vật khoang miệng phân mình, từ cá nhân khỏe mạnh mắc bệnh Có thể xem khởi điểm cho nghiên cứu đa dạng hệ vi sinh vật người Vào năm 1880, bác sĩ nhi khoa người Áo – Theodor Escherich quan sát thấy loại vi khuẩn (sau xác định Escherichia coli) hệ vi khuẩn đường ruột trẻ em khỏe mạnh trẻ em mắc bệnh tiêu chảy Trong năm tiếp theo, nhà khoa học mô tả số lượng vi sinh vật phân lập từ thể người, bao gồm 1898 lồi Veillonella parvula (một vi khuẩn có mặt khoang miệng, hệ tiêu hóa, đường tiết niệu đường hơ hấp trên), 1900 lồi Bifidobacteria Trong suốt kì XX, số vi sinh vật khác phân lập từ đường mũi, khoang miệng, da, đường tiêu hóa đường niệu sinh dục Mặc dù nhóm vi sinh vật này, kể từ lần phát hiện, định nghĩa theo nhiều cách khác nhau, khái niệm hệ vi sinh vật người nghiên cứu chuyên sâu bắt đầu hình thành phát triển từ thập kỉ kỉ XXI Những hiểu biết hệ vi sinh vật người mở rộng đáng kể từ sau năm 2007, dự án Human Microbiome Project (HMP) – dự án nhằm mô tả đặc điểm cộng đồng vi sinh vật tìm thấy người xác định vai trị loài sức khỏe bệnh người – khởi động I.3 Tầm quan trọng việc nghiên cứu hệ vi sinh vật người Nhiều nghiên cứu cân hệ vi sinh vật thể làm tăng nhạy cảm vật chủ nhiễm trùng, chất chúng phụ thuộc vào vị trí liên quan Sự đa dạng độc đáo hệ vi sinh vật người giải thích cho hoạt động trao đổi chất chức cụ thể vi sinh vật vị trí thể Người ta nhận hệ vi sinh vật người gây ảnh hưởng đến tâm trí sức khỏe thể, góp phần tăng cường suy giảm chức trao đổi chất miễn dịch, trở thành phần nguyên nhân gây nhiều bệnh bao gồm ung thư, bệnh chuyển hóa tim mạch, dị ứng béo phì Ngun nhân gây bệnh hiểu phần Tuy nhiên, chất dinh dưỡng, chất chuyển hóa vi sinh vật ngày xem nhân tố ảnh hưởng chính, chế gây bệnh hoàn chỉnh chưa rõ ràng Do đó, điều quan trọng phải hiểu rõ vi sinh vật hoạt động chúng người ảnh hưởng chúng đến sức khỏe bệnh tật Những nghiên cứu hệ vi sinh vật người genome chúng kì vọng tiếp tục làm sáng tỏ khía cạnh sinh lý người, đặc biệt dinh dưỡng Những hiểu biết sâu sắc nhu cầu dinh dưỡng làm thay đổi khuyến nghị chế độ ăn uống yêu cầu sản xuất thực phẩm, từ góp phần nâng cao chất lượng bữa ăn sức khỏe người Ngồi ra, thơng tin chi tiết vi sinh vật tồn thể người giúp phát triển kĩ thuật chẩn đoán liệu pháp điều trị cho nhiều bệnh khác nhau, thúc đẩy tiến ngành sản xuất dựa sản phẩm thu nhận từ vi sinh vật II Các kỹ thuật gene nghiên cứu hệ vi sinh vật người Mặc dù số lượng nghiên cứu hệ vi sinh vật người gene chúng ngày bùng nổ, dường bí ẩn thể người Đơi chúng xem gene thứ hai người, với số lượng áp đảo gene người khoảng từ 100-200 lần (riêng đường ruột có triệu gene vi khuẩn) Sự phức tạp cộng đồng vi sinh vật người khiến cho việc nghiên cứu chúng trở nên đầy khó khăn thách thức Trong 100 năm, nhà vi sinh vật học sử dụng phương pháp ni cấy truyền thống phịng thí nghiệm để phân lập khuẩn lạc nghiên