Nghiên cứu biểu hiện peptit kháng nguyên từ protein vỏ của virut viêm não nhật bản làm tiền đề để sản xuất văcxin dùng qua đường miệng .pdf

Nghiên cứu biểu hiện peptit kháng nguyên từ protein vỏ của virut viêm não nhật bản làm tiền đề để sản xuất văcxin dùng qua đường miệng .pdf

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Quỳnh Liên

THÁI NGUYÊN – 2009

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN NGỌC GIANG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PEPTIT KHÁNG NGUYÊN TỪ PROTEIN VỎ CỦA VIRUT VIÊM NÃO NHẬT BẢN LÀM TIỀN

ĐỀ ĐỂ SẢN XUẤT VĂCXIN DÙNG QUA ĐƯỜNG MIỆNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2009

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả trong thí nghiệm này đều được tôi làm thực tế và chưa có công trình nào công bố trên các bài báo, tạp chí, hay các phương tiện thông tin đại chúng

Tác giả

Nguyễn Ngọc Giang

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quỳnh Liên đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài tôi đã nhận được sự giúp đỡ và những kinh nghiệm quý báu từ GS.TS Lê Trần Bình, TS Chu Hoàng Hà, TS Lê Văn Sơn, TS Nguyễn Hữu Cường cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Từ đáy lòng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với sự gúp đỡ đó để tôi có thể hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô trong bộ môn Sinh, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong suốt quãng thời gian học tập tại trường

Nhân dịp này, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè và những người thân bên cạnh đã động viên khích lệ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Thái Nguyên, ngày 1 tháng 10 năm 2009 Học viên

Nguyễn Ngọc Giang

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Amp: Ampicillin AS: Acetosyringone

A Tumefaciens: Agrobacterium Tumefaciens

E.coli: Escheria Coli

EDTA: Ethylen dimine tetra- acetic acid

HEPES: N-2-huydroxyethylpiperazine-N’-ethanesulfonic acid IPTG: Isopropylthio-beta-D-glactoside

Kana: Kanamycin Kb: kilobaze LB: Luria Bertani

LTB: Labile enterotoxin B OD: Mật độ quang học

PBS: Phosphate buffer saline PCR: Polymerase chain reaction Rifa: Rifampicin

SDS: Sodium dodecyl sulphat

SDS- PAGE: SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis Spec: Spectinomycin

TE: Tris-EDTA

VNNB: viêm não Nhật Bản

X-gal: 5-bromo-4 chloro- 3 indolyl-beta-D-glactoside

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 Bệnh viêm não Nhật Bản Error! Bookmark not defined

1.1.1 Nguồn gốc bệnh viêm não Nhật BảnError! Bookmark not defined 1.1.2 Nguồn lây truyền bệnh Error! Bookmark not defined 1.1.3 Đặc điểm biểu hiện của bệnh: Error! Bookmark not defined 1.2 Virut viêm não Nhật Bản (virut VNNB) Error! Bookmark not defined

1.2.1 Đặc điểm hình thái và tính chất lý hoá của virut VNNBError! Bookmark not defined 1.2.2 Sự nhân bản của virut Error! Bookmark not defined

1.2.3 Cấu trúc của virut VNNB Error! Bookmark not defined 1.2.4 Khả năng gây đáp ứng miễn dịch của đoạn peptit kháng

nguyên 27 axit amin của virut VNNB Error! Bookmark not defined 1.3 Các loại văcxin phòng bệnh VNNB Error! Bookmark not defined

1.3.1 Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuộtError! Bookmark not defined 1.3.2 Văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ tế bàoError! Bookmark not defined 1.3.3 Văcxin sống giảm độc lực Error! Bookmark not defined

1.3.4 Nghiên cứu phát triển văcxin mớiError! Bookmark not defined

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 Vật liệu Error! Bookmark not defined

2.1.1 Vật liệu thực vật Error! Bookmark not defined 2.1.2 Vật liệu sinh học phân tử Error! Bookmark not defined 2.1.2.1 Mồi Error! Bookmark not defined 2.1.2.2 Plasmid Error! Bookmark not defined 2.1.2.3 Các chủng vi sinh vật và các nguyên liệu dùng trong thí

nghiệm Error! Bookmark not defined 2.1.2.4 Các loại máy móc Error! Bookmark not defined 2.1.3 Hoá chất Error! Bookmark not defined

2.1.4 Các môi trường nuôi cấy và các dung dịchError! Bookmark not defined 2.2 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.2.1 Nhân đoạn 27 aa và LTB bằng PCRError! Bookmark not defined

2.2.2 Phương pháp PCR từ khuẩn lạc (colony PCR)Error! Bookmark not defined 2.2.3 Thiết kế vector pET21_27aa_LTB biểu hiện đoạn peptit kháng

nguyên trong E.coli Error! Bookmark not defined

2.2.4 Biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong E.coliError! Bookmark not defined

2.2.5 Thiết kế vector pCB_27aa_LTB biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong tế bào thực vật Error! Bookmark not defined

2.2.6 Biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong tế bào thực vậtError! Bookmark not defined 2.2.7 Kiểm tra biểu hiện của protein tái tổ hợpError! Bookmark not defined

