Bài giảng Đột biến gen Beta-globin ở bệnh nhi Beta-thalassemia miền bắc Việt Nam

Bài giảng Đột biến gen Beta-globin ở bệnh nhi Beta-thalassemia miền bắc Việt Nam trình bày về nghiên cứu tiến cứu, mô tả, phân tích, cắt ngang, bằng các kỹ thuật lâm sàng và xét nghiệm; phát hiện đột biến gen tại Khoa Sinh học phân tử, bệnh nhi Beta-thalassemia.

ĐỘT BIẾN GEN BETA-GLOBIN Ở BỆNH NHI BETA-THALASSEMIA MIỀN BẮC VIỆT NAM Nguyễn Hoàng Nam, Dương Bá Trực Bệnh viện Nhi trung ương HNNKTQ TpHCM 30/11-1/12-18 ĐẶT VẤN ĐỀ • Beta-thalassemia bệnh di truyền phổ biến Việt Nam, giảm hay không tổng hợp mạch beta globin Hb, đột biến gen beta-globin • Nghiên cứu đột biến gen beta-globin gây betathalassemia giúp ích cho việc tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh • Mục tiêu nghiên cứu: “ Nghiên cứu số đặc điểm đột biến gen beta-globin bệnh nhân beta-thalassemia phía bắc Việt Nam ” ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu • 104 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn chẩn đoán : 55 betathalassemia, 49 beta-thalassemia / HbE vào Bệnh viện Nhi trung ương • Tuổi - Dưới tuổi : 89 (85,6%), < tuổi 50 (44,4%) - Từ 5-10 tuổi : 12 (11,5%) - Từ 10-15 tuổi : ( 2,9%) • Giới : • Dân tộc Nam / Nữ : 59/45 (1,3/1) - Kinh : 71 (68,3%), - Ít người gồm Thái, Tày, Mường, Nùng, Sán Dìu, Dao, Bố Y : 33 (31,7%) • Địa phương : Hà Nội 28 tỉnh thành miền bắc Phương pháp nghiên cứu • Nghiên cứu tiến cứu, mơ tả, phân tích, cắt ngang kỹ thuật lâm sàng xét nghiệm, BVNTƯ • Phát đột biến gen Khoa Sinh học phân tử, BVNTƯ : - Tách DNA từ máu ngoại biên với kít QIA gen DNA Đức - Sử dụng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR phát đột biến điểm thường gặp Châu Á CD41/42, CD17, IVS1-1, -28, IVS2-654, CD71/72, IVS1-5, CD95, CD26 (HbE) - Giải trình tự gen khơng thấy đột biến với Multiplex ARMS-PCR - Sử dụng kỹ thuật GAP-PCR để phát đột biến xóa đoạn cần Sơ đồ quy trình phát đột biến gen β-globin Bệnh nhân β-thalassemia Thu thập mẫu máu tách DNA Phát đột biến gen Multiplex PCR ARMS-PCR Có đột biến gen Xác định kiểu gen đột biến: Dị hợp tử, đồng hợp tử Không thấy đột biến gen Giải trình tự gen Có đột biến gen Phát đột biến xóa đoạn GAP- PCR Một số đột biến gen -globin phát kỹ thuật ARMS Nội kiểm -28 17 654 Nội kiểm 43 71-72 Panel 1: 1-6 1: Dị hợp tử -28 2: Dị hợp tử kép -28/71-72 3: Dị hợp tử Codon 17 4: Dị hợp tử Codon 43 5: Thang DNA 100 bp 6: Mẫu nội kiểm không DNA Panel 2: 7-8 7: Di hợp tử IVS 2-654 8: Mẫu nội kiểm khơng DNA Phân tích đột biến gen theo chức vị trí ĐỘT BIẾN SAO MÃ (Kiểu hình β+- thalassemia) - Vùng khởi động (promotor) - Vị trị 5’UTR (5’ - Vùng không phiên mã) ĐỘT BIẾN HỒN THIỆN RNA (Kiểu hình β+ hay β0-thalassemia) - Vị trí nối (splice junction) - Vị trí nối địng thuận (consensus splice site) - Exon - Intron - Vị trí 3’UTR ĐỘT BIẾN DỊCH MÃ RNA (Kiểu hình β0-thalassemia) - Codon khởi đầu (Initiation