cứu dịng Nhờ nỗ lực to lớn đó, tính riêng đường tiêu hóa người có khoảng 100 lồi vi khuẩn khác ni cấy thành cơng (McPherson, 2014), tồn đặc điểm chúng khám phá chức gene trở thành tảng cho kĩ thuật sinh học phân tử đại sau Cách tiếp cận cho phép người khai thác tiềm vi sinh vật cho nhiều mục đích điều trị vi sinh vật ni cấy cho thấy đặc tính có lợi Tuy nhiên, có tới hàng trăm lồi khác nhau, việc liệt kê diện chúng kĩ thuật vi sinh truyền thống bất khả thi nhiều lý hạn chế khả ni cấy chúng phịng thí nghiệm Có nhiều vi sinh vật chưa phân lập hay nuôi cấy trước đây, khiến việc nuôi cấy trở nên thách thức chúng cần tới mơi trường điều kiện đặc biệt để phát triển Để việc nghiên cứu hệ vi sinh vật người trở nên dễ dàng hơn, việc phân tích gene vi sinh vật đặc tính chúng thực với hướng tiếp cận (có không phụ thuộc vào nuôi cấy) thông qua việc giải trình tự đoạn gene với trợ giúp kĩ thuật giải trình tự Sanger hay kĩ thuật giải trình tự hệ (next generation sequencing – NGS) II.1 Giải trình tự gene thị (Marker gene survey) Một số hướng tiếp cận thường sử dụng giải trình tự gene thị, với gene thị sử dụng phổ biến gene SSU rRNA (small subunit ribosomal RNA): 16S rRNA vi khuẩn vi khuẩn cổ, 18S rRNA sinh vật nhân chuẩn Mỗi tế bào vi khuẩn chứa khoảng từ 5-10 copy 16S rRNA, gene gồm khoảng 1500bp chứa vùng bảo tồn vùng biến đổi xen kẽ Vùng bảo tồn giống tất vi khuẩn, vùng biến đổi có mức độ khác biệt khác theo vi khuẩn khác nhau, theo đặc trưng chi lồi Chính đặc điểm khiến cho 16S rRNA trở thành gene thị hiệu cho việc định danh vi khuẩn mức độ lâm sàng giải trình tự 18S rRNA có tính chất tương tự Hình Cấu trúc gene 16S rRNA Nguyên tắc việc giải trình tự gene thị đoạn gene SSU rRNA DNA từ mẫu mô người người khuếch đại phản ứng PCR, với mục tiêu tạo hỗn hợp amplicon có nguồn gốc từ nhiều lồi vi khuẩn có mặt mẫu ban đầu Sau chúng giải trình tự đồng loạt Kết thu thường phân loại thành đơn vị phân loài (Operational Taxonomic Units – OTUs) dựa đoạn trình tự giống Ban đầu, người ta sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho vùng siêu bảo tồn gene trình PCR phương pháp Sanger dùng để giải trình tự tồn đoạn gene 16S rRNA Tuy nhiên phương pháp dễ gây sai sót gene 16S rRNA tương đối dài yêu cầu từ 2-3 lần đọc để giải tồn trình tự Do đoạn phải có độ tương đồng từ 98.7-99% để phân loại vào OTUs theo cấp loài (Stackbrandt & Ebers, 2011) Đồng thời phương pháp giải trình tự Sanger vấp phải giới hạn việc lấy mẫu chi phí cơng sức cần để thực Sự đời kĩ thuật NGS cho phép việc giải trình tự lần nhiều đoạn gene, nhiên độ dài đoạn lại bị giới hạn Vì vậy, người ta chuyển hướng tập trung vào giải trình tự vùng siêu biến thay tồn đoạn gene Yêu cầu độ tương đồng đoạn giảm xuống khoảng 97% để phân loại vào OTUs Nhưng nghiên cứu (Jinuk Jeong et al., 2021) việc giải trình tự đoạn ngắn cho kết xác giải trình tự tồn đoạn