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Nhân đoạn gen 27 aa Error! Bookmark not defined 3.2 Nhân gen LTB và nối với gen 27 aa Error! Bookmark not defined

3.3 Thiết kế vector biểu hiện gen 27 aa_LTB trong E.coliError! Bookmark not defined

3.4 Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E.coli BL21Error! Bookmark not defined

3.4.1 Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn E.coli BL21Error! Bookmark not defined 3.4.2 Biểu hiện gen 27aa_LTB trong E.coli BL21Error! Bookmark not defined

3.5 Biểu hiện tạm thời gen 27aa_LTB trong thực vậtError! Bookmark not defined

3.5.1 Thiết kế vector biểu hiện gen 27aa_LTB trong thực vậtError! Bookmark not defined 3.5.2 Lai đoạn 27aa_LTB_cmyc_KDEL với vector chuyển gen

pCB301 Error! Bookmark not defined

3.5.3 Biến nạp vào A tumefaciens Error! Bookmark not defined

3.5.4 Biểu hiện tạm thời gen 27aa_LTB trong cây thuốc láError! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined

KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng Trang

Bảng 2 Các loại plasmid dùng trong thí nghiệm 18

Hình 1.5: Khả năng gây đáp ứng miễn dịch của văcxin thực vật 15 Hình 2.1: Sơ đồ quá trình gắn nối đoạn 27 axit amin với gen LTB 20 Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector pET21_27aa_LTB biểu hiện đoạn

Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm biểu hiện tạm thời gen 27aa_LTB trong cây thuốc lá 24

Hình 3.2: Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn LTB và ghép nối 27aa_LTB 28 Hình 3.3: Điện di sản phẩm cắt plasmid pBT_27aa_LTB 29 Hình 3.4: Kết quả so sánh trình tự đoạn 27 aa_LTB với trình tự gốc lần 30 Hình 3.5: Điện di sản phẩm cắt plasmid pET21_27aa_LTB 32 Hình 3.6: Điện di sản phẩm cắt plasmid pET21_27aa_LTB tách từ E.coli BL21 33

Hình 3.7: Điện di sản phẩm biểu hiện protein ở E.coli BL21 34

Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt plasmid pTRA_27aa_LTB bằng HindIII 36

Hình 3.9: Điện di sản phẩm cắt plasmid pCB_27aa_LTB bằng HindIII 37

Hình 3.11: Kết quả PCR từ plasmid các dòng A tumefaciens 39

Hình 3.13: Mẫu lá tiêm gen Gus đƣợc nhuộm bởi X-Gluc 41

- Các dung dịch sử dụng trong tách chiết plasmid từ vi khuẩn:

+ SolI: Tris- HCL 25mM, pH=8; EDTA 10mM, pH=8; glucose 50mM + SolII: NaOH 0,2M; SDS 1%

+ SolIII: kali axetat 3M; axit axetic 11,5%; natri axetat 3M

- Dung dịch đệm TE: Tris-HCL 10mM, pH=8; EDTA 1mM, pH=8

- Dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1): 24ml chloroform: 1ml isoamylalcohol

- Dung dịch đệm TAE đặc 50 lần: Tris- HCL 24,2%, axit axetic 5,71 ml, 10ml EDTA 0,5M pH=8

- Dung dịch nhộm gel ethidium bromide: 0,5μg/ml

- Các dung dịch trong điện di trên gel polyacrylamid(SDS- PAGE) + Bis- Acrylamid 30%; APS 10%; Glycerol 50%; TEMED

+ Đệm Tris- HCL 1,5M(pH=6,8)

* Các loại môi trường

- Môi trường LB lỏng: 0,5% dịch chiết nấm men; 1% bacto-pepton; 1% NaCl

- Môi trường LB đặc: môi trường LB lỏng thêm 1,5% Bacto-aga

- Môi trường chứa chất cảm ứng IPTG: môi trường LB có bổ xung IPTG tới nồng độ cuối cùng 1mM

MỞ ĐẦU

Virut là nguyên nhân gây ra những căn bệnh nguy hiểm cho con người trong đó có virut viêm não Nhật Bản (Japanese Encephalitis Virus- JEV) Virut viêm não Nhật Bản xâm nhập vào cơ thể làm tổn hại hệ thần kinh gây ra những tổn thương nghiêm trọng dẫn đến tử vong hoặc để lại các di chứng nặng sau khi hồi phục Ðến nay, bệnh viêm não Nhật Bản cũng như nhiều bệnh do siêu vi gây ra khác chưa có thuốc đặc trị Ðiều trị chủ yếu là làm bớt đi phần nào các triệu chứng, cứu người bệnh qua khỏi cơn nguy kịch do suy hô hấp, trụy tim mạch, nhiễm trùng Sau đó thì điều trị những di chứng phục hồi vận động, tâm thần kinh nhưng kết quả điều trị phục hồi này rất hạn

chế Do vậy, việc phòng tránh là hết sức cần thiết

Đã từ lâu văcxin là phương thuốc phòng ngừa bệnh hiệu quả cho con người Và để phòng bệnh viêm não Nhật Bản thì cũng đã có rất nhiều loại văcxin được sản xuất Tuy nhiên, đại đa số các loại văcxin này thường có quy trình sản xuất phức tạp, trải qua các quá trình làm lạnh khắt khe

