Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2 Phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc (colony PCR)
Phương pháp colony PCR cho phép phát hiện nhanh khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp mong muốn. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc PCR, chỉ khác là mẫu DNA được thay bằng plasmid giải phóng từ khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao (94o
C-95oC), màng tế bào bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid này sẽ làm khuôn tổng hợp cho phản ứng PCR. Tuy nhiên phương pháp này có đôi chút hạn chế là có trường hợp sản phẩm biến nạp còn dính một lượng nhỏ plasmid tái tổ hợp, sẽ làm cho kết quả không còn chính xác như mong đợi.
2.2.3 Thiết kế vector pET21_27aa_LTB biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong E.coli nguyên trong E.coli
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector pET21_27aa_LTB biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong E.coli
pET21(a+)
Lai
Biến nạp 27aa_LTB/BamHI/NotI
BamHI
NotI
pET21(a+)_ 27aa_LTB
Sản phẩm PCR nối 2 đoạn 27aa và LTB là 27aa_LTB được dòng hóa trong vector pBT. Các dòng plasmid tái tổ hợp pBT_27aa_LTB được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn BamHI. Dòng dương tính được xác định trình tự DNA và so sánh với trình tự đã có bằng phương pháp MegAlign ClusterW (DNAStar). Tiếp đó, vector tách dòng pBT mang đoạn 27aa_LTB được cắt bằng enzyme BamHI và NotI để thu lấy đoạn gen mong muốn, sau đó gắn vào vector pET21a (+) đã được xử lí cùng enzyme. Sản phẩm gắn kết được biến nạp vào chủng E.coli DH5α, chọn các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pET21_27aa_LTB bằng phương pháp cắt enzyme giới hạn BamHI và NotI.
2.2.4. Biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong E.coli
Vector pET21_27aa_LTB được biến nạp vào tế bào biểu hiện E.Coli
BL21 để tiến hành kiểm tra khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp. Sau khi nuôi cấy một khuẩn lạc E.coli BL21 mang vector tái tổ hợp qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung 50mg/l Amp tại nhiệt độ 37oC, dịch huyền phù được chuyển sang môi trường mới với tỉ lệ 1/20. Nuôi cấy tế bào biểu hiện ở nhiệt độ 37oC cho tới khi dịch huyền phù có OD600nm ~0,4-0,5 thì tiến hành cảm ứng. Nhiệt độ biểu hiện protein tái tổ hợp vẫn tương tự như nhiệt độ nuôi cấy. Chất cảm ứng với hệ biểu hiện pET21a (+) là IPTG với nồng độ cuối cùng là 1mM. Sản phẩm biểu hiện được thu mỗi giờ từ trong vòng 4h. Kết quả của sản phẩm được kiểm tra bằng điện di trên gel SDS- polyacrylamide 12,5%.