gene 16S rRNA Bên cạnh gene SSU rRNA, giải trình tự gene thị cịn áp dụng cho số gene chức phổ biến hệ vi sinh vật (Walket et al., 2014) Nguyên tắc thực tương tự, với cặp mồi PCR đặc hiệu cho vùng bảo tổn có mặt đoạn gene chức Phương thức sử dụng để định danh nhóm vi khuẩn sản xuất butyrate/propionate mới, thu nhận từ đại tràng người (Louis et al., 2010; Reichardt et al., 2014; Brulc et al., 2011) II.2 Giải trình tự tồn hệ gene (Whole genome sequencing) Giải trình tự tồn hệ gene sử dụng để mơ tả toàn genome vi sinh vật, kết hợp với việc giải trình tự gene thị, cho phép thu thập thêm nhiều thông tin chi tiết vi sinh vật có mặt mẫu ban đầu (thơng tin di truyền, chức năng,…), đồng thời giải khó khăn gặp phải vi sinh vật có gene SSU rRNA tương tự Ví dụ hai dịng Escherichia coli O15:H7 K-12 có trình tự gene 16S rRNA E coli lại khác hàng trăm gene khác Để giải trình tự toàn hệ gene, người ta áp dụng phương pháp giải trình tự shotgun Genome vi sinh vật (có kích thước lớn) cắt ngẫu nhiên thành đoạn DNA có kích thước nhỏ để giải trình tự riêng rẽ sau lắp ráp lại thành contigs thơng qua việc tìm đoạn chồng chéo lên dựa liệu genome có sẵn (nếu có) xếp hồn tồn Phương pháp u cầu phải có lượng lớn DNA, thường phải ni cấy tế bào trước tách chiết gene Haemophilus influenzae vi khuẩn có genome giải trình tự hoàn toàn (Fleischmann et al., 1995) Trước việc giải trình tự thực phương pháp Sanger truyền thống Nhưng để hoàn thành genome vi khuẩn cần đầu tư đến hàng trăm nghìn dollar với thời gian làm việc kéo dài nhiều năm liền Sự phát triển kĩ thuật giải trình tự đại khiến công việc trở nên nhanh chóng với chi phí rẻ hàng nghìn lần Hiện nay, kĩ thuật giải trình tự đa kênh (multiplex sequencing) Illumina cho phép giải trình tự nhiều đoạn DNA khác lần thông qua việc gắn barcode đặc trưng cho đoạn, nhờ mà mẫu trộn lại với nhau, tăng số lượng mẫu lần chạy mà khơng làm tăng đáng kể chi phí hay thời gian thực Hình Nguyên tắc phương pháp giải trình tự shotgun Dự án MetaHIT sử dụng phương pháp giải trình tự shotgun liệu genome sẵn có để phân loại vi sinh vật vào enterotype (một phương thức phân loại sinh vật sống dựa thành phần vi khuẩn hệ vi sinh vật đường ruột chúng) Kết thu nhận gợi ý hệ vi sinh vật người tồn trạng thái khác Tuy nhiên mối liên hệ việc với điều kiện mơi trường, tình trạng sức khỏe hay thơng tin di truyền chưa làm rõ II.3 Nghiên cứu đa hệ gene (Metagenomic) Metagenomic trình phân tích chung quần xã vi sinh vật cách mẫu lấy trực tiếp từ mơi trường, chức cấu trúc gene Khi nghiên cứu đa hệ gene, người ta giải trình tự toàn genome vi khuẩn, vi khuẩn cổ, vi sinh vật eukaryote virus, giải trình tự gene thị/gene chức vi sinh vật Metagenomic xem giải pháp hiệu bổ sung cho hai hướng tiếp cận nêu Nhưng so với phương pháp phân tích tồn hệ gene, metagenomic có ưu cần lấy mẫu trực tiếp từ môi trường mà không cần nuôi cấy