Gần đây, văcxin thực vật được quan tâm nhiều vì nó có nhiều ưu điểm như dễ dàng thu sinh khối, dễ tăng quy mô sản xuất, có tính ổn định cao trong quá trình bảo quản và sử dụng, an toàn

Bên cạnh đó, những nghiên cứu trên protein vỏ của virut viêm não Nhật Bản cho thấy đoạn 27 axit amin nằm trên protein vỏ của virut viêm não Nhật Bản có khả năng tạo ra kháng thể chống lại virut này

Ngoài ra, nghiên cứu trên tiểu đơn vị liên kết nội độc tố không bền nhiệt

của E.coli (heat- labile enterotoxin: LT) cho thấy tiểu đơn vị B (LTB) có khả

năng sinh miễn dịch ở niêm mạc ruột LTB tái tổ hợp có thể kích thích các đáp ứng miễn dịch niêm mạc để chống lại LT Do vậy, LTB có thể được sử dụng tăng cường hiệu quả miễn dịch của văcxin thực vật

Dựa theo những căn cứ trên, do đó chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu

biểu hiện peptit kháng nguyên từ protein vỏ của virut viêm não Nhật Bản làm tiền đề để sản xuất văcxin dùng qua đường miệng ”

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh viêm não Nhật Bản

1.1.1 Nguồn gốc bệnh viêm não Nhật Bản

Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) được phát hiện vào năm 1871 Năm 1924, tại Nhật Bản xảy ra một vụ dịch có tới 6000 người mắc và có đến 60% trong số này tử vong [20] Năm 1959, Buecher và Scherer đã khẳng định chim và lợn là những vật chủ chính bị nhiễm virut và nhờ có muỗi là vectơ hút máu các động vật nhiễm truyền virut sang cho người [5]

Các nước trong khu vực châu Á bao gồm: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Triều Tiên, Philippine, vùng viễn đông Nga, tất cả các nước Đông Nam Á và Ấn Độ đều nằm trong vùng lưu hành của virut VNNB Dần dần nó đã lây lan đến các vùng khác không thuộc châu Á như vùng Torres của Australia [13] [36] Hàng năm, trong khu vực này có khoảng 50.000 trường hợp mắc và trong đó có khoảng 10.000 tử vong, số sống sót mang nhiều di chứng thần kinh rất nặng nề [42]

Bệnh VNNB thường xảy ra quanh năm, nhưng dịch thường bắt đầu trong mùa mưa khi quần thể muỗi phát triển tối đa và nhiệt độ ở các khu vực này thích nghi cho nguồn bệnh [52] Thường là vào khoảng tháng 5 đến tháng 9 ở các nước bán nhiệt đới và nhiệt đới phụ thuộc vào mật độ muỗi và động vật khuếch đại, lượng mưa, chim di cư và canh tác nông nghiệp là các yếu tố quan trọng Tỷ lệ mắc giảm dần ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản nhưng lại tăng lên ở Bangladest, Myanmar, Ấn Độ, Nepal, Bắc Thái Lan và Việt Nam [52]

1.1.2 Nguồn lây truyền bệnh

Hầu hết các trường hợp lây truyền bệnh là do muỗi hoặc côn trùng đốt các loài chim, chim là ký chủ mang mầm bệnh, nhưng bản thân chim thường

không biểu hiện bệnh Ngoài ra còn có các vật chủ khác mang mầm bệnh như động vật có vú, nhất là lợn [3]

Muỗi Culex là vector truyền bệnh, chủ yếu là các loài: Culex

tritaeniorhyncus: là muỗi thường gặp ở châu Á Culex gelidus: thường gặp ở

Malaysia và Singapore Culex vishnui: ở Ấn Độ Culex pseudovishnui: ở Ấn Độ Culex annulirostris: ở Guam Culex pipiens: ở phía đông Liên Xô cũ Muỗi cái có thể truyền bệnh từ đời mẹ sang đời con, muỗi Culex

tritaeniorhyncus sinh sản phát triển nhiều nhất ở đồng ruộng, nó đốt chim, gia

súc và người Muỗi Culex đốt truyền vào ban đêm Tỷ lệ nhiễm ở muỗi vào

khoảng 1-3% [21] Loài muỗi này sống chủ yếu ở đồng ruộng lúa nước nhưng có thể di chuyển vào vùng dân cư sinh sống gần đó Các ca bệnh thường là ở vùng ngoại ô thành phố [21], [45], [52]

Ở Việt Nam có hai nhóm chim có khả năng truyền bệnh:

- Nhóm chim sống trong làng mạc, lũy tre, ở các loài cây ăn quả như: chim bông lau, chim rẻ quạt, chim sẻ nhà, chim liếu điếu, chim chích chòe

- Nhóm chim ăn ngoài đồng: cò, sáo, quạ, cu gáy, chèo bẻo

Có một số loài súc vật khác bị nhiễm trùng tiềm tàng như gà, dê, bò, ngựa, lợn và loài bò sát (rắn, rùa)