Codon) - Codon vô nghĩa (Nonsense Codon) - Dịch khung (Frameshift) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ĐỘT BIẾN GEN β-GLOBIN GÂY BETA-THALASSEMIA Đã phát 208 alen đột biến gen 104 bệnh nhân β-thalasemia Đột biến gen β – globin β – thalassemia CD 41/42 (-TCTT) CD 17 (AA – TAG) CD 26 (GAG – AAG) CD 71/72 (+ A) IVS -654 (C – T) - 28 (A – G) - 88 (C – T) CD95 (TAC – TAA) IVS – (G – T) IVS 1- (G – C) Các đột biến gặp c-140 (C – T) c-441-c442 ins AC 2.3kb – deletion Tổng Kiểu hình β0 β0 HbE β0 β+ β+ β++ β0 β0 β0 β+ Số alen đột biến 63 62 49 10 6 2 1 208 Tỷ lệ % 30,3 30,0 23,5 4,8 2,9 2,9 1,4 1,0 1,0 1,0 1,4 0,5 0,5 0,5 100 35 30 25 20 15 10 Các đột biến gen β -globin phát 104 bệnh nhân Phân bố đột biến gen beta-globin theo dân tộc Khác Đột biến gen β – globin CD41/42 CD17 CD26 CD71/72 IVS 2-654 - 28 - 88 CD95 IVS 1-1 I VS 1-5 Đột biến gặp Cộng Kinh n 43 41 33 3 2 1 142 % 30,3 29,9 23,2 5,6 3,5 2,1 5,6 1,4 1,4 0,7 0,7 100 Tày n 10 1 0 0 20 (Mường, Nùng, Sán Dìu, Dao, Bổ Y) Thái % 50 30 5 5 100 n 6 12 0 0 0 0 24 % 25 25 50 100 n 1 0 1 22 % 18,2 40,9 13,7 4,5 4,5 9,1 4,5 4,5 100 Tần số đột biến gen beta-globin β-thalassemia Việt Nam Đột biến CD41/42 CD17 CD26 CD71/72 IVS 2-654 -28 -88 CD95 IVS 1-1 IVS 1-5 c-140 c441-c442 ins AC 2.3 kb deletion Khác Miền Bắc Miền Bắc 2.000 (Nghiên cứu này) [Filon, [Saovaros, [Hảo LT và cs.] cs.] Trực, cs.] [Triết LPM.] 30,3% 30,0% 23,5% 4,8% 2,9% 2,9% 1,4% 1,0% 1,0% 1,0% 0,5% 0,5% 0,5% - 34,5% 48,3% 3,5% 13,8% - Miền Trung Miền Nam Miền Nam 2013 2002 1988 + + + + - 35,7% 25% 7,3% 7,3% 7,3 6,0% 11,8% 43.5% 13.0% 8.7% 13.0% 4.4% 17.4% Phân bố đột biến gen β– thalassemia phổ biến Châu Á *Việt Nam [Nghiên cứu này] *Các nước khác [Southat F.2011] Nhận xét: Các đột biến phổ biến Việt Nam giống với Trung Quốc,Thái Lan: giống phần với Myanma, Indonesia, Malaysia Tần xuất đột biến Beta Thalassemia phổ biến nước châu âu địa trung hải Quốc gia Đột biến CD39 C – T 41,90% IVS 1-110 G – A 25,70% Pháp IVS 1-1 G – A 10,50% IVS 1-6 T – C 8,60% CD39 C – T 50,00% IVS 1-110 G – A 16,50% Tây Ban Nha IVS 1-6 T – G 12,60% IVS 1-1 G – A 11,50% CD39 C – T 37,30% IVS 1-1 G – A 21,00% Bồ Đào Nha IVS 1-1 T – C 19,00% IVS 1-110 G – A 11,50% CD39 C – T 34,80% 13,00% Vương Quốc CD 121 G – A Anh IVS 1-1 G – A 8,70% CD5 – CT 8,70% Quốc gia Đột biến CD39 C – T 41,00% IVS 1-110 G – A 23,50% Italia IVS 1-6 T – C 10,10% IVS 1-1 G – A 10,10% IVS 1-110 G – A 43,10% CD39 C – T 20,90% Hy Lạp IVS 1-1 G – A 13,50% IVS 1-6 T – C 8,60% IVS 1-110 G – A 78,40% IVS 1-6 T – C 6,40% Cyprus IVS 2-745 C – G 5,70% CD39 C – T CD39 C – T 95,70% CD6 – A Sardinia IVS 2-745 C – G Phân bố đột biến gen β -globin theo vị trí Exon (30%) Exon 2(59,6%) Intron (1,9%) Intron (2,9%) Vùng khởi động (4,3%) Đột biến khác (1,4%) Phân bố đột biến gen β-globin theo chức gen Chức gen Số lượng ĐỘT BIẾN SAO MÃ (Kiểu hình β+ thalassemia) - Yếu tố