để tách chiết lượng lớn DNA Mặc dù vậy, chi phí cho việc xử lý số lượng lớn thông tin di truyền mẫu tự nhiên không rẻ Ngồi ra, hệ thống vi tính để xếp lắp ráp đoạn DNA shotgun đòi hỏi nguồn tài nguyên nhân lực có đầy đủ chuyên môn để đạt hiệu cao Các yếu tố góp phần khiến cho mẫu phân tích metagenomic bị giới hạn lượng Một yếu tố bất lợi khác phương pháp metagenomic khơng thể phân biệt liệu vi khuẩn tìm thấy thể người sống sót, hay bị ức chế thể vật chủ thuốc kháng sinh khác Tuy nhiên bất lợi giảm thiểu việc áp dụng nhiều phương pháp khác, bao gồm phân tích transcriptome, phân tích biểu gene proteomic, metabolomic liệu chuyển hóa lượng Các phương pháp phân tích thu nhận từ tế bào vi sinh vật sống Metagenomic kỳ vọng dẫn đầu số phương pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm Các nghiên cứu tương lai hy vọng nâng cao hiệu trình giải trình tự hệ vi sinh vật người, để có bước phát triển xa lĩnh vực công nghệ sinh học, y học môi trường II.4 Single-Cell Genomic Bởi metagenomic cho phép giải trình tự lượng mẫu có giới hạn, đó, việc phân loại vi sinh vật có có mật số nhỏ mẫu mơi trường vơ khó khăn Một hướng tiếp cận khác nghiên cứu phát triển phân tích hệ gene đơn bào (Single-Cell Genomic – SCG) SCG sử dụng để nghiên cứu tính cá thể tế bào Đây coi hướng bổ trợ đắc lực cho việc nghiên cứu đa hệ gene, có hiệu cao giải mã genome vi sinh vật không nuôi cấy Để thực SCG, tế bào vi sinh vật lập khỏi mơi trường mẫu, sau DNA chúng khuếch đại kỹ thuật khuếch đại toàn genome (whole genome amplification – WGA) Kỹ thuật (WGA) bao gồm nhiều phương pháp khác như: Degenerate Oligonucleotide Primed PCR (DOP-PCR), khuếch đại đẳng nhiệt (iisothermal amplification, hay gọi Multiple displacement amplification – MDA), phương pháp lai (sử dụng kit PicoPLEX, MALBAC) Trong MDA phương pháp thường sử dụng để khuếch đại genome vi sinh vật Chỉ từ tế bào, khuếch đại tạo số lượng lớn DNA đủ để trình giải trình tự shotgun trở nên khả thi dễ dàng Bằng việc kết hợp SGC với kỹ thuật chọn lọc tế bào đích, phương pháp lai huỳnh quang chỗ (fluorescent in situ hybridisation), dùng đầu dò đồng vị bền (stableisotope probing – SIP), kỹ thuật vi quang phổ Raman (Raman microspectrocopy) nhà nghiên cứu phục hồi số tế bào đặc trưng có nguồn gốc từ nguồn phát sinh loài cụ thể SCG hỗ trợ cho metagenomic cách cho phép khôi phục thông tin di truyền từ loài gặp quần xã vi sinh vật, đồng thời cho phép nhà nghiên cứu biết đâu sinh vật có khả thực chức cụ thể đó, gene mã hóa cho chức chưa tìm hiểu bị Tuy nhiên SGC có số giới hạn định, chưa thể sử dụng cách rộng rãi Chỉ cần lượng DNA tạp nhiễm có mặt mẫu ban đầu làm hỏng q trình giải trình tự Dẫu vậy, SCG giúp ích cho việc phân loại vi khuẩn người, xuất phát từ ngành chưa tìm hiểu Saccharibacteria (TM7) hay Chloroflexi (Chlorobacteria) Với tiến ngày khoa học kỹ thuật, phương pháp hy vọng ứng