Ở nước ta loài muỗi này có nhiều ở miền Bắc vào các tháng nóng Ban ngày sống trong các bụi cây ngoài vườn, ban đêm bay vào nhà cắn hút máu gia súc và người, chúng thích đẻ trứng trong ruộng lúa và mương máng Lợn tham gia dây truyền bệnh thường ở dưới dạng nhiễm trùng thể ẩn [3]

1.1.3 Đặc điểm biểu hiện của bệnh:

Triệu chứng của bệnh thường là sốt, đau người, mệt mỏi, đặc biệt là viêm não ở người lớn Ở trẻ em có thể gây đau dạ dày, ruột và rối loạn tinh thần, ngủ gà ngay ở giai đoạn đầu, lên cơn co giật Bệnh nặng có thể dẫn đến hôn mê và có thể không hồi phục lại được Một số trường hợp tiến triển bệnh

viêm màng não rất nhanh, chỉ trong phút chốc Hầu hết các trường hợp đều để lại những di chứng hết sức nặng nề Hầu hết di chứng để lại ở trẻ dưới 10 tuổi Thời kỳ ủ bệnh 5-16 ngày Sau đó, khởi bệnh ồ ạt bằng các triệu chứng sốt cao đột ngột, đau đầu, đau cơ, buồn nôn, nôn Tiếp đến là rối loạn ý thức xuất hiện các dấu hiệu như lú lẫn, mê sảng, hôn mê Rối loạn vận động như trương lực cơ tăng, chân tay co cứng, cứng gáy, cử động bất thường, có các cơn co giật Nặng hơn là liệt nửa người hoặc liệt toàn thân Bệnh để lại di chứng liệt vận động hoặc rối loạn tinh thần [2]

1.2 Virut viêm não Nhật Bản (virut VNNB)

1.2.1 Đặc điểm hình thái và tính chất lý hoá của virut VNNB

Virut VNNB nằm trong nhóm virut Arbo (arthropod borne viruses) Hệ gen của virut Arbo thường là ARN, hầu hết chúng đều có vỏ lipit và bị bất hoạt bởi ether hoặc sodium deoxycholate [4] [7] Nhóm virut Arbo có trên 350 loài, trong đó Arbo gây bệnh cho người có trên 75 loài Nhiều virut Arbo được xếp vào họ Togaviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae Họ Togaviridae được chia thành 2 chi là Alphavirus thuộc nhóm A và họ Flaviviridae thuộc nhóm B trong đó virut VNNB thuộc họ Flaviviridae [2] Virut VNNB có đường kính trung bình 40-50nm, dạng hình cầu Màng lipid kép của virut gắn vào lớp vỏ là glycoprotein E và protein màng M Sợi ARN làm vật liệu di truyền được bao bọc bởi nucleocapsid Hệ gen của virut VNNB mã hóa cho 10 protein gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc trong một khung đọc mở liên tục và trật tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ và các vùng không mã hóa [31] Hạt virut VNNB tinh khiết cho thấy sợi ARN chiếm 6%, protein 66%, lipid 17% và carbonhydrate chiếm 9%, cấu trúc của lớp lipid kép phụ thuộc vào tế bào chủ, nơi virut nhân lên [41] [48]

Virut VNNB có hệ số lắng 200S Trọng lượng phân tử 60-70 x 106 dalton Độ bền vững thích hợp nhất là pH 8 Virut dễ bị bất hoạt bởi nhiệt độ

cao: 50oC trong 50 phút, 37oC trong vài giờ Nhiệt độ thấp như -80o

C, -20oC virut tồn tại trong nhiều năm và trong nitơ lỏng (-196oC) virut tồn tại vĩnh cửu Virut VNNB rất nhạy với dung môi hòa tan như ether, sodium deoxycholate, dễ dàng bị bất hoạt bởi tia cực tím, formaldehyt [1]

1.2.2 Sự nhân bản của virut

Trên màng tế bào thường có những thụ thể, khi virut xuất hiện sẽ nhận biết và tiến đến bám vào thụ thể Màng tế bào bao bọc hạt virut và đưa virut vào trong nội bào Màng tế bào bị tác động và tạo khe hở cho virut thâm nhập vào bên trong tế bào gây cảm ứng tổng hợp ARN [9] [33] [38] Bước vào quá trình cởi áo, sợi ARN được bộc lộ là sợi ARN đơn để tạo thành ARN phân cực (-) bổ sung thành chuỗi ARN kép nhờ phiên mã sớm và thông tin trung gian sao chép sợi ARN kép được làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN mới theo cách bán bảo tồn và không đối xứng Protein cũng được tổng hợp liên tiếp thành các đoạn protein cấu trúc và không cấu trúc [44] ARN và protein của virut được tổng hợp trên lưới nội chất có hạt, vùng quanh nhân trong nguyên sinh chất của tế bào chủ Sản phẩm tổng hợp được lắp ráp ở màng tế bào chất tạo ra các hạt virion Các hạt virion được giải phóng qua bộ máy Golgi bằng ngoại bào xuất tiết và các virut mới tiếp tục xâm nhập vào tế bào khác [14] [15] [16]

