Độ lớn của hai đoạn cmyc và KDEL khi gắn với đoạn gen 27aa_LTB có kích thước 1100bp. Trên hình 3.10 các dòng plasmid ở giếng số 2, 3 đều có hai băng, một băng 2600 và một băng 1100bp, đây là dòng plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn gen 27aa_LTB. Điều này cho thấy đã gắn được đoạn 27aa_LTB vào vector pTRA. Đồng nghĩa với việc đoạn 27aa_LTB được gắn thêm đoạn cmyc_KDEL trong cấu trúc vector biểu hiện đang thiết kế. Plasmid dòng số 2 mang gen biểu hiện 27aa_LTB được nuôi lượng lớn để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.5.2 Lai đoạn 27aa_LTB_cmyc_KDEL với vector chuyển gen pCB301
Trong vector pCB301 có chứa promoter 35S CaMV, đây là loại promoter mạnh, thích hợp để biểu hiện gen ngoại lai trong thực vật. Vì vậy chúng tôi chọn promoter này để phục vụ cho biểu hiện gen trong cây thuốc lá. Sơ đồ cấu trúc vector biểu hiện đầy đủ được thể hiện trên hình 3.11A.
Để tạo vector nhị thể có khả năng biểu hiện trong tế bào thực vật, đoạn 27aa_LTB_cmyc_KDEL được cắt từ vector pTRA bằng HindIII và lai với vector pCB301 cũng được cắt bằng HindIII có khử photphatase hai đầu cắt
C
~1100 bp ~2600 bp
nhằm hạn chế khả năng gắn trở lại của vector sau cắt. Sau khi được nhân lên trong E.coli DH5α, plasmid của các dòng khuẩn lạc sống sót trên môi trường chọn lọc được cắt bằng HindIII. Theo như tính toán trên lý thuyết thì vector tái tổ hợp pCB_27aa_LTB mang cấu trúc biểu hiện cmyc và KDEL sau khi cắt bằng HindIII sẽ tạo ra hai băng có kích thước lần lượt là 5400bp và 1100bp tương ứng với kích thước của vector pCB và đoạn gen được gắn vào vector đã được gắn với cmyc và KDEL.
Trên hình 3.11B là kết quả điện di sản phẩm cắt vector pCB_27aa_LTB bằng HindIII. Nhận thấy tại giếng số 1 và số 2 đều có hai băng với kích thước 5400bp và 1100bp, điều này thể hiện đúng với những tính toán trên lý thuyết.
Hình 3.9. Điệndi sản phẩm cắt plasmid pCB_27aa_LTB bằng HindIII A: Sơ đồ cấu trúc biểu hiện đoạn 27aa_LTB trong tế bào thực vật