dụng rộng lớn II.5 Metatranscriptomics Một hướng giải trình tự bật có tiềm ứng dụng để tìm hiểu hệ vi sinh vật người metatranscriptomic, hay cịn gọi cụm RNA-seq Transcriptomic nghiên cứu sản phẩm phiên mã RNA loài sinh vật cụ thể, metatranscriptomic nghiên cứu sản phẩm phiên mã tổng hợp từ toàn quần xã vi sinh vật Điểm trội phương pháp là, shotgun metagenomic dự đốn tiềm cho việc thực chức vi sinh vật (do giải trình tự DNA), metratranscriptomic cho phép nhà nghiên cứu biết hoạt động chức Kỹ thuật dựa việc nghiên cứu biểu gene, cách thu nhận mRNA, phiên mã ngược để tạo thành thư viện cDNA giải trình tự shotgun dựa cơng cụ giải trình tự đại Illimuna Các phương tiện RNA-seq đại ngày cịn nhận biết mạch khác sản phẩm phiên mã, từ cho phép ta phát mạch RNA mã hóa khơng mã hóa thơng tin Metatranscriptomic đòi hỏi kỹ thuật cao metagenomic, bao gồm việc phiên mã ngược để tạo thành cDNA việc tách rRNA – loại RNA chiếm số lượng lớn – khỏi hỗn hợp RNA mẫu Bên cạnh đó, tương tự vấn đề gặp phải metagenomic, liệu gene vi sinh vật quần xã thường chưa ghi nhận, địi hỏi liệu thơ phải xếp hồn tồn (de novo) Quan trọng hơn, mRNA luôn đại diện cho hoạt động vi sinh vật in situ, thời gian bán hủy (half-life time) mRNA ngắn: khoảng vài phút Đây giới hạn lớn mà metatranscriptomic vấp phải Ngoài ra, chức đoạn gene phiên mã khơng hiểu rõ ràng vị trí cịn khuyết thiếu liệu tham khảo Những đòi hỏi cao mặt kỹ thuật nhiều giới hạn chưa thể khắc phục khiến metatranscriptomic chưa sử dụng phổ biến metagenomic Tuy nhiên, với tính hữu ích nó, metatranscriptomic trở thành phương pháp lý tưởng để nghiên cứu sâu đa dạng hệ vi sinh vật người Hướng tiếp cận Ưu điểm Nhược điểm Giải trình tự gene thị (Marker gene survey) Cung cấp nhìn tổng Tương đối khơng nhạy, quan lồi vi sinh vật có khơng phân loại theo mặt mẫu cấp loài số chi vi sinh vật Cho phép nạp mẫu lớn làm Chỉ cung cấp thông tin tăng độ tin cậy kết thành phần quần xã phân tích thống kê khơng liệu lực thực chức vi sinh vật Có thể suy đốn chức vi khuẩn việc so sánh trình tự 16S rRNA với gene giải trình tự đầy đủ chủng liên quan Các SSU rRNA 16S rRNA đặc trưng cho vi khuẩn vi khuẩn cổ (không đặc trưng cho virus, nấm,…) Khơng địi hỏi kĩ thuật tin Kết bị ảnh hưởng học cao nhiều yếu tố cách lấy mẫu, cách lưu trữ, bảo quản, PCR bias,… Chi phí thấp so với hướng Kết khơng thực có tính giải trình tự khác định lượng SSU rRNA thường có nhiều copy với số lượng copy đa dạng loài Thường không phân biệt tế bào sống tế bào chết bị bất hoạt Giải trình tự tồn hệ gene (Whole genome sequencing) Cung cấp thông tin Vi sinh vật thường phải tồn tiềm mã hóa ni cấy trước giải trình tự vi sinh vật genome Thời gian thực nhanh với chi phí tương đối thấp nhờ hỗ trợ kĩ thuật đại Các kỹ thuật giải trình tự đại (đọc đoạn ngắn) khơng cho genome hồn chỉnh mà draft Dữ liệu thu được Không biết chức sử dụng cho mục