Virut VNNB nhân lên trên nhiều loại tế bào cả ở trên tế bào tiên phát và tế bào thường trực có nguồn gốc từ người, khỉ, gặm nhấm, lợn, chim, gia cầm và muỗi [6] [7] [12] Virut nhân lên gây hủy hoại tế bào (CPE) nhưng cũng có một số loại tế bào quan sát dưới kính hiển vi quang học, không thấy hiện tượng CPE [33]

1.2.3 Cấu trúc của virut VNNB

Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc các protein được mã hoá bởi hệ gen của virut VNNB

Hệ gen của virut VNNB mã hoá cho các protein khác nhau, các protein này được chia thành hai nhóm chính là protein cấu trúc và protein phi cấu trúc Nhóm protein cấu trúc chiếm ¼ chiều dài hệ gen bao gồm: protein lõi C, protein tiền màng (preM) và protein màng Các protein không cấu trúc là phần còn lại của hệ gen Đầu 3’ sợi ARN của virut VNNB không chứa đuôi polyA nhưng được coi là làm khuôn mẫu cho các cấu trúc tiếp theo Từ đầu 5’ các gen được mã hóa cho protein C của ARN [39] [49]

Nhóm protein cấu trúc bao gồm: a) Protein C

Protein C rất vững chắc, chứa khoảng 127 axit amin, trong đó thành phần bao gồm một số lớn axit amin Lys và Arg Protein C có các axit amin liên kết với nhau rất chặt chẽ, có thể loại trừ khả năng trung hòa của phân tử ARN của virut với các tác nhân liên quan [31] [38]

b) Protein M

Phía ngoài tế bào của virut trưởng thành có chứa protein M Protein M có chứa dạng protein preM chưa trưởng thành trong tế bào chủ và preM có tới 165 axit amin không trùng lặp với protein E Từ đó đã có một số nghiên cứu sản xuất văcxin VNNB tái tổ hợp sử dụng protein E để tổng hợp preM của

virut với mục đích tạo các nếp gấp chính xác tại protein M và lắp ráp vào protein E của 1 flavivirus nào đó Trước khi virut được giải phóng ra ngoài tế bào,preM được phân cắt bởi một phân tử protease để tạo thành protein M hoàn chỉnh [38] [43] [53] Sự sắp xếp lại các cấu trúc oligo trên bề mặt hạt virut do sự ly giải preM ra ngoài tế bào làm tăng khả năng gây nhiễm của virut trưởng thành tới vật chủ [18] [30]

c) Protein E

Protein E là một glycoprotein Protein E bao gồm khoảng 494-501 axit amin có trọng lượng phân tử 55-60KDa và là thành phần cấu tạo chính của vỏ (E) Các chuỗi axit amin tương đồng cho thấy protein E là một protein cấu trúc có tính bảo tồn cao trong các virut thuộc nhóm flavivirus Protein E có liên quan chặt chẽ đến chức năng sinh học của virut như chức năng bám dính, thụ cảm thể, ngưng kết hồng cầu, trung hòa kháng thể, điều chỉnh pH nội nguyên sinh chất của tế bào chủ [35] [37]

So sánh cấu trúc protein E của JEV với cấu trúc có trình tự axit amin tương đồng khác cho thấy protein E là một protein cấu trúc có tính bảo thủ cao, Nhờ đặc điểm tương đồng của các protein vỏ trong chi flavivirus người ta đã xác định cấu trúc không gian của JEV dựa trên cơ sở cấu trúc không gian của TBE (tick-bome encephalitis) và phương pháp xây dựng mô hình với kiến thức đã biết Kolaskar và Kulkami-Kale năm 1999 và năm 2002 đã đưa ra mô hình cấu trúc không gian protein E của JEV là một homodimer gồm: khoảng 30 chuỗi ( có thể ít hơn hoặc nhiều hơn tùy thuộc vào chủng) chia làm 9 phiến β (8 phiến đối song song và một phiến có cấu truc hình học topo), hai xoắn α và ba domain [1]

Các chuỗi không ở vị trí cố định trong không gian mà thường trôi và chuyển động trong không gian nhờ một số axit amin Cấu trúc không gian của protein E được duy trì bởi 6 cấu trúc disulfide bảo thủ Một liên kết disulfide

trong đó có vai trò trong việc duy trì cấu trúc mà gấp nếp giống như protein lõi kháng trypsin Domain I là một trung tâm thùng AY ( AY- barrel) gồm 128 axit amin từ vị trí 1- 51, 137-196 và 293-311 Domain II là vùng nhị trùng hoá kéo dài gồm 71 axit amin từ vị trí 52-136 và 197-192 Domain III có phân tử giống Ig đầu C gồm 100 axit amin từ vị trí 312-411 Dựa vào cấu trúc không gian của protein E của TBE cho thấy phiến ABED của domain III nối với domain I và vùng thong lọng cd (loop-cd) của domain III Cấu trúc không gian protein E của một số chủng khác nhau có một số sai khác giữa các chủng về số lượng chuỗi, số lượng phiến và số lượng axit amin trong mỗi chuỗi biến đổi mặc dù điểm bắt đầu và kết thúc vẫn khớp nhau Chủng JEV Sri Lanka có thêm 6 chuỗi ngắn và hai phiến nhỏ so với chủng JEV NakaYama nhưng có một chuỗi chỉ có ở chủng JEV Nakayama Một phiến nằm trên domain II tạo 2 sợi từ axit amin 335-336 và 360-361 Protein E có liên quan chặt chẽ đến chức năng sinh học của virut như chức năng bám dính, thụ cảm thể, ngưng kết hồng cầu, trung hoà kháng thể, điều chỉnh pH nội nguyên sinh chất của tế bào [1]