điều hòa khởi động - 28 (A – G) - 88 (C – T) 10 ĐỘT BIẾN HỒN THIỆN RNA(Kiểuhình β0hay β+thal) - Vị trí đầu kết nối IVS 1-1 (G – T) IVS 1-5 (G – C) IVS 2-654 (C – T) 186 ĐỘT BIẾN DỊCH MÃ RNA (Kiểu hình β0 thalassemia) -Codon vơ nghĩa CD17 (AAG – TAG) CD26 (GAG – AAG) CD95 (TAC – TAA) -Dịch khung CD 41/42 (- TTCT) CD71/72 (+A) Đột biến gặp khác Cộng 208 Tỷ lệ % 4,3 4,8 89,4 1,4 100 Phân bố đột biến theo kiểu gen Kiểu gen Kiểu phối hợp đột biến β0β0 Đồng hợp tử Số bệnh nhân Tỷ lệ % 40 38,46 17 CD41/42 - CD41/42 CD17 - CD17 β+β+ Dị hợp tử kép CD41/42 - CD17 CD17 - CD71/72 CD41/42 - CD71/72 CD41/42 - CD95 CD41/42 - IVS1.5 23 Dị hợp tử kép IVS2.654 - 2,3kb del 8,7 7,7 15 3 1 14,4 2,9 2,9 0,96 0,96 0,96 0,96 Phân bố đột biến theo kiểu gen (tiếp) Kiểu gen Kiểu phối hợp đột biến Số bệnh nhân Tỷ lệ % β0β+ Đị hợp tử kép 14 13,46 -28 - CD17 -28 - CD41/42 -88-CD41/42 CD17 - IVS2.654 CD41/42 - IVS2.654 CD71/72 - IVS2.654 IVS1.1 - IVS2.654 -140 - CD17 CD17- c441.c442 ins A ‘ 2 1 1 2,9 1,9 1,9 1,9 0,96 0,96 0,96 0,96 0,96 Phân bố đột biến theo kiểu gen (tiếp) Kiểu gen Kiểu phối hợp đột biến Số bệnh nhân Tỷ lệ % β0βE Dị hợp tử phối hợp HbE 47 45,20 CD17 -CD26 CD41/42 - CD26 CD71/72 - CD26 IVS1.1 - CD26 IVS1.5 - CD26 CD95 - CD26 β+βE Dị hợp tử phốihợp HbE -28 - CD26 -88 - CD26 21 20 1 21,2 19,2 2,9 0,96 0,96 0,96 1,92 1 0,96 0,96 KẾT LUẬN Các đột biến gen beta-globin phát : • Đã phát 208 alen đột biến 104 bệnh nhân, với 13 dạng : - đột biến phổ biến CD41/42, CD17, CD26, CD71/72 với tỷ lệ 30,3%, 30%, 23,5% 4,8%; - đột biến phổ biến : -28, IVS2-654, -88, CD95, IVS1-1, IVS1-5; - đột biến là: -140, c441-c442 ins AC , 2,3kb deletion • Khơng khác biệt nhiều đột biến dân tộc, thấy CD26 gặp nhiều người Thái Kinh Tày CD41/42 gặp nhiều Tày Kinh 19 Đặc điểm đột biến gen beta-globin Việt Nam : • Đột biến trình dịch mã RNA (80,4%) nhiều hoàn thiện RNA mã; nhiều exon (89,6%), intron vùng khởi động • Đa số đột biến có kiểu hình β0 (68%), βE (23,5%), đột biến β+ • Đã phát 25 kiểu phối hợp đột biến, kiểu phối hợp phổ biến : CD17-CD26, CD41/42-CD26, CD41/42-CD17, CD41/42-CD41/42, CD17-CD17 Kiểu gen β0 βE phổ biến (45,3%), β0 β0 (38,4%), β0 β+ (13,4%), β+ βE (1,92%), cuối β+ β+ (0,96%) Từ kết luận : Phần lớn β-thalassemia Việt Nam β0-thalassemia 20 Trân trọng cảm ơn ... DNA Phát đột biến gen Multiplex PCR ARMS-PCR Có đột biến gen Xác định kiểu gen đột biến: Dị hợp tử, đồng hợp tử Không thấy đột biến gen Giải trình tự gen Có đột biến gen Phát đột biến xóa đoạn GAP-...ĐẶT VẤN ĐỀ • Beta-thalassemia bệnh di truyền phổ biến Việt Nam, giảm hay không tổng hợp mạch beta globin Hb, đột biến gen beta-globin • Nghiên cứu đột biến gen beta-globin gây betathalassemia... Các đột biến gen β -globin phát 104 bệnh nhân Phân bố đột biến gen beta-globin theo dân tộc Khác Đột biến gen β – globin CD41/42 CD17 CD26 CD71/72 IVS 2-654 - 28 - 88 CD95 IVS 1-1 I VS 1-5 Đột biến