đích nhiều gene thành phần dịch tễ học trình tự tham khảo có đoạn khuyết thiếu Nghiên cứu đa hệ gene (Metagenomic) Cung cấp liệu khả thực chức thành phần loài quần xã vi sinh vật Số lượng mẫu thường bị giới hạn yêu cầu cao cơng nghệ thơng tin chi phí Cho phép thu nhận đồng thời thông tin di truyền vi sinh vật có nguồn gốc từ vi khuẩn, vi khuẩn cổ, sinh vật nhân chuẩn virus Không biết chức nhiều gene thành phần trình tự tham khảo có đoạn khuyết thiếu Có thể lắp ráp cho genome Việc lắp ráp thành genome loài mẫu, bao hoàn chỉnh gặp phải nhiều gồm lồi chưa khó khăn ni cấy Có thể sử dụng trực tiếp mẫu Kết bị ảnh hưởng từ môi trường nhiều yếu tố cách lấy mẫu, cách lưu trữ, bảo quản,… Khơng có tượng PCR Thường khơng phân biệt bias tế bào sống tế bào chết bị bất hoạt Đòi hỏi nguồn tài ngun tính tốn lớn kỹ thuật tin sinh cao Chi phí thực tương đối cao Nghiên cứu gene đơn bào Chi phí thực tương đối cao trình phân lập (Single-cell genomic) Cung cấp thơng tin di đơn bào cần có thiết bị truyền lồi chưa đại ni cấy trước Kết bị ảnh hường tượng bias trình khuếch, lấy mẫu, lưu trữ mẫu,… Dữ liệu thu từ loài chưa ni cấy giúp phát triển sở liệu để thực nghiên cứu metagenomic Sự tạp nhiễm DNA ảnh hưởng đến tồn kết Khơng phân biệt tế bào sống với tế bào chết bị bất hoạt Metatranscriptomic Cung cấp thông tin hoạt mRNA luôn động chức quần xã đại diện cho hoạt động vi sinh vật mẫu vi sinh vật thời gian bán hủy ngắn Không biết chức nhiều gene thành phần trình tự tham khảo có đoạn khuyết thiếu Tập trung vào vi sinh vật Kết bị ảnh hường có hoạt động (trong tồn hệ tượng bias q trình vi sinh vật) khuếch, lấy mẫu, lưu trữ mẫu,… Đòi hỏi kỹ thuật tiên tiến phức tạp việc chuyển đổi RNA phân tích Bảng Ưu – nhược điểm hướng tiếp cận giải trình tự nghiên cứu hệ vi sinh vật người III Quy trình thực Hiện dự án Human Microbiome Project dự án lớn nhằm nghiên cứu hệ vi sinh vật có mặt thể người Dự án tập trung vào giải trình tự 16S rRNA metagenomic để giải đáp liệu có tồn hệ vi sinh vật “cốt lõi” vị trí thể người hay khơng, liệu đa dạng chúng nghiên cứu cách có hệ thống hay khơng Nó góp phần khởi tạo lượng liệu khổng lồ phức tạp hệ vi sinh vật người cung cấp sở để nghiên cứu sâu tác động chúng lên sức khỏe bệnh tật người Việc giải trình tự 16S rRNA tồn hệ gene thơng qua shotgun (whole metagenome shotgun – mWGS) thực qua giai đoạn, bao gồm giai đoạn thử nghiệm liệu mô phỏng, giai đoạn thử nghiệm lâm sàng, giai đoạn lâm sàng (hoàn thành vào tháng Bảy năm 2010) giai đoạn lâm sàng (hoàn thành năm 2013) Giai đoạn thử nghiệm liệu mô phỏng: Vào thời điểm HMP bắt đầu, chưa có giao thức chuẩn hóa để đảm bảo tính ổn định việc khuếch đại gene 16S rRNA kĩ thuật giải trình tự Vì HMP đánh giá số giao thức cách sử dụng quần xã mô nhân tạo bao gồm 21 sinh vật biết, trước thức áp dụng giao thức 16S 454 (giải trình tự 16S rRNA sử dụng phương pháp 454 pyrosequencing) Các sinh vật bao gồm nhiều chi thường tìm thấy thể người DNA từ sinh vật trộn lại để tạo thành hai hỗn hợp mô phỏng: (a) hỗn hợp mô chứa 100,000 copy 16S rRNA/sinh vật/aliquot (b) hỗn hợp mô so le chứa từ 1000 đến 100,000 copy 16S rRNA/sinh vật/aliquot Các kết giải trình tự liệu mô công bố Các giai đoạn tiếp theo: Bước 1: Thu thập mẫu Mẫu thu thập từ 300 tình nguyện viên khỏe mạnh, bao gồm đàn ông phụ nữ nằm độ tuổi từ 18 đến 40, trường Đại học Y khoa Baylor Houston trường Đại học Washington St Louis Các mẫu thu thập (không xâm lấn) từ năm vị trí thể, với tổng cộng từ 15-18 vị trí cụ thể Mỗi tình nguyện viên lấy mẫu từ đến tối đa ba lần Ngồi tình nguyện viên cịn cung cấp máu huyết để sử dụng cho việc kiểm tra mối quan hệ kiểu gene vật chủ với hệ sinh vật người Các siêu liệu tình nguyện viên mẫu gửi EMMES (đối tác HMP lưu giữ quản lý siêu liệu) EMMES định cho người mã định danh ngẫu nhiên mã hóa (de-indentified RSID) Mỗi mẫu cá nhân gắn số hiệu mẫu sơ cấp (PSN id) EMMES tự tạo Bước 2: Chiết xuất DNA DNA tách chiết từ mẫu ban đầu (bằng phương pháp mô tả chi tiết Sổ tay qui trình) gắn NAP id (Nucleic Acid Preparation) tạo trung tâm thực giải trình tự Nếu cần thiết, dịch tách chiết chia làm hai phần nhỏ, phần gắn số hiệu mẫu (Sample Number – SN id) EMMES tự tạo Do mẫu PSN tạo nhiều mẫu SN Ở giai đoạn thử nghiệm lâm sàng, mẫu sơ cấp gửi đến hai trung tâm thực giải trình tự để đánh giả khả tái tạo nhiều sở Ở giai đoạn lâm sàng lại, mẫu PSN cho mẫu SN nhất, gửi tới trung tâm giải trình tự Bước 3: Giải trình tự 16S rRNA Giải trình tự 16S rRNA thực với Roche-454 FLX Titanium - Giải trình tự vùng biến đổi V3-V5 (V35) tất mẫu - Giải trình tự vùng biến đổi V1-V3 (V13) cho tập hợp gồm khoảng 3000 mẫu, vùng biến đổi V6-V9 (V69) cho tập hợp gồm 100 mẫu, để bổ sung thơng tin cho việc phân loại Bước 4: Giải trình tự mWGS Việc giải trình tự thực với Illumina GAIIx với trình tự đọc hai đầu gồm 101bp Toàn mẫu sàng lọc tạp nhiễm từ người công cụ BMTagger NCBI, với 49% trình tự đọc nhắm đích Các mẫu kiểm tra chất lượng, bao gồm việc xác định chênh lệch đoạn contig trung bình mật độ ORF Các mẫu vượt qua q trình kiểm sốt chất lượng lắp ráp lần đầu giao thức SOAP de novo tối ưu hóa, sau tái lắp ráp IDBA-UD Bước 5: Ghép nối kết giải trình tự 16S rRNA mWGS Kết giải trình tự 16S rRNA mWGS lắp ráp lại với cho kết cuối IV Tiềm năng, thách thức định hướng tương lai IV.1 Tiềm Giải trình tự hệ vi sinh vật người có ý nghĩa vơ quan trọng kế hoạch phân loại phân tích vai trò vi sinh vật sức khỏe bệnh lý người Trong đó, việc giải mã hệ vi sinh vật ruột nhận nhiều quan tâm Tương tác hệ vi sinh đường ruột thể có ảnh hưởng lớn đến sức khỏe tồn người Một số hệ thống nhắm vào 16S rRNA thử nghiệm để phân loại vi khuẩn ruột người kể đến Roche 454 FLX, MiSeq (Illumina), PacBio MinION (Oxford Nanopore) Các hệ thống có số khác biệt nhỏ, nhận thấy có hiệu việc khảo sát quần xã vi sinh vật đường ruột Theo thời gian, hệ thống ngày nâng cấp phát triển Hệ thống giải trình tự Illumina (HiSeq system MiSeq system, hệ NextSeq) cung cấp cơng cụ hữu hiệu, thích hợp cho việc giải trình tự gene có kích thước nhỏ, thời gian giải nhanh, trình tự đọc dài linh hoạt ứng dụng vào metagenomic, đồng thời giá thành rẻ hơn, khơng địi hỏi kỹ thuật tin học cao Hệ thống PacBio Oxford Nanopore, với trình tự đọc dài hơn, giúp ích nhiều việc giải trình tự vi sinh vật metagenomic phương pháp shotgun IV.2 Thách thức Tuy nhiên, bên cạnh tiềm ứng dụng việc chẩn đốn bệnh lý, kỹ thuật giải trình tự gene tồn số rào cản định Giải trình tự 16S rRNA khơng thể thực chủng nấm vi sinh vật eukaryote khác, đặc biệt hơn, virus không chứa gene mã hóa cho SSU rRNA đặc trưng, dùng phương pháp shotgun để giải trình tự tồn genome Bên cạnh đó, phương pháp nhắm vào 16S rRNA số chi vi khuẩn không khả thi muốn phân loại tới mức độ lồi Ngồi ra, primer thường dùng sai lệch với số chủng vi khuẩn, trường hợp primer 27f Bifidobacterium Trong đó, hạn chế lớn sử dụng liệu shotgun việc số lượng lớn vi sinh vật chưa ni cấy, trình tự chúng chưa giải mã Các hướng tiếp cận giải trình tự khác metagenomic, single-cell genomic metatranscriptomic vấp phải nhiều giới hạn địi hỏi kỹ thuật tin học chi phí thực cao Một bất lợi khác cho việc giải trình tự việc bảo quản mẫu Một số nghiên cứu rằng, trữ lạnh làm biến dạng mẫu phân thối hóa mẫu DNA Bacteroides Kit tách chiết DNA ảnh hưởng đến kết phân loại vi khuẩn, cấu tạo thành tế bào vi khuẩn Gram âm Gram dương khác nhau, có độ nhạy cảm khác nguyên liệu kit Cuối cùng, DNA tồn vi sinh vật chết, việc giải trình tự gene khơng thể dùng để xác định vi sinh vật cịn sống hay bị bất hoạt/chết Tuy nhiên, dùng propidium monazide để tiền xử lý DNA, chất liên kết với DNA tự do, DNA tế bào chết, nhờ ta phân biệt kết giải trình tự tế bào sống chết IV.3 Định hướng tương lai Phương pháp nhắm vào 16S rRNA giải trình tự tồn genome nhiều hạn chế Các hướng tiếp cận đại sau nêu có nhược điểm với ưu chúng mang lại, nghiên cứu tương lai áp dụng phương thức hy vọng nâng cao hiệu trình giải trình tự hệ vi sinh vật người, để có bước phát triển xa lĩnh vực công nghệ sinh học, y học môi trường  ... I.1 Hệ vi sinh vật người I.2 Lịch sử nghiên cứu hệ vi sinh vật người I.3 Tầm quan trọng vi? ??c nghiên cứu hệ vi sinh vật người II Các kỹ thuật gene nghiên cứu hệ vi sinh vật người. .. từ vi sinh vật II Các kỹ thuật gene nghiên cứu hệ vi sinh vật người Mặc dù số lượng nghiên cứu hệ vi sinh vật người gene chúng ngày bùng nổ, dường bí ẩn thể người Đơi chúng xem gene thứ hai người, ... Giới thiệu I.1 Hệ vi sinh vật người Hệ vi sinh vật người tập hợp vi sinh vật bao gồm virus, sinh vật nhân sơ (vi khuẩn, vi khuẩn cổ) sinh vật nhân chuẩn (nấm, động vật nguyên sinh, protis) tìm