1.2.4 Khả năng gây đáp ứng miễn dịch của đoạn peptit kháng nguyên 27 axit amin của virut VNNB

Với mỗi loại kháng nguyên khác nhau thì có thể sinh ra các kháng thể tương ứng để trung hoà kháng nguyên hoặc không sinh ra kháng thể nào Với virut thì những kháng nguyên này thường nằm ngay trên bề mặt hạt virut Trong virut VNNB thì kháng nguyên ngưng kết hồng cầu và hoạt tính trung hòa là preM và E [8] [28] [32] [40] Hai thành phần preM và E có khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch với hạt virut nguyên vẹn Điều này được thể hiện bởi thí nghiệm của Kitano và Suzuki bằng cách tách chiết ngưng kết tố hồng cầu trên bề mặt hạt virut VNNB rồi gây miễn dịch cho chuột nhắt trắng Kết

quả là kháng thể trung hòa ở chuột được gây miễn dịch với hạt virut VNNB nguyên vẹn

Có nhiều nghiên cứu cho thấy glycoprotein E đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây ra đáp ứng miễn dịch Protein E khi bị cắt đầu C không những vẫn có khả năng gây đáp ứng miễn dịch mà còn bảo vệ cơ thể vật chủ tốt hơn so với protein E hoàn chỉnh

Trên protein E có chứa một đoạn 27 axit amin (từ axit amin 373 đến 399) Theo những nghiên cứu cho thấy đoạn 27 axit amin này có thể kéo dài và tăng cường khả năng tạo ra kháng thể trung hoà chống lại virut VNNB.

Hình 1.2: Sơ đồ vị trí đoạn 27 axit amin trên protein E

Một nghiên cứu gần đây của một nhóm tác giả người Trung Quốc đã tiến hành khi gắn nối đoạn gen mã hoá cho đoạn 27 axit amin này với protein sốc

nhiệt Hsp70 Sau đó biểu hiện trong E.Coli đoạn 27 axit amin riêng lẻ và đoạn

27 axit amin đã gắn với Hsp70, protein biểu hiện được thu lại và tiêm vào chuột Kết quả cho thấy khả năng sinh kháng thể của đoạn 27 axit amin khi gắn với Hsp70 cao hơn so với đoạn peptit 27 axit amin riêng rẽ [10]

Hình 1.3 so sánh về khả năng sản sinh ra các tế bào lympho từ chuột được gây miễn dịch bởi các peptit 27 aa có hoặc không có dầu khoáng, peptit 27 aa dung hợp với hsp70 và JEV SA14-14-2

27aa

Protein E

Peptit 27 aa dung hợp với hsp70 tổng hợp có giá trị OD 570 cao nhất, trong khi sự có mặt của dầu khoáng không có hiệu quả đặc biệt Không có sự khác biệt lớn giữa xử lý văcxin JEV SA 14-14-2 với kiểm soát không miễn dịch [10]

Mặt khác tính miễn dịch của chuột bởi đoạn 27 aa với hsp70 cũng được thể hiện bằng khả năng sản sinh ra lượng IFN-γ (hình 1.4)

Nồng độ IFN-γ được tạo ra cao hơn hẳn so với ở các đối tượng kháng nguyên khác cho thấy việc gắn kết giữa đoạn peptit 27 aa với hsp70 đã làm gia tăng khả năng gây đáp ứng miễn dịch [10] Điều này suy ra rằng cũng có

Hình 1.4 Khả năng sản sinh ra IFN-γ và IL-4

1: Peptit 27 aa riêng lẻ 2: Peptit 27 aa có dầu khoáng

3: Peptit 27 aa dung hợp với hsp70

4: JEV SA14-14-2 5: Không miễn dịch 1 2 3 4 5

1: Peptit 27 aa riêng lẻ 2: Peptit 27 aa có dầu khoáng

3: Peptit 27 aa dung hợp với hsp70

4: JEV SA14-14-2 5: Không miễn dịch

Hình 1.3 Khả năng sinh ra tế bào lympho từ các kháng nguyên khác nhau

thể gắn kết đoạn peptit 27 aa này với một gen nào đó có ưu điểm như hsp70 cũng sẽ hứa hẹn mang lại hiệu quả đáp ứng miễn dịch cao

1.3 Các loại văcxin phòng bệnh VNNB

Từ những năm 1935 cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu sản xuất văcxin VNNB Theo thời gian thì công nghệ sản xuất văcxin cũng dần nâng cao và đảm bảo sản xuất ra những loại văcxin tốt nhất Tuy nhiên không thể nói rằng những văcxin đó không có những nhược điểm Với mỗi loại văcxin khác nhau thì có những ưu nhược điểm khác nhau

Hiện tại có 3 loại văcxin đang được lưu hành là: Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuột, văcxin bất hoạt trên nuôi cấy tế bào, văcxin sống giảm độc lực trên nuôi cấy tế bào

1.3.1 Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuột

Những năm 1940 khi bắt đầu nghiên cứu sản xuất văcxin này ở dạng thô, văcxin này chứa toàn bộ protein não chuột và hàm lượng Myelin rất cao do đó tỷ lệ gây viêm não dị ứng cũng cao Ngày nay công nghệ tinh chế hiện đại hơn đã làm giảm tối đa protein Myelin (<2ng/ml) và 2 chủng virut VNNB dùng để sử dụng sản xuất văcxin này là Nakayama và Beijing-1 Loại văcxin bất hoạt này được sản xuất ở một số nước Châu Á và được lưu hành rộng dãi trên thế giới [11]

1.3.2 Văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ tế bào

Chủng virut VNNB P3 có khả năng đáp ứng kháng thể với nhiều chủng virut viêm não khác trên chuột và nhân lên rất tốt trên tế bào thận tiên phát ở chuột Văcxin được bất hoạt bằng formalin và hiệu quả gây miễn dịch cho trẻ em đạt 80% đáp ứng kháng thể

1.3.3 Văcxin sống giảm độc lực

Chủng SA14-14-2 là chủng giảm độc lực và không gây ảnh hưởng thần kinh Qua thử nghiệm tại 1 vùng không lưu hành dịch ở Trung Quốc cho thấy

có tới hơn 83% đáp ứng kháng thể ở trẻ em 6-7 tuổi Trẻ lớn hơn tiêm 2 liều cách nhau 1-3 tháng đạt 94-100% có đáp ứng miễn dịch Phản ứng phụ của văcxin là rất ít gặp phải [19] [51]

1.3.4 Nghiên cứu phát triển văcxin mới

Hiện nay có nhiều nghiên cứu và phát triển theo hướng công nghệ văcxin tái tổ hợp Dựa trên những hiểu biết chi tiết về vai trò và cấu trúc của glycoprotein E và preM/M nên nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và tìm ra nhiều loại văcxin thế hệ mới như: văcxin protein, văcxin dựa trên virut tái tổ hợp, văcxin DNA…

Và gần đây văcxin thực vật là một hướng đi mới mang nhiều hứa hẹn cho một loại văcxin với nhiều ưu điểm nổi bật:

a) Có tính ổn định cao:

Vì các kháng nguyên biểu hiện được sản xuất và bao bọc bởi các mô thực vật nên chúng có thể ổn định ngay ở nhiệt độ phòng Những kháng nguyên này được định vị ở trong lưới nội chất, thể golgi hay bề mặt tế bào, đây là những vị trí lý tưởng cho các việc biểu hiện kháng nguyên

b) Có thể dễ dàng tăng quy mô sản xuất và dễ thu sinh khối, chẳng hạn ta có thể mở rộng diện tích trồng cây chuyển gen để tăng sản lượng

c) Dễ dàng sử dụng và bảo quản:

Văcxin thực vật không cẩn giữ lạnh như các văcxin tiêm khác Thông thường, ngay sau khi tinh sạch, văcxin tiêm được đông khô và vận chuyển từ nơi sản xuất đến nơi tiêu thụ thông qua một hệ thống bảo quản lạnh ở quy mô quốc tế, quốc gia và khu vực hết sức phức tạp và tốn kém Nhưng nếu sản xuất văcxin ăn được, người ta chỉ cần vận chuyển và sử dụng ngay bộ phận thực vật chứa văcxin đó

c) Ăn được:

Vì văcxin thực vật nằm trong những bộ phận của thực vật như lá, quả…Do vậy ta có thể ăn được một cách dễ dàng Nếu văcxin dùng qua đường miệng mà ở dạng được bao gói nó sẽ dễ dàng bị dịch tiêu hoá của đường ruột phân huỷ Văcxin này có thể ăn tươi (quả, lá) hoặc nấu chín (hạt, củ) Xử lý nhiệt có tính khả thi khi kháng nguyên không biến tính ở nhiệt độ cao, ví dụ nấu chín khoai tây chứa văcxin trong 3 phút làm giảm 50% thành phần văcxin đó

d) An toàn cho người và động vật:

Văcxin dưới đơn vị sử dụng gen mã hoá cho một phần protein vỏ virut mà không cần đến virut sống như văcxin giảm độc lực hay virut chết như văcxin bất hoạt Do đó, văcxin này không trở lại thành virut gây bệnh cho người và động vật, đồng thời nó cũng tránh được nguy cơ nhiễm mầm bệnh tiềm tàng từ văcxin như hệ thống động vật có vú Nhiều sinh vật gây bệnh chưa biết ở động vật không thể phát hiện được trong dịch nuôi cấy dễ dàng truyền cho người và động vật, trong khi các bệnh thực vật không lây nhiễm được như vậy Do đó, không cần phải tách chiết và tinh sạch kháng nguyên văcxin

e) Kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống thể dịch hiệu quả hơn văcxin tiêm Các vi sinh vật gây bệnh đều xâm nhập vào cơ thể qua bề mặt nhầy trong đường tiêu hoá, hô hấp và đường tiết niệu Những con đường này đều thuộc hệ thống miễn dịch thể dịch, nơi tập trung những mô có khả năng đáp ứng miễn dịch lớn nhất của cơ thể và là hàng rào bảo vệ đầu tiên chống lại những vi sinh vật đó Đây cũng chính là vị trí tác động hiệu quả nhất của các văcxin ăn được từ thực vật

Hình 1.5: Khả năng gây đáp ứng miễn dịch của văcxin thực vật

Khi văcxin này vào cơ thể qua đường miệng sẽ cảm ứng hệ thống miễn dịch thể dịch sản xuất các kháng thể chống lại sinh vật gây bệnh, tiếp đó hệ thống thể dịch lại tác động vào hệ thống miễn dịch tế bào, tạo ra các globulin miễn dịch, tăng cường khả năng bảo vệ sớm và hiệu quả cho cơ thể Khi tiêu hoá văcxin ăn được, kháng nguyên được giải phóng trong ruột non [1]

Việc sản xuất văcxin ăn được xem là hệ thống sản xuất văcxin lý tưởng đơn giản và giá thành thấp Nhiều thành công khác về văcxin thực vật cũng đựoc công bố trên nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá, rau diếp, cà chua, khoai tây…Số lượng nghiên cứu về văcxin ăn được đựơc gia tăng đã chứng tỏ tính ưu việt của thực vật như một hệ thống biểu hiện hiệu quả cao, chi phí sản xuất thấp, an toàn về mặt sinh học, sử dụng và bảo quản dể dàng không cần giữ lạnh

1.4 Gen LTB (labile enterotoxin-B)

Nói tới văcxin thực vật thì không thể không nói tới một gen quan trọng thích hợp với việc biểu hiện protein và có khả năng kích thích sinh miễn dịch

trong thực vật, đó là gen LTB Gen LTB là tiểu đơn vị liên kết nội độc tố

không bền nhiệt của E.Coli một loại vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ở nhiều

quốc gia đang phát triển do hệ thống y tế cộng đồng còn thô sơ, điều kiện vệ sinh kém, nguồn nước uống chưa đảm bảo

Cấu trúc của LT bao gồm 1 tiểu đơn vị A (LTA) và 5 tiểu đơn vị B (LTB) tạo thành một pentamer dạng vòng LTB là một chất có khả năng sinh miễn dịch ở niêm mạc ruột và một số nghiên cứu trên động vật mô hình và một thử nghiệm trên người cho thấy LTB tái tổ hợp có thể kích thích các đáp ứng miễn dịch niêm mạc Vì thế, LTB là một ứng viên kháng nguyên đầy hứa hẹn trong sản xuất văcxin thực vật Bên cạnh đó, LTB còn đề kháng tốt với sự thủy phân protein ở dạ dày và duy trì được một cấu trúc bậc 4 pentamer của nó trong môi trường pH thấp bằng 2.0 Đây là bằng chứng bổ sung cho LTB như là một ứng viên kháng nguyên được dùng cho văcxin sản xuất trong thực vật [22] [23] [24]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Giống thuốc lá SNN (Nicotiana tabaccum L.) do Viện Nghiên cứu Di truyền

thực vật IPK, Gatersleben (CHLB Đức) cung cấp, được trồng trong điều kiện tự nhiên

2.1.2 Vật liệu sinh học phân tử 2.1.2.1 Mồi

xuất

Dùng để tổng hợp đoạn gen 27aa

Carbe

Tách dòng và đọc trình tự Phòng CNTBTV, Viện CNSH, Việt

Nam pTRA Amp Cung cấp đoạn biểu hiện

cmyc và KDEL trong cây

Gatersleben, Đức

pCB301 Kana Cung cấp promoter 35S và terminator thích hợp cho chuyển gen thực vật

Viện CNSH, Việt Nam

Bảng 2: Các loại plasmid dùng trong thí nghiệm

2.1.2.3 Các chủng vi sinh vật và các nguyên liệu dùng trong thí nghiệm

- E.Coli DH5α [end A1 recA1 hsdR17 supE44gypA96 thi-1relA1lac

U169(Ø80 lacZM15)] được sử dụng trong các thí nghiệm nhân dòng các plasmid

- E.Coli BL21 [E omp hsd SB(rBmB)gal dcm (DE3) plysS(Caml)] sử dụng

cho nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp

- Chủng A Tumefaciens CV58C1 mang plasmid pGV 2260 được sử dụng làm

trung gian truyền các cấu trúc chuyển gen vào thực vật

2.1.2.4 Các loại máy móc

Các loại máy sử dụng tại phòng Công nghệ tế bào Thực vật và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen (Viện Công nghệ Sinh học) bao gồm: